JPH09110899A - 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 無障害のヒト副甲状腺ホルモンを安定に生産
する微生物は報告されてきていないこと。更に、副甲状
腺ホルモンは酵母からも単離されてきていないこと。 【解決手段】 ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコード
するＤＮＡを持つ大腸菌挿入用の新しいプラスミドが作
成された。このプラスミドは大腸菌に挿入されると大腸
菌を形質転換させ、マルチコピーのプラスミド、つまり
ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンのcＤＮＡを複製させる
ものとして機能する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はプレプロヒト副甲状
腺ホルモンをコードするＤＮＡを持つ、遺伝子工学的操
作を加えた微生物に関するものである。哺乳類細胞によ
って正常に合成される数々の蛋白質やペプチドは、医
学、農業、工業上有用であることが証明されてきた。こ
れらの蛋白質やペプチドは異なる分子サイズでもあり、
例えば酵素や構造蛋白質、成長因子、ホルモンなどのよ
うにいくつかの異なる機能を有している。

【０００２】

【従来の技術】本質的に、蛋白質、ペプチド共に、アミ
ノ酸の一次配列により構成されており、２次構造、３次
構造を形成して生物学的活性を発現する。

【０００３】ヒト副甲状腺ホルモンは比較的小分子量で
あり、アミノ酸を順次付加することによって、化学的に
このペプチドを合成することが可能である。

【０００４】故に副甲状腺ホルモンは商業的に利用可能
ではあるが、ごく少量で高価である。結果的に多くの潜
在的、医学、農業、工業面の応用に供するのに適当な利
用可能なヒト副甲状腺ホルモンは存在しない。

【０００５】過去１０年間、組み換えＤＮＡを用いた微
生物学的技術は異種のペプチドの生産に微生物を利用す
る事を可能にしてきた。微生物は急速かつ、大量の成長
が可能であり、細菌のペプチドと同様の方法で、外来性
の産生物を合成できる。この分子生物学的アプローチの
有効性と可能性は既に医学或いは他の使用目的に今や多
用可能な数々のヒト蛋白質の微生物による生産によって
証明されてきた。

【０００６】副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は哺乳類のカ
ルシウム代謝の最も重要なレキュレーターの１つであ
り、ヒトや動物のミルク熱急性低カルシウム症の他に、
病理的血中カルシウムレベル変化といった、いくつかの
病気にも関連している。それ故にこのホルモンは、診断
キットの一部としても重要であり、ヒトや家畜の医療に
おいても治療に潜在的可能性を有している。

【０００７】ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンＤＮＡの最
初の合成はヘンドリー（Ｈｅｎｄｒｙ）Ｇ．Ｎ，Ｋｒｏ
ｎｅｂｅｒｇ．Ｈ．Ｍ．，Ｐｏｔｔｓ．Ｊｒ．Ｊ．Ｔ．
Ｒｉｃｈ Ａらによって報告された。（７８ Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７３６５−７３６
９，１９８１）。またヘンドリーらによってＰＴＨ．ｍ
ＲＮＡ配列の相補ＤＮＡが合成され、２本鎖に合成され
た（前出）。このｃＤＮＡは、ｐＢＲ３２２ＤＮＡにク
ローニングされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１７７６にト
ランスフェクトされた。選択された抗生物質に耐性のコ
ロニーのうち、２００コロニー中２３コロニーが、特異
的ヒトＰＴＨｃＤＮＡの挿入を持っていることが同定さ
れた。しかしながら２３個のヒトＰＴＨコロニーのう
ち、全長にわたって挿入されているものはなかった（ヘ
ンドリーら、前出）。後にブレイエル（Ｂｒｅｙｅ
ｌ）．Ｅ， Ｍｏｒｅｌｌｅ．Ｇ． Ａｕｆ’ｍｔｏｌ
ｋ．Ｂ， Ｆｒａｎｋ．Ｒ． Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｈ．
Ｍａｙｅｒ．Ｈ．らは、シャロン４Ａファージで構成さ
れた胎児肝、ジェノミックＤＮＡライブラリーにヒトＰ
ＴＨ遺伝子があることを報告した（第３回欧州バイオテ
クノロジー会議、１９８４．９月１０−１４．ｖｏｌ．
３．３６３−３６９）。ＰＴＨ遺伝子の制限酵素断片が
再クローン化され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にトランス
フェクトされた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかし、ブレイエルら
の研究により（前出）、Ｅ．ｃｏｌｉはヒトＰＴＨを分
解することがわかった。故に、これまでのところ、無障
害のヒト副甲状腺ホルモンを安定に生産する微生物は報
告されてきていない。更に、副甲状腺ホルモンは酵母か
らも単離されてきていない。

【０００９】したがって、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモ
ン（ＨＰＴＨ）をコードするＤＮＡを持つ大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）挿入用のプラスミドの開発が本発明の目的で
ある。また、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコードす
るＤＮＡを持つ大腸菌を遺伝子工学的に作成する事が本
発明のもう一つの目的である。

【００１０】更に、本発明の目的は、酵母挿入用の副甲
状腺ホルモンをコードするＤＮＡを持つプラスミドの開
発である。また、ヒト副甲状腺ホルモンを含めて、副甲
状腺ホルモンをコードするＤＮＡを持つ、形質転換酵母
を作成し、その形質転換酵母から、副甲状腺ホルモンを
得ることが、本発明の目的である。

【００１１】本発明の他の目的や、利用法は、後述され
るところによって明らかとなるであろう。

【００１２】

【課題を解決するための手段】前述の目的を達成する為
に、本発明によってヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコ
ードするＤＮＡを持つ大腸菌挿入用の新しいプラスミド
が作成された。このプラスミドは大腸菌に挿入されると
大腸菌を形質転換させ、マルチコピーのプラスミド、つ
まりヒトプレプロ副甲状腺ホルモンの_CＤＮＡを複製さ
せるものとして機能する。本発明による大腸菌挿入用の
プラスミドと形質転換大腸菌は、例えば、ヘンドリーら
によって報告されているように、本発明のプラスミド
は、プレプロ副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡの
５’末端に２重の開始コドンを含んでいる点で、今まで
の人工プラスミドや微生物と区別できる。この２重の開
始コドンの存在により、この_CＤＮＡを持つプラスミド
で微生物を形質転換させた時、プレプロ副甲状腺ホルモ
ンを従来技術の形質転換微生物よりも高効率、高収量で
生産するような生産微生物が得られたのであろう。

【００１３】更に、本発明によって副甲状腺ホルモンを
コードするＤＮＡを持った酵母挿入用のプラスミドが作
成された。より具体的にはこのプラスミドは前述の、大
腸菌への挿入用のプラスミドをクローン化することによ
って開発された。最終的には、本発明により、前述の酵
母への挿入用プラスミドによって副甲状腺ホルモンを生
産分泌するような形質転換酵母が得られた。即ち、本発
明は、酵母培地から、副甲状腺ホルモンを単離できるよ
うな方法を開発したのである。

【００１４】より具体的には、この形質転換酵母は、サ
ッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。また、副甲状
腺ホルモンは、ヒト副甲状腺ホルモンである。ブタペス
ト条約の規定により、ｐＳＳＨＰＴＨ−１０とその形質
転換大腸菌、ｐＳＳαＬＸ２−ＨＰＴＨ Ｉ とその形質
転換サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、１９８６年
９月２９日、メリーランド州のアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に供託され
た。これらのサンプルは、以下の寄託番号を付与されて
いる。

【００１５】 ｐＳＳＨＰＴＨ−１０を持つ、形質転換大腸菌 ＡＴＣＣ ６７２２３ ｐＳＳＨＰＴＨ−１０ ＡＴＣＣ ４０２６７ ｐＳＳαＬＸＳ−ＨＰＴＨ １を持つ形質転換 サッカロマイセス・セレビシアエ ＡＴＣＣ ２０８２１ ｐＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ １ ＡＴＣＣ ４０２６６

【００１６】

【図面の説明】図１にヒトプレプロ副甲状腺ホルモンを
コードするＤＮＡ塩基配列の可能な全てのバリエーショ
ンを示してある。図２にクローンｐＳＳＨＰＴＨ−１０
のヒトプレプロ副甲状腺ホルモンＤＮＡに特異的なコー
ド配列を示してある。図３に本発明のプラスミドに存在
すると考えられるヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコー
ドし、５’末端に２重のスタートコドンを持つ、可能な
全てのＤＮＡ配列をその近接領域と共に示している。図
４はクローンｐＳＳＨＰＴＨ−１０の特異的ヒトプレプ
ロ副甲状腺ホルモンＤＮＡ配列をその近接配列と共に示
してある。図５はクローンｐＳＳＨＰＴＨ−１０のＤＮ
Ａ配列にコードされる、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモン
の実際のアミノ酸配列を示している。図６は組み換えプ
ラスミドｐＳＳＨＰＴＨ−１０の構成を示している。図
７はｐＡＬＸ４の制限地図を示している。図８はｐＬ４
とｐＭＦα１−１からのｐαＬＸ−５の構成を示してい
る。図９はｐＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ １の概略図を示
している。図１０はＭＦα１−ＨＰＴＨの融合遺伝子の
配列と、ＨＰＴＨをコードするＤＮＡの可能な全ての組
み合わせを示している。図１１はＭＦα１−ＨＰＴＨの
融合遺伝子の配列を示している。図１２は酵母が生産、
分泌し、酵母培地から回収されたヒト副甲状腺ホルモン
の電気泳動プレートを示している。

【００１７】以上に示したように本発明は、ヒトプレプ
ロ副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡを含んだ大腸菌
への挿入用プラスミドについてのものである。また本発
明は作成された形質転換大腸菌に関する。

【００１８】更に本発明は、大腸菌への挿入用プラスミ
ドに由来する、副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡを
持つ酵母への挿入用プラスミドについてのものである。
最終的には本発明は、副甲状腺ホルモンが回収されると
考えられる酵母についてのものである。

【００１９】更に本発明によりこのプラスミドと形質転
換微生物の単離と作成の方法がもたらされる。外科的操
作後直ちに回収されたヒト副甲状腺腫からポリＡ選択の
ＲＮＡが単離された。ポリＡ ＲＮＡを庶糖濃度勾配超
遠心によって適正な大きさのｍＲＮＡに濃縮した。この
サイズに分画されたポリＡ ＲＮＡからインビトロで正
常な分子量の副甲状腺ホルモンを翻訳しこれを、抗副甲
状腺腫抗血清による免疫沈降後に、ＳＤＳ電気泳動によ
って判定した。ヒト、ＰＴＨ特異的ｍＲＮＡを鋳型とし
て用いオリゴｄ（Ｔ）１８マーをプライマーとして鳥筋
原細胞腫ウィルス逆転写酵素を用いて相補ＤＮＡを合成
した。ＲＮＡの鋳型をアルカリ加水分解によって除去し
た後に、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ Ｉのクレノウフラ
グメント存在下で精製した第１のＤＮＡ鎖をインキュベ
ートすることによって第２の相補鎖ＤＮＡを合成した。
二本鎖の相補ＤＮＡの末端をアスベルギルス・オリザエ
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の一本鎖特
異的エンドヌクレアーゼＳ１の作用により平滑末端に
し、５００ｂｐ以上の長さの相補ＤＮＡをニュートラル
庶糖濃度勾配遠心によって単離した。約２０塩基長のｄ
（Ｃ）テイルをｃＤＮＡの３’末端に酵素によって付加
した。この修飾された相補ＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ Ｉ
で切断しオリゴｄ（Ｇ）テイルを付加したベクターｐＢ
Ｒ３２２に付加した。作成された組み換えプラスミドＤ
ＮＡを大腸菌Ｋ１２ ＢＪ５１０３株に形質転換させ
た。ポジティブな形質転換株は、それぞれ、ホルモンｍ
ＲＮＡ配列の３’末端の非コード領域と、Ｎ本のコード
領域をカバーする２種類の合成デオキシオリゴヌクレオ
チドを用いたコロニーハイブリダイゼーションによって
検索した。６６個のクローンのうち６つが両方のプロー
ブにポジティブであり、これらを制限酵素地図による詳
細な解析に供したところ、スタートコドンと３’末端の
ストップコドンのＸｂａ Ｉ部位の近接領域において、
サイズがいくつか異なることを除いては、全て同一であ
った。そのうちの１つのクローンであるｐＳＳＨＰＴＨ
−１０のＤＮＡ配列を解析したところｐＢＲ３２２のＰ
ｓｔ Ｉ部位に４３２塩基長のヒト副甲状腺ホルモンの
相補ＤＮＡが挿入されている事が判明した。この全cＤ
ＮＡ配列は、スタートコドンの前に５ｂｐの欠失があっ
た事を除いては、ヘンドリーら（前述）によって報告さ
れた配列と同一であった。

【００２０】図２は、ｐＳＳＨＰＴＨ−１０のヒトプレ
プロ副甲状腺ホルモンのＤＮＡ配列を示したものであ
る。５’の二重スタートコドンを除いては、ヒト副甲状
腺ホルモンのＤＮＡ配列の可能な全てのバリエーション
を示す図１と一致するであろう。図３は本発明によって
得られたクローンのＤＮＡ配列をその近接領域の配列と
共に示してある。より具体的には、ヒト副甲状腺ホルモ
ンをコードする大腸菌への挿入用プラスミドはｐＳＳＨ
ＰＴＨ−１０であり、そのＤＮＡ配列は近傍の配列と共
に図４に示してある。

【００２１】更に本発明により、酵母への挿入用の、副
甲状腺をコードするＤＮＡを持つプラスミドが得られ
る。この副甲状腺ホルモンはヒト及び動物、例えばブタ
やウシの副甲状腺ホルモンでもよい。本発明の酵母挿入
用プラスミドは、ヒト又は動物の副甲状腺ホルモンをコ
ードするＤＮＡを持つプラスミドから再クローン化され
得よう。具体的には、酵母への挿入用プラスミドに、ヒ
ト副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡが含まれてい
る。以下の例で示すように、ｐＳＳＨＰＴＨ−１０由来
のヒトＨＰＴＨ配列を再クローン化しサッカロマイセス
・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）で発現するように特別に設計されたベ
クターに挿入した。

【００２２】ｐＳＳＨＰＴＨ−１０は２８８ｂｐのＢｇ
１ II−Ｘｂａ Ｉ断片にあるように切断した。この断
片をｐＵＣ１９中のＢａｍＨ ＩとＸｂａ Ｉ部位間に
サブクローニングした。このサブクローンを更にＤｐｎ
Ｉで切断し生じてきた最も大きな断片を単離した。こ
の断片を次にＳａｌ Ｉで切断した。

【００２３】酵母ＭＡＴα細胞中でＰＴＨを発現、分泌
するこのプラスミドｐＳＳαＬＸ−ＨＰＴＨ１は三段階
を経て作成された。

【００２４】１．酵母シャトルベクターｐＬ４（大腸菌
中でもサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でも複製す
る）の作成。

【００２５】２．酵母性フェロモンＭＦα１遺伝子を含
んだＤＮＡ断片のクローニングと、これの酵母シャトル
ベクターへの挿入によるｐαＬＸ５ベクターの作成。

【００２６】３．ｐＳＳＨＰＴＨ−１０のＨＰＴＨ遺伝
子のコード領域のＤＮＡ断片をｐαＬＸ５のコード領域
にＭＦα１遺伝子の前駆体部分と共に挿入することによ
るｐＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨベクターの作成。

【００２７】シャトルベクターｐＬ４はｐＡＤＨ０４０
より単離したＡＤＨＩプロモーターを含む、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＡｖａII断片をｐＪＤＢ２０７に挿入することによ
って作成した。Ｓｐｈ Ｉ断片を次に欠失させ、プラス
ミドｐＡＬＸ１を作成した。βラクタマーゼ遺伝子中の
ｐｓｔ Ｉ部位を欠失させ、このプラスミドをＰｖａＩ
とＢｇ１ Ｉで部分分解し、ｐＵＣのＰｖｕ Ｉ、Ｂｇ
１ Ｉ断片をライゲーションし、ｐＡＬＸ２を作成し
た。さらに、オリゴヌクレオチドの挿入後このプラスミ
ドとＨｉｎｄIIIで分解し再び結合させてｐＡＬＸ４を
作成した。

【００２８】Ｙ２８８ｃ株より得た酵母の全ＤＮＡをＥ
ｃｏＲ Ｉで切断し１．６〜１．８ｋｂの断片を単離し
た。これをＥｃｏＲ Ｉで切断したｐＢＲ３２２に結合
し、大腸菌を形質転換させた。オリゴヌクレオチドハイ
ブリダイゼーションによりＭＦα−１の挿入クローンを
スクリーニングした。この結果選択されたＤＮＡを大腸
菌の形質転換用に用いた。得られたプラスミドｐＭＦα
１−１をＥｃｏＲ Ｉで切断しクレノウフラグメントで
平滑末端にした後にＢｇ１ IIで切断した。ＭＦα１断
片を単離し、（ＢａｍＨ Ｉで切断した後にクレノウフ
ラグメントで平滑末端にした）ｐＬ５に結合してｐαＬ
Ｘ５を作成した。ｐαＬＸ５にヒトＰＴＨｃＤＮＡ断片
を挿入する為に、ｐαＬＸ５をＨｉｎｄIIIで切断し、
生じた接着末端とこの部位をＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノウフラグメントとｄＮＴＰで平滑末端にした。次に
ｐαＬＸ５をＳａｌ Ｉで切断し、Ｓａｌ Ｉで切断し
た上記のヒトＰＴＨ断片と相補する接着末端を有するＤ
ＮＡを作成した。

【００２９】Ｓａｌ Ｉで切断したヒトＰＴＨ断片を、
Ｓａｌ Ｉで切断したｐαＬＸ５に挿入した。作成した
プラスミドｐＳＳαＬＸ５・ＰＴＨは図９に示してあ
る。

【００３０】ｐＳＳαＬＸ５−ＰＴＨを酵母に挿入し、
ヒト副甲状腺ホルモンを生産、分泌するような形質転換
酵母を得た。より具体的には、この形質転換酵母はサッ
カロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。

【００３１】図１２に酵母培地より得たヒト副甲状腺ホ
ルモンの電気泳動プレートを示してある。

【００３２】しかしながら、ｐＳＳＨＰＴＨ−１０を再
クローニングし酵母への挿入用プラスミドを作成する方
法は詳細に示してあり、この方法は本発明を例証するも
のとして示してあるが、本発明は以後これに制限される
ものではない。この方法は、ヒト、動物のＰＴＨをコー
ドするＤＮＡを持つ様々なプラスミドに応用されるだろ
うし、本発明の酵母への挿入用プラスミドが作成出来
る。

【００３３】本発明のプラスミド及び形質転換微生物は
以下の例にあるように作成された。

【００３４】例 １ヒト副甲状腺ホルモンのｍＲＮＡの単離と相補ＤＮＡの
合成 本発明の最初の材料として患者より外科的に得られた副
甲状腺腫が使われた。副甲状腺組織を摘出後、直ちにド
ライアイス中で冷却しＲＮＡ調製用に研究室に運んだ。
この凍結組織は、４Ｍグアニジニンイチオシアネート存
在下、超ツラックスホモゲナイザーでホモゲナイズし、
ガーグイン（Ｇｈｉｒｇｗｉｎ Ｊ.Ｍ.）、ヒジビラ
（Ｐｒｚｙｂｙｌａ Ａ．Ｅ．）、マクドナルド（Ｍａ
ｃＤｏｎａｌｄ Ｒ．Ｊ．）、ルター（Ｒｕｔｔｅｒ
Ｗ．Ｊ．）らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８
５２９４−５２９９ １９７９）に従って段階別エタ
ノール沈殿によってＲＮＡを回収した。調製したＲＮＡ
を、オリゴｄ（Ｔ）セルロースアフィニティクロマトグ
ラフィカラムにかけ、ポリ（Ａ）を持つｍＲＮＡを濃縮
した。ポリ（Ａ）を多く含むＲＮＡを更に１５〜３０％
連続庶糖濃度勾配超遠心にかけ、副甲状腺ホルモンｍＲ
ＮＡのサイズのＲＮＡを濃縮した。得られたグラジエン
トを２５画分に分画し、３画分毎にインビトロで翻訳さ
せ、抗ＰＴＨ抗血清による免疫沈降しガウテビィク（Ｇ
ａｕｔｖｉｋ， Ｋ．Ｍ．）Ｃａｕｔｉｖｉｋ．Ｖ．
Ｔ． Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ Ｊ．Ｆ． Ｓｃａｎｄ．
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ． ４３ ５５３
−５６９ １９８４）とＳＤＳ，ポリアクリルアミド電
気泳動レムリー（Ｌａｅｍｍｅｌｉ．Ｕ．Ｋ．）２２７
Ｎａｔｕｒｅ ６８０ １９７０）によってＰＴＨｍ
ＲＮＡ含量を、検量した。翻訳可能なＰＴＨｍＲＮＡを
含む画分のＲＮＡはエタノール沈殿によって回収した。
ＰＴＨｍＲＮＡを多量に含むこのＲＮＡを、cＤＮＡ合
成の為の鋳型にして、プライマーとしてオリゴｄ（Ｔ）
１８マーを、反応触媒として鳥筋原細胞腫ウィルス逆転
写酵素を用いた。マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ．
Ｔ．）Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ． Ｓａｎｂｒｏｏｋ．
Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇｐｐ２３０
−２４３ １９８２）。第一のＤＮＡ鎖の合成後に、Ｒ
ＮＡの鋳型をアルカリ加水分解によって除去した。第２
のｃＤＮＡ鎖は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ
ウフラグメント存在下に、精製した第一のｃＤＮＡ鎖を
インキュベートして合成した（マニアティス前出）。こ
のインビトロ合成二本鎖cＤＮＡは、アスペルギルス・
オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の
一本鎖特異的エンドヌクレアーゼＳ１の作用によって平
滑末端にした（マニアティス前出）。この平滑末端ｃＤ
ＮＡは、１５〜３０％のニュートラル庶糖勾配によって
サイズ毎に分画した。各画分のサイズ分布は、アガロー
スゲル電気泳動で既知のＤＮＡ断片をマーカーにして検
定した。約５００ｂｐより長いcＤＮＡを含む画分をス
トックし、cＤＮＡをエタノール沈殿によって集めた。

【００３５】例 ２ＰＴＨcＤＮＡのプラスミドｐＢＲ３２２へのクローニ
ングと大腸菌Ｋ１２ＢＪ．５１８３の形質転換 約２０塩基長のｄ（Ｃ）テイルをcＤＮＡの３’末端に
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
によって付加した。（マニアティス前出）このｄ（Ｃ）
テイルが付加されたｃＤＮＡをＰｓｔ Ｉで切断し、ｄ
（Ｇ）テイルが付加されたベクターｐＢＲ３２２にアニ
ールさせ、作成された組み換えプラスミドＤＮＡをハナ
ハン（Ｈａｎａｈａｎ．Ｄ）の方法（１６６．Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．５５７−５８０ １９８３）によって形
質転換可能になった大腸菌Ｋ１２．Ｂ．Ｊ．５１８３細
胞に形質転換した。得られた３３０００の形質転換株が
ＰＴＨｃＤＮＡを含んでいることは、コロニーハイブリ
ダイゼーション（Ｈａｎａｈａｎ．Ｄ，Ｍｅｓｅｌｓｏ
ｎ １０ Ｇｅｎｅ ６３ １９８０）によって検定し
た。

【００３６】２〜３４個の形質転換株を、それぞれ８２
ｍｍ直径のニトロセルロースフィルターに直接にプレー
ディングによって接種し、テトラサイクリンを含む高栄
養寒天プレート上に置き、３７℃で約０．１ｍｍのコロ
ニーが出現する迄インキュベートした。このフィルター
に新しい２枚のフィルターを順次押しつけることによっ
てそれぞれのフィルターの２枚のレプリカを得た。この
レプリカフィルターを新しいテトラサイクリンを含む寒
天プレートの上に置き、約直径０．５ｍｍのコロニーが
出現するまで３７℃でインキュベートした。細菌のコロ
ニーのマスターフィルターは寒天プレート上に置き４℃
で保存し、２連のレプリカフィルターは寒天プレートか
ら引きはなして以下のコロニーハイブリダイゼーション
の操作に供した。

【００３７】例 ３組み換えＰＴＨcＤＮＡを含む菌コロニーと、ｐＳＳＨ
ＰＴＨ−１０クローンのＤＮＡ配列の性質 それぞれのコロニーの細胞はその場でアルカリおよび塩
化ナトリウム処理によりこわされ、各々の細菌のクロー
ンの有するＤＮＡが、露出された。フィルターをトリス
緩衝液で中和し８０℃で乾燥させることによってＤＮＡ
がフィルターに結合する。細胞の破片は６５℃で、界面
活性剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と塩化ナトリ
ウムで洗浄することにより、ほとんどが除去されたが、
ＤＮＡは細菌のコロニーがあった位置のフィルターに結
合したままである。これらのフィルターを６×ＳＳＣ液
（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸ナトリウ
ム）、１×デンハルト液（０．１ｇ／ｍｌフィコル（Ｆ
ｉｃｏｌｌ）、０．１ｇ／ｍｌポリビニルピロリドン、
０．１ｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）、１００ｇ／ｍｌ
ニシン精子ＤＮＡ、０．５％ＳＤＳ、０．０５％ピロリ
ン酸ナトリウムに３７℃で２時間浸しておく。（ウッズ
（Ｗｏｏｄｓ．Ｄ．Ｅ．） ６ ＦｏｃｕｓＮｏ．３．
１９８４）

【００３８】ハイブリダイゼーションは、³²Ｐ標識のＤ
ＮＡプローブが入っているハイブリダイゼーション液
（６×ＳＳＣ、１×デンハルト液、２０ｇ／ｍｌ ｔＲ
ＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム）中で、４２℃
で１８時間かけて行った。（ウッズ前出）

【００３９】ハイブリダイゼーションのプローブとして
使ったＤＮＡは、ヘンドリーら（前出）らによって報告
されたヒトＰＴＨｃＤＮＡの配列から推定された２種類
の異なる合成デオキシリボオリゴヌクレオチドのうちの
１つである。１番目のプローブは、２４マーのオリゴヌ
クレオチドでありヒトプレプロＰＴＨのコード配列のス
タートコドン付近の配列に由来するものでありその配列
はＴＡＣＴＡＴＧＧＡＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＡＣＣＧＡ
である。第２のオリゴヌクレオチドは２４マーであり、
終止コドンの３１ヌクレオチド下流に位置する制限酵素
Ｘｂａ Ｉの切断部位をまたぐものであり、その配列は
ＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＡＴＣＣで
ある。

【００４０】³²Ｐ−γ−ＡＴＰの³²Ｐをオリゴヌクレオ
チドの５’末端にポリヌクレオチドキナーゼの作用で結
合させ標識した。（マキサム（Ｍａｘａｍ Ａ．Ｍ．）
Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｗ．６５．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．４９９ １９８０）ハイブリダイズしたフィル
ターはオートラジオグラフィーの前に４２℃で６×ＳＳ
Ｃ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム液中で洗浄した。
二連のレプリカフィルターの両方の写しにハイブリダイ
ズしていることで判定してみたところ６６個のクローン
が両方のプローブにポジティブであることがわかった。
ｃＤＮＡライブラリーがストックされているもとのフィ
ルターからそれらを全て回収して、−７０℃で永久保存
するために増殖させた。これらのうち６つをプラスミド
調製用とエンドヌクレアーゼによる制限酵素地図の更に
詳細な解析をするために選んで調べたところ、開始コド
ンとＸｂａ Ｉ部位の近接領域でそれぞれサイズが異な
ってきていることを除いては全てが全く同一のものであ
った。

【００４１】例 ４クローンｐＳＳＨＰＴＨ−１０ ｐＳＳＨＰＴＨ−１０クローンをマサキム・ギルバート
法（前出）によるＤＮＡの配列解析に供した。図６にｐ
ＳＳＨＰＴＨ−１０の完全な構造が示してある。このク
ローンは４３２ｂｐ長のＰＴＨｃＤＮＡの配列が、ｐＢ
Ｒ３２２のＰｓｔ Ｉ部位に挿入されており５’末端に
２７のＧ／Ｃ塩基対か３’末端に１７のＧ／Ｃ塩基対が
ある。図４にｐＳＳＨＰＴＨ−１０のｃＤＮＡ挿入部分
の完全なＤＮＡ配列が示してある。開始コドンのちょう
ど前１−５塩基対の欠失があることを除いてはヘンドリ
ー（前出）らのシークエンスを同一であり、使用される
開始コドンに先立つ、報告されている（ヘンドリーら前
出）。開始−終止シグナル（ＡＴＧＴＧＡＡＧ）は、
（下線部が欠失）、２重の開始シグナル（ＡＴＧＡＴ
Ｇ）に変わっていた。

【００４２】例 ５酵母シャトルベクターｐＬ４の作成 ＨＰＴＨを酵母で発現させる計画が始まる以前に一般的
な酵母発現ベクターの一連のものが作成された。その１
つがｐＬ４であり、以下に述べるように後に使用してｐ
ＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨを作成した。

【００４３】ベッヂ（Ｂｅｇｇｓ Ｊ．Ｄ），Ｖｏｎ
Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ Ｄ． Ｆｒｉｉｓ Ｊ． Ｋｉｅ
ｌｌａｎｄ−Ｂｒａｎｄｔ Ｍ． Ｓｔｅｎｄｅｒｕ
ｐ．Ａ．らによって作成されたプラスミドｐＪＤＢ２０
７“マルチコピー酵母プラスミドベクター”（Ｅｄｓ）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｙｅａ
ｓｔ（１９８１）Ａｌｆｒｅｄ Ｂｅｎｚｏｎ Ｓｙｍ
ｐｏｓｉｕｎ Ｖｏｌ．１６ ３８３−３９０）は、一
般的な発現ベクターのための基本に選んだ。これは、ｐ
ＢＲ３２２に由来するｐＡＴ１５３に酵母の２ミクロン
ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片が挿入されている。また、酵母
のＬＥＵ２遺伝子を持っている。ｐＪＤ２０７の酵母ｃ
ｉｒ⁺細胞中でのコピー数は他のプラスミドに比較して
はるかに多く、ｃｉｒ⁺株での非選択培養後でもめずら
しく安定である。

【００４４】ペレント（Ｐａｒｅｎｔ Ｓ．Ａ．）Ｆｅ
ｎｉｍｏｒｅ Ｃ．Ｍ． Ｂｏｓｔｉａｎ Ｋ．Ａ．
“発現用のベクターシステム、サッカロマイセス・セレ
ビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡシーク
エンスの分析とクローニング”１．Ｙｅａｓｔ， ８３
−１３８（１９８５）；エルハート（Ｅｒｈａｒｔ
Ｅ．）Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ Ｃ．Ｐ．“サッカロマイ
セス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２ミクロンＤＮＡ組み換えプラ
スミド上の欠損ＬＥＵ２の存在が高コピー数とキュアリ
ングの原因である。”１５６Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
６２５−６３５（１９８３）。

【００４５】これらの特徴は選択マーカー遺伝子ＬＥＵ
２（またはＬＥＵ２ｄと言う。ｄは欠陥の頭文字）のプ
ロモーターが部分的に弱くなっていることと関連があ
り、エルハート（前出）、以下のプラスミド作成におい
て変換されない。

【００４６】ＡＤＨＩプロモーターを含む１２６０塩基
対のＥｃｏＲＩ−ＡｖａII断片をプラスミドｐＡＤＨ０
４０から単離した。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメントと全ての４つのｄＮＴＰとの反応を完全に行
わせた後にＢａｍＨ Ｉリンカーを付加してこの断片を
ｐＪＤＢ２０７の中にある唯一のＢａｍＨ Ｉ部位にク
ローン化した。逆方向のプロモーターになっているプラ
スミドから１０５０塩基対のＳｐｈ Ｉ断片（ｐＪＤＢ
２０７のＳｐｈ Ｉ部位からプロモーター断片中のＳｐ
ｈ Ｉ部位に至る）を欠失させ、１つのＢａｍＨ Ｉ部
位のみを残した。このプラスミドをｐＡＬＸ １と称し
た。

【００４７】ｐＡＬＸ １中のβラクタマーゼ遺伝子中
のＰｓｔ Ｉ部位を次に遺伝子を不活性化させることな
く欠失させた。ｐＡＬＸ １をＰｓｔ Ｉで完全に分解
し、ヌクレアーゼＳ１でＰｓｔ Ｉ部位を分解し、次に
ＰｖｕＩとＢｇｌ Ｉによって部分的に分解した。同時
にｐＵＣ１８からビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ Ｊ．）Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ Ｊ．１９．Ｇｅｎｅ．２５９．１９８２）
Ｐｓｔ Ｉ部位を含まない対応するβラクタマーゼ遺伝
子の断片になる。ＰｖｕＩ、ＢｇｌＩの２５０塩基対の
断片を単離した。これを部分分解したｐＡＬＸ１に結合
させた。単離されたアンピシリン耐性クローン全てのう
ち、βラクタマーゼ遺伝子はｐＵＣ８断片と結合するこ
とによって、復帰していた。このプラスミドのことをｐ
ＡＬＸ２と称する。

【００４８】ベルゲン（Ｂｅｒｇｅｎ）大学のクレッペ
（Ｋ．Ｋｌｅｐｐｅ）教授より以下のオリゴヌクレオチ
ドを購入し、ｐＡＬＸ２のＢａｍＨ Ｉ部位に挿入し
た。

【００４９】

【化１】

【００５０】適正な方向にプロモーターが入ったプラス
ミドを単離し、これをｐＡＬＸ３と称する。

【００５１】最終的にｐＡＬＸ３はＨｉｎｄIIIで切断
し再結合させることによってＨｉｎｄIIIの４８０塩基
対断片を欠失させた。このプラスミドをｐＡＬＸ４と名
づけた。図７にｐＡＬＸ４の制限地図を示してある。

【００５２】ｐＬ４はｐＡＬＸ４由来のものでＡＤＨＩ
のプロモーターが欠失している。ｐＬ４は他のプロモー
ターの挿入用のものとして使われた。ｐＡＬＸ４をまず
ＢｇｌIIとＳａｌ Ｉで切断した。生じてきた接着末端
をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと４つ
のｄＮＴＰによってうずめて、再結合させた。この処理
によってＡＤＨＩプロモーターが除去され、Ｂｇｌ II
部位を再び持つベクターｐＬ４が作成された。

【００５３】例 ６ｐαＬＸ５の作成 酵母の性フェロモンＭＦα１の遺伝子は初めてカージャ
ン（Ｋｕｒｊａｎ．Ｊ．）とヘルスコウィツ（Ｈｅｒｓ
ｋｏｗｉｔｚ．Ｉ．）によってクローニングされた。

【００５４】“酵母フェロモン遺伝子（ＭＦα）の構
造；推定上のα因子前駆体には４つのタンデムコピーの
成熟因子が含まれる”３０ Ｃｅｌｌ．９３３−９４３
（１９８２）。この文献に報告されている配列をもとに
ＭＦα１遺伝子を再クローニングした。全酵母ＤＮＡを
Ｙ２８８Ｃ株より得、ＥｃｏＲ Ｉで切断し、この切断
産物のうち１．６〜１．８ｋｄの範囲のサイズのものを
調整用アガロースゲルから単離した。これは次に脱リン
酸化され、ＥｃｏＲ Ｉで切断されたｐＢＲ３２２に結
合させ、大腸菌ＢＪ５１８３を形質転換するのに使われ
た。生じてきたクローンを下記の構成の標識オリゴヌク
レオチドでハイブリダイゼーションによってＭＦα１遺
伝子の挿入を調べた。 ＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡＡＧＣ

【００５５】ポジティブクローンより精製してきたＤＮ
Ａは、次に、プラスミドＤＮＡが調製されてきた大腸菌
ＪＡ２２１を形質転換するのに使われた。以下のプラス
ミドに使われたプラスミドすなわちｐＭＦα１−１は図
８に示してある。

【００５６】ＰＭＦα−１はＥｃｏＲ Ｉで切断し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと４つのｄ
ＮＴＰと反応させ、フェノール抽出を行いＢｇｌ IIで
切断した。１．７ｋｄのＭＦα１遺伝子をアガロースゲ
ルから単離した。酵母シャトルベクターにこれを挿入す
る前に、ｐＬ４のＨｉｎｄ III部位をＨｉｎｄIIIによ
る分解によって除去し、クレノウフラグメントでのうめ
あわせ反応と、再結合によってｐＬ５シャトルベクター
を作成した。ｐＬ５はＢａｍＨ Ｉが切断され、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと４つのｄＮＴ
Ｐによってうめあわせ、フェノール抽出をし、Ｂｇｌ
IIで切断した。ゲルで精製した後にこれをＭＦα１の断
片と結合させ、図８に示してあるような発現ベクターｐ
αＬＸ５を作成した。

【００５７】例 ７ｐＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ１の作成 ｐＳＳＨＰＴＨ−１０プラスミドからの２８８塩基対の
Ｂｇｌ II、ＸｂａＩ断片を単離しｐＵＣ１９にそのベ
クターのＢａｍＨ ＩとＸｂａ Ｉ部位を用いてサブク
ローニングした。このｐＵＣ−ＨＰＴＨと名づけられた
サブクローンをＤｐｎ Ｉで切断し最大の断片を単離し
た。この断片をＳａｌ Ｉで切断し、Ｓａｌ Ｉ切断の
方は接着末端にＤｐｎ Ｉ切断の方は平滑末端になって
いる、２つの生成断片のうち小さい方を単離した。

【００５８】ｐαＬＸ５をＨｉｎｄ IIIで切断し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと４つのｄ
ＮＴＰでのうめあわせ反応をし、フェノール抽出を行
い、Ｓａｌ Ｉでの切断を行った。ゲルから精製後、こ
れを上述のＨＰＴＨ断片に結合した。このクローンはリ
ーディングフレームが適正となるようにＨｉｎｄ III
部位が再生されている。

【００５９】このプラスミドをｐＳＳαＬＸ５−ＨＰＴ
Ｈ１と称し、図９に示してある。ＭＦα１−ＨＰＴＨ融
合遺伝子の配列は図５に示してある。

【００６０】例 ８酵母におけるＨＰＴＨの発現と分泌 酵母株ＦＬ２００（α，Ｕｒａ３，Ｌｅｕ２）を、プラ
スミドｐαＬＸ５とｐＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ１で、ス
フェロプラスト法で形質転換させた。それぞれのうち１
つの形質転換株をＬｅｕ−の培地で成育させ、細胞を含
まない培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色で調べた。（図
１２）ｐＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ１の形質転換株の培地
には２つの大量のバンドがあったが、ｐαＬＸ５の形質
転換株培養液にはなかった。１つのバンドはだいたい９
０００ダルトンであり、ＨＰＴＨの予想される分子量に
対応し、他のバンドは約１６０００ダルトンでありプロ
セッシングを受けていないＭＦα１−ＨＰＴＨ融合産物
に対応するものであろう。両ポリペプチド共に生来のホ
ルモンと同一の態様で抗ヒトＰＴＨ抗体と反応した。

【００６１】以上の例は、例証により示されているが、
本発明はこれに制限されるわけではない。以上の例はヒ
ト副甲状腺ホルモンを生産、分泌するサッカロマイセス
・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の開発を
目的としたものだが、本発明の方法は、どの種の副甲状
腺ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミドを作成
するのにも応用され得よう。更にこのプラスミドはどの
種の酵母にも挿入され得よう。故に本発明はサッカロマ
イセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に
制限されない。

【００６２】本発明の酵母が生産した、クローン化ヒト
副甲状腺ホルモンには既知の、又は潜在的可能性のあ
る、様々な使用法がある。例えば、最近の医学理論によ
ると、ヒト副甲状腺ホルモンは骨粗鬆症の治療に非常に
効果的であるらしい。遺伝子工学的に作成された副甲状
腺ホルモンはヒトや動物の副甲状腺ホルモンレベルを測
る分析キットについても利用価値があろう。ヒト副甲状
腺ホルモンやその断片は減少性又は病理的血中カルシウ
ムレベル異常を示すヒトや動物の治療にも使えるであろ
う。

【００６３】遺伝子工学的に作られた副甲状腺ホルモン
が例えば本発明の結果として大量に入手可能になると、
数多くの他の使用法の開発が期待される。

【００６４】本発明は特定の好適具体例を参照しつつ記
載したが、その応用は当業者に明白なので、本発明は上
記具体例に限定されない。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコードする
ＤＮＡ塩基配列の可能な全てのバリエーションを示す図
である。

【図２】 クローンｐＳＳＨＰＴＨ−１０のヒトプレプ
ロ副甲状腺ホルモンＤＮＡに特異なコード配列を示す図
である。

【図３】 ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコードし、
５’末端に２重のスタートコドンを持つ、ＤＮＡ配列を
近接領域と共に示す図である。

【図４】 クローンｐＳＳＨＰＴＨ−１０の特異的ヒト
プレプロ副甲状腺ホルモンＤＮＡ配列を近接配列と共に
示す図である。

【図５】 クローンｐＳＳＨＰＴＨ−１０のＤＮＡ配列
にコードされる、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンのアミ
ノ酸配列を示す図である。

【図６】 組み換えプラスミドｐＳＳＨＰＴＨ−１０の
構成を示す図である。

【図７】 ｐＡＬＸ４の制限地図を示す図である。

【図８】 ｐＬ４とｐＭＦα１−１からのｐαＬＸ−５
の構成を示す図である。

【図９】 ｐＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ １の概略図であ
る。

【図１０】 ＭＦα１−ＨＰＴＨの融合遺伝子の配列
と、ＨＰＴＨをコードするＤＮＡの組み合わせを示す図
である。

【図１１】 ＭＦα１−ＨＰＴＨの融合遺伝子の配列を
示す図である。

【図１２】 ヒト副甲状腺ホルモンの電気泳動プレート
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 アレストローム，ペーテル ノルウェー王国エンヌ−3505 ソルリーホ ーダ，サクセベイエン 24 (72)発明者 ガウトビク，カーレ・エンム ノルウェー王国エンヌ−0257 オスロ ２，スコーブン 17 (72)発明者 ベアテ・オイェン，トルディス ノルウェー王国エンヌ−0671 オスロ ６，ストルダムン 33 (72)発明者 ガブリエルセン，オード・ストーク ノルウェー王国エンヌ−0280 オスロ ２，ウルレルン 16

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に純粋な組み換え体ｈＰＴＨ。
2. 【請求項２】 上記ｈＰＴＨが酵母から発現された請求
   項１のｈＰＴＨ。
3. 【請求項３】 ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子に操作可能
   に結合されたサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
   ｃｅｓ）交配ファクターアルファ１をコードするＤＮＡ
   配列であって、該ＤＮＡ配列は酵母細胞を安定して形質
   転換して完全なヒト副甲状腺ホルモンを発現し分泌でき
   るＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 ＰＴＨをコードするＤＮＡを含む、酵母
   に挿入するためのプラスミド。
5. 【請求項５】 ＰＴＨがｈＰＴＨである請求項４のプラ
   スミド。
6. 【請求項６】 酵母がサッカロマイセス・セレビシアエ
   （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
   ｅ）である請求項４または５のプラスミド。
7. 【請求項７】 プラスミドがさらに、ＰＴＨをコードす
   るＤＮＡによる読取り枠において酵母交配ファクターア
   ルファ１を含む請求項４ないし６のいずれかのプラスミ
   ド。
8. 【請求項８】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に挿入するため
   のプラスミドであって、ｈＰＴＨをコードするＤＮＡを
   含むプラスミド。
9. 【請求項９】 ｈＰＴＨをコードするＤＮＡが開始コド
   ンの前の５つの塩基対欠損を示すことにより、上記ＤＮ
   Ａの５’末端に二重の開始コドンを生ぜしめる請求項４
   ないし８のいずれかのプラスミド。
10. 【請求項１０】 プラスミドがｐＳＳαＸ５−ＨＰＴＨ
    １であって、ＡＴＣＣＮｏ．４０２６６として寄託さ
    れ、あるいはプラスミドがｐＳＳＨＰＴＨ−１０であっ
    て、ＡＴＣＣＮｏ．４０２６７として寄託されている請
    求項４ないし９のいずれかのプラスミド。
11. 【請求項１１】 酵母に挿入するための、請求項４−
    ７、９および１０のいずれかのプラスミドを酵母細胞の
    形質転換ならびにＰＴＨの発現と分泌のための用途。
12. 【請求項１２】 無傷のｈＰＴＨを発現できる遺伝子操
    作された微生物。
13. 【請求項１３】 微生物がサッカロマイセス・セレビシ
    アエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
    ａｅ）種の酵母である請求項１２の遺伝子操作された微
    生物。
14. 【請求項１４】 微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であ
    る請求項１２の遺伝子操作された微生物。
15. 【請求項１５】 微生物が請求項３−１０のいずれかの
    ＤＮＡ配列またはプラスミドを含む請求項１２−１４の
    いずれかの遺伝子操作された微生物。
16. 【請求項１６】 微生物がプラスミドがｐＳＳαＸ５−
    ＨＰＴＨ１（ＡＴＣＣ４０２６６）で形質転換されＡＴ
    ＣＣ２０８２１として寄託されたサッカロマイセス・セ
    レビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
    ｉｓｉａｅ）、あるいはプラスミドがｐＳＳＨＰＴＨ−
    １０（ＡＴＣＣＮｏ．４０２６７）で形質転換されＡＴ
    ＣＣ６７２２３として寄託されている大腸菌（Ｅ．ｃｏ
    ｌｉ）である請求項１５の微生物。
17. 【請求項１７】 請求項１２ないし１６のいずれかの微
    生物からのｈＰＴＨの発現および分泌によって得られる
    無傷のｈＰＴＨ。