JPH05271279A - ヒト副甲状腺ホルモンムテインおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】医薬品として有用な、ヒト甲状腺ホルモン（ヒ
トＰＴＨ）の新規誘導体を提供する。 【構成】ヒトＰＴＨの８位、１８位のメチオニン残基を
他のアミノ酸に置換したアゴニスト誘導体、又３４位か
ら４７位の１アミノ酸残基をシステインに置換したアゴ
ニスト誘導体、およびＮ末端アミノ酸配列を３ないし６
残基欠如したアンタゴニスト誘導体をそれぞれ組換え遺
伝子法で得た。 【効果】メチオニン基を他の脂溶性アミノ酸残基に変換
することにより、酸化作用に対し安定なヒトＰＴＨ誘導
体が得られ、Ｎ末端アミノ酸欠損によりＰＴＨアンタゴ
ニスト誘導体が得られ、また中間部のアミノ酸をシステ
インに変換することにより二量体の生成や他の官能基を
導入し、より優れた化合物に変換可能なヒトＰＴＨ誘導
体を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規ヒト副甲状腺ホル
モン誘導体およびその製造法に関するものである。

【０００２】

【従来技術】副甲状腺ホルモン（以下、ＰＴＨと略記す
ることもある）は副甲状腺から分泌される、８４個のア
ミノ酸から成るポリペプチドホルモンであり、カルシウ
ム代謝の最も重要なレギュレーターの１つである。した
がってヒトＰＴＨの副甲状腺機能低下症や骨粗鬆症など
の種々の骨疾患への応用、さらにはヒトＰＴＨアンタゴ
ニストの高カルシウム血症などへの応用は非常に期待さ
れるところである。

【０００３】ヒトＰＴＨのＤＮＡ配列はG.N.Hendyらに
よって最初に明らかにされた〔プロシージングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oc.Nah, Acad, Sci）USA, 78, 7365-7369 (1981)〕。そ
れ以来、ヒトＰＴＨを遺伝子工学的に取得する多くの試
みがなされてきたが、ようやく最近になって産業上の見
地からしても満足できる発現量が達成されるようになっ
てきた〔例えば、Wing L. Sungらジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem) 266, 28
31-2835 (1991) やヨーロッパ特許出願公開４８３５０
９号公報〕。

【０００４】ヒトＰＴＨは次のようなアミノ酸配列 Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met- 1 5 10 15 Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Val-Ala- 20 25 30 35 Leu-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys- 40 45 ５０ Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ− 55 60 65 70 Ala-Asp-Val-Asn-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln 75 80 を有するものであるが、その生物学的作用はＮ末端（１
−３４位)(以下アミノ酸残基の位置はSerを第１位とす
るヒトＰＴＨ（１−８４）の配列に対応する番号で示
す）のフラグメントで再現できる事が以前より知られて
おり〔G.W. Tregearら、エンドクリノロジー(Enducrino
logy), 93, 1349-1353 (1973)〕、多くの誘導体が合成
されてきた。さらにこの（１−３４）フラグメントにお
いてＮ末の２〜６個のアミノ酸を欠如したペプチドがＰ
ＴＨアンタゴニスト活性を有することが知られている。
さらに最近になって３５位以後のＣ末端部のレセプター
への結合能〔L.G. Raoら、エンドクリノロジー(Endocri
nology) 117, 1632-1636 (1985)〕やアルカリホスファ
ターゼの活性化作用〔T.M. Murrayら、エンドクリノロ
ジー（Endocrinology) 124, 1097-1099 (1989)〕が明ら
かにされた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】天然体のＰＴＨ（１−
８４）を実際の医薬として用いようとする場合には、尚
解決すべき問題点が存在する。例えばペプチド鎖中のMe
t残基は通常の条件下でも徐々に酸化を受けるが、ＰＴ
Ｈではこれら酸化体の生物活性は著しく減少する〔A.L.
Frelinger IIIとJ.E. Zull, ザ・ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem) 259, 5
507-5513 (1984)〕。また医薬として使用する場合、非
注射剤とする事がその投与の簡便さからも望ましい。ヒ
トＰＴＨ（１−８４）を修飾することによって物理化学
的性質を変え、例えば粘膜からの吸収を容易にする事が
可能であると考えられる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】この様な課題を解決する
ために、ペプチド鎖中のアミノ酸を他のアミノ酸に置換
して、その生理活性ペプチドの生物学的、物理化学的諸
性質の向上を計ると言う事は最も一般的な方法である。
先に本発明者らは大腸菌におけるヒトＰＴＨ(１−８
４）の高発現系を提供した〔ヨーロッパ特許出願公開４
８３５０９号公報〕が、この発現系を利用し、ヒトＰＴ
ＨのMet残基を他のアミノ酸に置換することにより抗酸
化誘導体を得る事に成功した。またペプチド鎖の中心部
の種々のアミノ酸残基をCysに置換した誘導体を得た。
このSH基に例えば高脂溶性基を特異的に導入することに
より、又S-S結合を介した２量体を形成させる事により
吸収性の高い、もしくは生体内で分解を受け難いアゴニ
ストに誘導することができる。さらにＰＴＨ（１−３
４）についてはＮ末端アミノ酸を数個欠如した化合物は
阻害剤として機能する事が知られているが〔N. Horiuch
iら、サイエンス（Science) 220, 1053-1055 (198
3)〕、本発明はＣ末端ペプチド鎖を含むヒトＰＴＨにお
いてもＮ末端アミノ酸を数個欠如したアンタゴニスト、
および、この化合物にさらに上で説明したアミノ酸置換
をほどこしたペプチドをも提供するものであり、これら
は臨床応用に際して、より好ましい性質を有する化合物
である。

【０００７】すなわち本発明は、（１）ヒト副甲状腺ホ
ルモンのアミノ酸配列において、（ｉ）Ｎ末端部アミノ
酸残基が３ないし６個欠損、（ii）少なくとも１個のメ
チオニン残基が他の脂溶性アミノ酸残基で置換、（ii
i）アミノ酸残基番号３４から４７位の領域中のいずれ
か１個のアミノ酸残基がシステイン残基で置換、のうち
少なくとも１つの変換をしてなるヒト副甲状腺ホルモン
ムテイン、（２）上記（１）記載のヒト副甲状腺ホルモ
ンムテインをコードする塩基配列を有する組み換えＤＮ
Ａ、（３）上記（２）記載の組み換えＤＮＡを含有する
ベクター、（４）上記（２）記載の組み換えＤＮＡが大
腸菌Ｔ７プロモーターの制御領域に挿入されているベク
ター、（５）上記（２）記載の組み換えＤＮＡにより形
質転換された形質転換体および（６）上記（５）記載の
形質転換体を培地に培養することを特徴とするヒト副甲
状腺ホルモンムテインの製造法、に関するものである。

【０００８】本発明のＰＴＨムテインは、上記（ｉ）、
（ii）および（iii）の少なくとも１つの変換をしてな
るものであれば、目的に併せていずれの変換を選択して
も良いが、更にこれらの変換を組み合わせたムテイン、
例えばＮ末端部アミノ酸残基３ないし６個を欠損し、か
つ少なくとも１個のメチオニン残基が他の脂溶性アミノ
酸残基で置換されたムテイン；Ｎ末端部アミノ酸残基３
ないし６個を欠損し、かつアミノ酸残基番号３４から４
７位の領域中のいずれか１個のアミノ酸残基がシステイ
ン残基で置換されたムテイン；少なくとも１個のメチオ
ニン残基が他の脂溶性アミノ酸残基で、アミノ酸残基番
号３４から４７位の領域中のいずれか１個のアミノ酸残
基がシステイン残基でそれぞれ置換されたムテイン；お
よびＮ末端部アミノ酸残基３ないし６個を欠損し、かつ
少なくとも１個のメチオニン残基が他の脂溶性アミノ酸
残基で、アミノ酸残基番号３４から４７位の領域中のい
ずれか１個のアミノ酸残基がシステイン残基でそれぞれ
置換されたムテイン等も目的により好ましく用いること
ができる。本発明において、８位もしくは１８位に存在
するメチオニン残基を置換するのに用いる脂溶性アミノ
酸残基としては、天然に存在する蛋白質を構成する脂溶
性アミノ酸残基であればいずれでもよく、例えばフェニ
ルアラニン、チロシン、トリプトファン等の芳香族アミ
ノ酸残基、イソロイシン、ロイシン、バリン等の比較的
長鎖の脂肪族アミノ酸などが挙げられる。

【０００９】本発明のヒト副甲状腺ホルモンムテインと
してはたとえば次の一般式（Ｉ）で表わされるペプチド
およびそれらの塩が挙げられる。 一般式〔Ｉ〕 R₁-R₂-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-R₃-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu- Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R₄-R₅-Ala-R₆-Gly-R₇-Pro-R₈-Ala-R₉- R₁₀-Asp-Ala-Gly-Ser-Glu-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu- Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asn-Val-Leu-Thr- Lys-Ala-Lys-Ser-Gln 〔式中R₁はLeu（配列番号：１）, Gln-Leu（配列番号：
２）, Ile-Gln-Leu（配列番号：３）, Glu-Ile-Gln-Leu
（配列番号：４）またはSer-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu
（配列番号：５）を、R₂はLeu, Ile, ValまたはMetを、
R₃はLeu, Ile,ValまたはMetを、R₄はCysまたはPheを、R
₅はCysまたはValを、R₆はCysまたはLeuを、R₇はCysまた
はAlaを、R₈はCysまたはLeuを、R₉はCysまたはProを、R
₁₀はCysまたはArgを示す。但しヒト副甲状腺ホルモンと
同一の構造を除く〕。

【００１０】本発明のヒトＰＴＨムテインを製造するた
めには、ヒトＰＴＨ（１−８４）のアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子〔例えばヨーロッパ特許出願公開４８３５
０９号公報〕を、従来のＤＮＡ技術、例えば特定部位指
向性変異誘発技術を用いて目的のムテインをコードする
遺伝子に変換する(例えば図７)。またＮ末端欠損ヒトＰ
ＴＨムテイン、例えばＮ末端アミノ酸配列、Ser-Val-Se
r, Ser-Val-Ser-Glu,Ser-Val-Ser-Glu-IleまたはSer-Va
l-Ser-Glu-Ile-Glnを欠如したアンタゴニスト誘導体
（図１)については、まずこれらヒトＰＴＨ（４−８
４）、ヒトＰＴＨ（５−８４）、ヒトＰＴＨ（６−８
４）、ヒトＰＴＨ（７−８４）の遺伝子（図２)(配列番
号：２４〜３１）を合成オリゴマーより作製し（図３、
図４）、ベクターに組み込む（図５）。それらにさらに
アミノ酸置換を施したムテインについてはそれぞれ該当
する遺伝子に特定部位指向性変異誘発を施して、目的と
する遺伝子を得る事ができる。特定部位指向性変異誘発
技術は周知であり、アール・エフ・レイサー(Lather,
R.F.）及びジェイ・ピー・レコック(Lecoq, J.P.)、ジ
ェネティック・エンジニアリング（Genetic Engineerin
g)、アカデミックプレス社（１９８３年）第３１−５０
頁に示されている。オリゴヌクレオチドに指示された変
異誘発はエム・スミス（Smith, M.）及びエス・ギラム（G
illam, S.)、ジェネティック・エンジニアリング：原理
と方法、プレナムプムス社（１９８１年）３巻１−３２
頁に示されている。

【００１１】本発明のアミノ酸置換を施した種々の鎖長
のムテインをコードする構造遺伝子を製造するために
は、たとえば、（ａ）ヒトＰＴＨの構造遺伝子の１本鎖
からなるＤＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドプライマ
ーと雑種形成させる、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼにより
プライマーを伸長させ、突然変異性ヘテロ二量体（hete
roduplex）を形成させる、続いて（ｃ）この突然変異性
ヘテロ二量体を複製する、といった方法が挙げられる。
オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異を
導入すべき遺伝子領域へのプライマーの安定な雑種形成
に必要な条件、あるいは現在利用可能なオリゴヌクレオ
チド合成法の限界等を考慮して選択される。オリゴヌク
レオチドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴヌ
クレオチドを設計するに当たって、考慮すべき因子（例
えば全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の大
きさ）は、エム・スミス及びエス・ギラム（前掲）によ
って記載されている。概して、オリゴヌクレオチドの全
長は、突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成を
最適化するような長さであり、突然変異サイトから５'
及び３'末端までの伸長部分（extensions）は、ＤＮＡ
ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による突然変異
の編集をさけるのに十分な大きさとする。本発明に従っ
て突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは、通
常、約１２個ないし約４０個の塩基、好ましくは約１４
個ないし約２４個の塩基を含有する。これらは通常、変
更されるコドンの少なくとも約３個の塩基３'側を含有
する。

【００１２】たとえば、構成アミノ酸がバリンであっ
て、これをシステインに置換したムテインを得る目的の
場合には、バリンのコドンをシステインのコドンに変更
させる合成ヌクレオチドプライマーを用いて、部位指向
性変異誘発を行うことにより、変更ヒトＰＴＨ遺伝子を
つくればよい。たとえば、ヒトＰＴＨの８位メチオニン
をロイシンに変えるために、プライマーをヒトＰＴＨ遺
伝子のアンチセンス鎖と雑種形成させる。たとえば、好
ましいヌクレオチドプライマーとしては 5'-TCCGAGATTCAGCTGCTGCATAACCTT-3' (配列番号：６) が挙げられ、イソロイシンに変えるには、例えば 5'-TCCGAGATTCAGTTAATCCATAACCTT-3' (配列番号：７) が挙げられ、スレオニンに変えるには、例えば 5'-TCCGAGATTCAGTTAACGCATAACCTT-3' (配列番号：８) が挙げられる。

【００１３】１８位メチオニンをロイシンに変えるため
の好ましいヌクレオチドプライマーとしては、 5'-ACATTTGAACTCGCTGGAGCGTGTAGAA-3' (oligonucleotid
e primer B)(配列番号：９） が挙げられ、同部位をイソロイシンに変えるためのプラ
イマーとしては ５’−ＡＣＡＴＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧＡＧＣＧＴ
ＧＴＡＧＡＡ−３’ （配列番号：１０） が挙げられ、またスレオニンに変えるためには 5'-ACATTTGAACTCGACGGAGCGTGTAGAA-3' (配列番号：１
１） が挙げられる。

【００１４】３４位フェニルアラニンをシステインに変
えるときの好ましいプライマーとしては 5'-GATGTGCACAATTGTGTTGCCTTAGGTGCC-3' (配列番号：１
２） が好ましく、３５位バリンをシステインに変えるには 5'-CACAATTTTTGCGCCTTAGG-3' (oligonucleotide primer
A)(配列番号：１３) が好ましく、３７位ロイシンをシステインに変えるには 5'-AATTTTGTTGCCTGTGGTGCCCCATTG-3' (配列番号：１
４） が、３９位アラニンをシステインに変えるには 5'-GTTGCCTTAGGTTGCCCATTGGCTCCT-3' (配列番号：１
５） が、４１位ロイシンをシステインに変えるには 5'-TTAGGTGCCCCATGTGCTCCTCGTGAT-3' (配列番号：１
６） が、４３位プロリンをシステインに変えるには 5'-GCCCCATTGGCTTGTCGTGATGCTGGT-3' (配列番号：１
７） が、４４位アルギニンをシステインに変えるには 5'-CCATTGGCTCCTTGTGATGCTGGTTCC-3' (配列番号：１
８） が好ましいプライマーとして挙げられる。

【００１５】プライマーは、ヒトＰＴＨ遺伝子の１本鎖
がクローン化されたＭ１３〔Yanisch-Perror, C., Viei
ra, J. Messing, ジーン(Gene), 33 103-119(1985)； M
essing J. メソッズ・イン・エンザイモロジー（Method
s in Enzymology), 101 20-78 (1983)〕, fd〔R. Herrm
an et al. モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティック（Mol. Gen. Genet.), 177 231 (1980)〕, 又
はφ×174〔M. Smith and S. Gillam, ジェネティック・
エンジニアリング(Genetic Engineering), Plenum Pres
s, Vol. 3, pp 1-32 (1981)〕のような１本鎖ファージ
あるいは、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９〔J. Vieira,
J. Messing, メソッズ・イン・エンザイモロジー（Method
s in Enzymology), 153, 3-11 (1987)〕といったファー
ジとプラスミドのキメラベクターへ雑種形成される。フ
ァージが遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれで
も運搬できることは認められる。ファージがアンチセン
ス鎖を運搬する時には、別のアミノ酸を暗号づけたトリ
プレットを決定するこのコドンとの不一致以外にもプラ
イマーは突然変異させるコドンを含有するセンス鎖の領
域とコドンの縮退のために同一でない場合があってもよ
い。同様にファージがセンス鎖を運搬する時には、欠損
させるコドンと対合をつくるトリプレット中の適当な不
一致以外は、突然変異させるコドンを含有するセンス鎖
の領域に対して相補的でない場合があってもよい。雑種
形成に使用される条件はエム・スミス及びエス・ギラム
(前掲）によって記載されている。温度は通常、約０℃
ないし７０℃、もっと一般的には約１０℃ないし５０℃
の範囲にある。雑種形成後、プライマーは大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素
又は他の適当なＤＮＡポリメラーゼとの反応によってフ
ァージＤＮＡ上で伸長される。生ずる二重鎖ＤＮＡ（ｄ
ｓＤＮＡ）は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガ
ーゼでの処理によって閉鎖環ｄｓＤＮＡへ変換される。
１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレア
ーゼ処理によって破壊できる。

【００１６】生ずる突然変異成形ヘテロ二量体は、被感
染能力をもつ宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用
される。宿主によるヘテロ二重体の複製では、双方の鎖
から子孫ができる。複製に続いて、突然変異株の鎖の子
孫から突然変異株遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿
入し、このベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転
換に使用する。次に、突然変異化された遺伝子を運搬す
るファージＤＮＡを単離し、プラスミドへ組み込む。Ｄ
ＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌由
来のｐＢＲ３２２〔ジーン（Gene), 2, 95 (1977)〕,
ｐＢＲ３２５〔ジーン, 4, 121 (1978)〕, ｐＵＣ１２
〔ジーン, 19, 259 (1982)〕, ｐＵＣ１３〔ジーン, 1
9, 259 (1982)〕、枯草菌由来のｐＵＢ１１０〔バイオ
ケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション（Biochemical and Biophysical Research Commu
nication),112, 678 (1983)〕などが挙げられるが、そ
の他のものであっても、宿主内で複製保持されるもので
あれば、いずれをも用いることができる。プラスミドに
組み込む方法としては、たとえばT. Maniatisら、モレ
キュラー・クローニング（Molecular Cloning）コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Sprin
g Harbor Laboratory), 第２３９頁（１９８２）に記載
の方法などが挙げられる。ヒトＰＴＨ（１−８４）のＮ
末端領域を欠如したペプチドをコードする遺伝子として
は、たとえば図１（配列番号：１９−２２）に示すよう
な配列のものが挙げられ、これらは合成によっても得ら
れる。図１には本発明で用いたＤＮＡ配列に加えてアミ
ノ酸配列をも示した。また図１にはヒトＰＴＨ（１−８
４）をコードする遺伝子およびアミノ酸配列（配列番
号：２３）をも併せて示している。

【００１７】当該遺伝子を発現に用いるには図２（配列
番号：２４−３１）に示すように、Ｎ末端の欠如したＰ
ＴＨのポリペプチドをコードする配列に加えて開始コド
ンＡＴＧ、停止コドン（例えばＴＡＡ）を各々５’側と
３’側に直接配し、また５’末端と３’末端側はベクタ
ーへの挿入のために例えば各々NdeＩ, BamHＩ付着末端
とする。図２にはヒトＰＴＨ（１−８４）をコードする
遺伝子に上記開始コドン、停止コドン等を付けた配列
（配列番号：３２，３３）をも併せて示している。本発
明のヒトＰＴＨ関連遺伝子の合成に当っては、例えば図
２に示すように最終的にはその構造遺伝子を１４個のフ
ラグメントで分割して合成した。図３に各ＤＮＡフラグ
メントを示したが、フラグメント＃１−ｅ、２−ｅおよ
び＃３〜＃１４（配列番号：４２〜５５）は既に本発明
者らが提出しているものである（ヨーロッパ特許出願第
４７７８８５号公報)。このフラグメントへの分割の仕
方は上記自己会合を避ける等の注意をすれば、上記のも
のに限定される必要はなく、種々の分け方が可能であ
る。各ＤＮＡフラグメント（＃１〜＃１４）（配列番
号：３４〜５５）は既知の合成法に従って製造し得る。
＃１と＃１４を除く各フラグメントは必要に応じて５’
末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、一挙に
全フラグメントをハイブリダイズさせＤＮＡリガーゼに
よって連結させるか（図４）、もしくはリン酸化したフ
ラグメントをまず２ないし３群に分けてハイブリダイズ
させＤＮＡリガーゼにより二重鎖ＤＮＡとし、さらに各
群を再びＤＮＡリガーゼで連結させる事によって完全な
二重鎖ｈＰＴＨ遺伝子が得られる。

【００１８】これをｐＵＣ１９のNdeＩおよびBamHＩに
よる消化物と結合させ、新規プラスミドｐＵ−ＰＴＨ−
Ｃ１９を得、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換する。単離し
たプラスミドについてＤＮＡフラグメントの一部をプラ
イマーとしてSanger法によって塩基配列を決定し、また
より簡便にはNdeＩ・BamHＩ消化で得られたＤＮＡフラ
グメントをAurII、NcoＩ、HgiAＩ、AluＩなどで消化
し、正しい制限部位を有することにより目的とするＮ末
端部を欠如したヒトＰＴＨ遺伝子の存在を確認する。さ
らにこの遺伝子を特定部位指向性変異誘発技術により８
位および１８位メチオニンをロイシンなどに、又、３４
から４７位の各種アミノ酸残基をシステインに置換した
誘導体に変換できる。

【００１９】このようにクローン化された遺伝子は、発
現に適したビークル（ベクター）中のプロモーターの下
流に連結して発現型ベクターを得ることができる。ベク
ターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例、ｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１
３）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴ
Ｐ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ
１９、ｐＳＨ１５）、あるいはλファージなどのバクテ
リオファージおよびレトロウイルス、ワクシニアウイル
スなどの動物ウイルスなどがあげられる。該遺伝子はそ
の５’末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、ま
た３’末端には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ
またはＴＡＧを有していてもよい。さらに該遺伝子を発
現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本発
明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に
用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいか
なるものでもよい。

【００２０】また、形質転換する際の宿主がエシェリキ
ア属菌である場合は、trpプロモーター、lacプロモータ
ー、rec Ａプロモーター、λＰＬプロモーター、lppプ
ロモーター、ファージＴ７φ１０プロモーターなどが、
宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモータ
ー、ＳＰＯ２プロモーター、penＰプロモーターなど、
宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧ
Ｋプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモー
ターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア属菌
でプロモーターがtrpプロモーターまたはλＰＬプロモ
ーターまたはファージＴ７φ１０プロモーターであるこ
とが好ましい。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４
０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター
などが挙げられ、とりわけＳＶ４０由来のプロモーター
が好ましい。

【００２１】このようにして構築されたムテインをコー
ドする塩基配列を有する組換えＤＮＡを含むベクターを
用いて、該ベクターを保持する形質転換体を製造する。
宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。上記エシェリキ
ア属菌の例としては、エシェリキア・コリ（Escherichi
a coli）K12DH1〔プロシージングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad.
Sci.） USA, 60, 160 (1968)〕, JM103 〔ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research) 9, 30
9 (1981)〕, JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)120,51
7 (1978)〕, ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー, 41, 459 (1969)〕, Ｃ６００〔ジ
ェネティックス（Genetics), 39, 440 (1954)〕，ＭＭ
２９４〔プロシージングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl. Acad. Sci.） US
A 73, 4174 (1976)〕, ＭＭ２９４(DE3) /pLysS〔特開
平3-43088〕などが挙げられる。

【００２２】上記バチルス属菌としては、たとえばバチ
ルス・サチルス(Bacillus subtilis)MI 114〔ジーン（G
ene), 24, 255 (1983)〕, 207-21〔ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Journal of Biochemistry) 95, 8
7 (1984)〕などが挙げられる。酵母としては、たとえば
サッカロマイセス セレビシアエ（Saccharomyces cerev
isiae AH22R, NA87-11A, DKD-5Dなどが挙げられる。動
物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７、Vero、
チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、ヒ
トＦＬ細胞などが挙げられる。

【００２３】上記エシェリキア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i.）USA,69, 2110 (1972), ジーン, 17, 107 (1982) な
どに記載の方法に従って行なわれる。バチルス属菌を形
質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジェネティックス（Molecular & General Gene
tics), 168, 111 (1979) などに記載の方法に従って行
なわれる。酵母を形質転換するには、たとえばプロシー
ジングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（Proc. Natl. Acad. Sci.） USA 75 ; 1929 (19
78) に記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質
転換するには、たとえばヴィロロジー（Virology) 52,
456 (1973) に記載の方法に従って行なわれる。このよ
うにして、ムテインをコードする塩基配列を有する組換
えＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換体が得られ
る。

【００２４】該形質転換体を培地に培養することによ
り、ムテインを産出させる。宿主がエシェリキア属菌、
バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使
用される培地としては液体培地が適当であり、その中に
は該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物
その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえば
グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、
窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩
類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉
エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有
機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン
酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられ
る。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加
してもよい。培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

【００２５】エシェリキア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔Miller, ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experi
ments in Molecular Genetics),431-433, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York 1972)〕が好ましい。こ
こに必要によりプロモーターを効率よく働かせるため
に、たとえば３β−インドリル アクリル酸やイソプロ
ピルβＤ−チオガラクトピラノシドのような薬剤を加え
ることができる。宿主がエシェリキア属菌の場合、培養
は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要によ
り、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス
属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時
間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもでき
る。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえばバークホールダー(Burkholder)最小培
地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングス・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc. Nat
l. Acad. Sci.） USA, 77, 4505 (1980)〕が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。

【００２６】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス(Science) 122, 501(1
952)〕，ＤＭＥ培地〔ヴィロロジー(Virology), 8, 396
(1959)〕, ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ
・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Th
e Journal of the American Medical Association) 19
9, 519 (1967)〕, １９９培地〔プロシーディング・オ
ブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・
メディスン（Proceeding of the Society for the Biol
ogcal Medicine)73, 1 (1950)〕などが挙げられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜
４０℃、培養時間は約１５〜６０時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。

【００２７】上記培養物からムテインを分離精製するに
は、例えば下記の方法により行うことができる。まず、
培養菌体あるいは細胞を破壊し内容物を抽出する。これ
には、フレンチプレス、超音波、リゾチーム、凍結融
解、ガラスビーズなどを用いる多数の方法があるが、ど
の方法でもよい。菌体、あるいは細胞を破壊する際に、
緩衝液中に１Ｍ〜８Ｍの尿素や、１Ｍ〜６Ｍの塩酸グア
ニジンを加えてもよく又、ジチオスレイトールなどの還
元剤を添加すると、目的とするムテインの回収率が上が
ることがある。還元剤は、リゾチームを作用させた後に
添加する。

【００２８】次に、上記細胞抽出液を、遠心分離により
上清と沈殿に分ける。上清にムテインが回収されている
場合は、たとえば、M. Iwaneらの文献〔バイオケミカル
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
（Biochem. Biophys. Res. Commun.） 146, 470-477 (1
987)〕に記載の方法と同様な方法により、有効に精製で
きる。ムテインが沈殿に回収される場合は、この沈殿を
塩酸グアニジンや尿素などの蛋白質変性剤を含む溶液で
溶解した後に、透析または希釈により変性剤の濃度を下
げれば、生理活性を有するムテインを得ることができ
る。沈殿から回収したムテインは、必要に応じて精製操
作を加えることにより、上清から回収されたムテインと
同様に高純度で高活性な製品となる。特にＣｙｓを含ん
だムテインでは精製過程、あるいは保存過程での微量な
還元剤の共存は、該製品の酸化を防ぐのに好適である。
ヒトＰＴＨは公知の手段を用いて抽出液から分離精製で
きる。分離精製手段としては、ゲルろ過、陽イオン交換
樹脂もしくは陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、分配吸着
クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーや
高速液体クロマトグラフィーが挙げられる。バチルス属
菌、酵母、動物細胞の形質転換体の培養、培養物からの
ｈＰＴＨの分離精製もそれ自体公知の方法が用いられ
る。

【００２９】本発明のヒト副甲状腺ホルモンムテイン
は、次のように医薬として有用である。 得られた誘導
体がヒトＰＴＨアゴニストである場合はカルシウム代謝
に異常のある種々の疾病、例えば骨粗鬆症、副甲状腺機
能低下症の治療剤や高血圧症の治療剤として使用でき
る。またその誘導体がヒトＰＴＨアンタゴニストである
場合は高カルシウム血症や、副甲状腺機能昴進症の治療
剤として使用できる。その投与量は、投与対象（例、ラ
ット、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ネコ、ブタ、ヒト等の
哺乳類）、疾病などを考慮し、個々の場合について適宜
決定され、体重１Kgあたり、１日１ng〜１００μgの範
囲内で適量が投与される。ｈＰＴＨは通常、薬理的に許
容され得る担体、賦形剤、希釈剤と混合され、主として
非経口的に、注射剤、結鼻剤、直腸剤、経腟剤、経皮剤
として投与されるが、場合により経口的に投与されても
よい。本ペプチドは安全に投与できる。

【００３０】また、アミノ酸残基番号３４から４７位の
領域中のアミノ酸残基をシステイン残基に置換したｈＰ
ＴＨムテインについてはシステイン残基のアミノ基側の
ペプチド結合の切断反応に付し、ｈＰＴＨの生理活性を
保持した種々の鎖長のフラグメントを製造するのに用い
ることができる。該切断反応としては、たとえば、シア
ノ化反応次いで加水分解反応またはアミノリシスが挙げ
られる。該シアノ化反応は、原料化合物に、Ｓ−シアノ
化試薬を作用させることにより行う。Ｓ−シアノ化試薬
としてはたとえば２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸
（ＮＴＣＢ），１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジ
ウム塩（ＤＭＡＰ−ＣＮ），ＣＮ~イオンなどが挙げら
れる。該Ｓ−シアノ化試薬の量は、全チオール基の約２
倍から５０倍量であればよい。より好ましくは約５倍〜
１０倍量であればよい。反応温度は約０°〜８０℃の間
であれば、いずれでもよく、約０°〜５０℃の間がより
好ましい。用いる溶媒としては、シアノ化試薬と反応し
ないものであれば、いずれの緩衝液でもよいが、例え
ば、トリス−塩酸緩衝液，トリス−酢酸緩衝液，リン酸
緩衝液，ホウ酸緩衝液，などが挙げられる。また、有機
溶媒は、シアノ化試薬と反応しないものであれば、存在
していてもよい。該反応は、ｐＨ１〜１２の間で行うの
が良い。特に、ＮＴＣＢを用いる場合にはｐＨ７〜１
０，ＤＭＡＰ−ＣＮを用いる場合にはＳ−Ｓ交換反応を
防止するため、ｐＨ２〜７の間が好ましい。また、反応
液中には、塩酸グアニジン等の変性剤が存在していても
よい。

【００３１】上記加水分解反応またはアミノリシスとし
ては、たとえばアルカリ処理に付すことが挙げられる。
該アルカリ処理としては、原料化合物を含有する水溶液
のｐＨを７〜１４に、調整することにより行われる。該
ｐＨの調整は、例えば水酸化ナトリウム，アンモニア，
置換アミノ化合物，トリツマベース〔トリス（ヒドロキ
シメチル）−アミノメタン〕，リン酸第２ナトリウム，
水酸化カリウム，水酸化バリウム等の溶液を原料化合物
を含有する水溶液に適当量加えて行う。該置換アミノ化
合物としては、上述したものが挙げられる。上記反応の
際の溶液の濃度としては、たとえば水酸化ナトリウムの
場合は約０．０１〜２Ｎ好ましくは約０．１〜１Ｎ、ア
ンモニアまたは置換アミノ化合物の場合は約０．０１〜
１５Ｎ好ましくは約０．１〜３Ｎ、トリツマベースの場
合は約１mＭ〜１Ｍ好ましくは約２０mＭ〜２００mＭ、
リン酸第２ナトリウムの場合は約１mＭ〜１Ｍ好ましく
は約１０mＭ〜１００mＭ、水酸化カリウムの場合は約
０．０１〜４Ｎ好ましくは約０．１〜２Ｎ、水酸化バリ
ウムの場合は約０．０１〜０．２Ｍ好ましくは約０．１
〜０．２Ｍが挙げられる。反応温度は約０°〜８０℃の
間であればいずれでもよく、約０°〜５０℃の間がより
好ましい。反応時間は、好ましくは、シアノ化反応は約
１〜６０分好ましくは約１５〜３０分が、加水分解反応
は約５分〜１００時間好ましくは約１０分〜１５時間
が、アミノリシスは約５分〜２４時間好ましくは約１０
〜１８０分が挙げられる。

【００３２】上記のシアノ化および加水分解またはアミ
ノリシスにより、図１に示される反応が起こると考えら
れる。図１において、ＸはＯＨまたはＲ−ＮＨ−（Ｒ−
ＮＨ−はアミノまたは置換アミノ基を示す。）を示す。
該反応において、アンモニアまたは置換アミノ化合物を
用いた場合には、対応するアミド化合物または置換アミ
ド化合物が得られる。

【００３３】切り出されたペプチドフラグメントを単離
するには、通常知られているペプチドの精製法に従えば
よい。例えば、ゲル濾過法，イオン交換クロマトグラフ
ィー，高速液体クロマトグラフィー，アフイニティーク
ロマトグラフィー，疎水クロマトグラフィー，薄層クロ
マトグラフィー，電気泳動等を適宜組み合せて行うこと
ができる。ここで得られるペプチドフラグメントのＮ末
端には翻訳開始コドンに由来するメチオニンが付加して
いる場合がある。また、得られるペプチドフラグメント
は、必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることも
できる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール、マンニト
ール、デキストロース、マルトース、トレハロース、グ
リセロールなどの安定化剤を加えることができる。

【００３４】

【作用】本発明ではヒトＰＴＨ（１−８４）およびその
Ｎ末端部アミノ酸配列を欠如したアンタゴニストについ
て、それぞれの遺伝子を特定部位指向性変異操作に付
し、得られた改変遺伝子の発現により、メチオニン残基
を他の脂溶性アミノ酸に変換することによって抗酸化型
ムテインとし、安定に保存することができる。さらにポ
リペプチド鎖中間部の種々のアミノ酸残基をシステイン
に変換したムテインを作製し、このシステインの側鎖に
シアノ基を導入しペプチド鎖切断の反応に付し、種々の
鎖長のＰＴＨ活性フラグメントを得ることができる。こ
のシステインに変換したムテインは２量体を形成するこ
とが可能であり、またシステイン残基の側鎖に種々の置
換基（例えば炭素数１〜２０の脂溶性アルキル基）を導
入することにより、ヒトＰＴＨアゴニストムテイン、ア
ンタゴニストムテインを安定化させ、活性を高め、さら
には組織への吸収性を向上させる事が出来る。このよう
に本発明は臨床応用上、有用なヒトＰＴＨムテインを提
供するものである。

【００３５】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commis
ion on Biochemical Nomenclature による略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例
を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありう
る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとす
る。ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸 Ａ ： アデニン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ ： シトシン ＲＮＡ ： リボ核酸 ｄＡＴＰ： デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ： デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ： デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ： デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ： アデノシン三リン酸 Ｔｄｒ ： チミジン ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニルアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン。

【００３６】

【実施例】以下の参考例および実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。後述の実施例で得られた形質転換体 エシ
ェリヒア コリ ＭＭ294(DE3）/ｐＥ−Ｌ８ＰＴＨおよび
エシェリヒア コリ ＭＭ294(DE3）/ｐＥ−Ｃ３５ＰＴＨ
は財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に各々ＩＦＯ １５２
１４，ＩＦＯ １５２１３として１９９１年８月７日よ
り、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲ
Ｉ）にブダペスト条約に基づき各々ＦＥＲＭ ＢＰ−３
５０７およびＦＥＲＭＢＰ−３５０８として１９９１年
８月２２日より寄託されている。同様に、エシェリヒア
コリ ＭＭ294(DE3）/ｐＥ−Ｌ８ＰＴＨ（７−８４）は
ＩＦＯに１９９２年６月３日よりＩＦＯ １５３３とし
て、またＦＲＩに１９９２年６月８日よりブダペスト条
約に基づきＦＥＲＭ ＢＰ−３８８６として寄託されて
いる。

【００３７】

【参考例１】ＤＮＡオリゴマーの合成 構造遺伝子ＤＮＡ断片(＃１−ｃ，＃２−ｃおよび＃３
〜＃14、図３）（配列番号：38,39,44〜55）および特定
部位指向性変異誘発のためのプライマーＡ，Ｂ（配列番
号９，13）は適当に保護されたＤＮＡ β-シアノエチル
ホスホアミダイトを原料とし、アプライドバイオシステ
ムズ社、モデル380Ａ・ＤＮＡ自動合成装置を用いて合成
した。合成のプロトコールはアプライドバイオシステム
ズ社指定のものを用いた。合成した保護ＤＮＡオリゴマ
ー・樹脂を、0.2μmoleの樹脂に対し濃アンモニア水２m
ｌ中で60℃、６時間加熱した。得られた生成物を逆相高
速液体クロマトグラフィー（以下HPLCと略記）で精製
し、５’末端水酸基のみがジメトキシトリチル基で保護
されたＤＮＡオリゴマーを得た。これを80％酢酸２m
ｌ、20分間処理し５’末端のジメトキシトリチル基を除
去し、生成物を逆相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣで精
製した。

【００３８】

【参考例２】ＤＮＡオリゴマーのリン酸化 参考例１で得られたＤＮＡオリゴマーのうち５’末端に
なるべき＃１-c（配列番号：38），＃14（配列番号：5
5）を除いた12種のＤＮＡオリゴマー（＃２−ｃ，＃３
〜＃13）(配列番号:39,44〜54）各々を25μｌのリン酸
化反応液〔ＤＮＡオリゴマー10μg，50mM Tris-HCl，pH
7.6，10mM MgCl₂，1mMスペルミジン,10mMジチオスレイ
トール(以後DTTと略記)，0.1ｍｇ/mｌウシ血清アルブミ
ン(以後BSAと略記),１mM ATP，10ユニットＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造)〕中で37℃ １時間反応さ
せ、５’末端をリン酸化した。この反応液を65℃で10分
間処理し、次いで凍結、融解後、次の反応に用いた。特
定部位指向性変異誘発に用いるプライマーも同様にリン
酸化した。

【００３９】

【参考例３】特定部位指向性変異誘発を行うためのヒト
ＰＴＨ遺伝子を含むプラミスミドｐＵ−ＰＴＨの構築 ヒトＰＴＨのＤＮＡが組み込まれたプラスミドｐＥ−Ｐ
ＴＨ（ヨーロッパ特許出願公開第４８３５０９号公報参
照）からＢａｍＨＩとＸｂａＩとで消化することにより
ヒトＰＴＨのＤＮＡおよびｐＥＴ３ｃの発現プロモータ
ーを含む０．３キロベースのＤＮＡ断片を得た。次に、
一本鎖調製用プラスミドベクターｐＵＣ１１８をＢａｍ
ＨＩとＸｂａＩにより消化し、上述のヒトＰＴＨ遺伝子
を含むＤＮＡ断片と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連
結した。連結したＤＮＡを用いて大腸菌ＭＶ１１８４を
形質転換し、Ｘｇａｌを指示種とするプレート上に播
き、正しくヒトＰＴＨ遺伝子がｐＵＣ１１８に挿入され
た組換えプラスミドｐＵ−ＰＴＨをファージ粒子の形で
培地に放出する。この一本鎖ＤＮＡを精製して、部位指
向性変異誘発の鋳型として用いた。なお、ここで用いた
大腸菌ＭＶ１１８４、ヘルパーファージＫ０７は、J. V
ieira，J. Messing，メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー（Methods in Enzymology），153，３−11 (1987)に
記載されている

【００４０】。

【参考例４】〔Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−８４）からｈ
ＰＴＨ（１−３４）ＯＨの製造 後述の実施例２で得られた〔Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−
８４）４．７６ｍｇを２．４ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸
塩（以下Ｇｕ−ＨＣｌと略記することがある）−０．２
Ｍ トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、上記
緩衝液０．１ｍｌに溶かした０．１５４ｍｇのジチオス
レイトールを加えて、室温で３０分放置した。これに
０．１ｍｌの同緩衝液に溶かした１．６４６ｍｇのＮＴ
ＣＢを加え、直ちにｐＨを８．０に調整し、室温で１５
分間反応させた。反応終了後、２．５ｍｌの酢酸を加
え、セファデックスＧ−２５（Sephadex Ｇ−２５）を
用いるゲルろ過により脱塩した。ゲルろ過条件は、カラ
ムサイズ ２．６×３７ｃｍ、検出波長２８０ｎｍ；溶
媒 １０％酢酸；流速 ２０ｍｌ／ｈであった。〔ＳＣＮ
−Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−８４）を含む画分を集め、
凍結乾燥後、切断反応に使用した。ｈＰＴＨ（１−３
４）ＯＨを得るための切断反応は以下のように行なっ
た。２００μｇの〔ＳＣＮ−Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−
８４）を２００μｌの６Ｍ−Ｇｕ−ＨＣｌ−０．１Ｍホ
ウ酸緩衝液中、３７℃、１７時間反応させ、等量の氷酢
酸を加えて反応を停止させた。得られた反応液について
逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析した（図３
０）。分析条件はカラム，ＹＭＣＡ−３０３ ＯＤＳ
４．６×２５０ｍｍ；カラム温度 ２５℃；溶出溶媒
Ａ，０．１％トリフルオロ酢酸−９９．９％蒸留水；溶
出溶媒Ｂ，０．１％トリフルオロ酢酸−９９．９％アセ
トニトリル；溶出プログラム０分（７５％Ａ＋２５％
Ｂ），４０分（６０％Ａ＋４０％Ｂ），４５分（２０％
Ａ＋８０％Ｂ）；溶出速度０．７ｍｌ／ｍｉｎ；検出波
長２３０ｎｍであった。図中、矢印で示した保持時間約
３５分のピークがペプチド研究所（日本）から購入した
標準ｈＰＴＨ（１−３４）ＯＨの溶出時間と一致した。
このピーク画分を分取し、種々の蛋白化学的分析を実施
した。なお、本逆相高速液体クロマトグラフィーの溶出
条件では切断産物のうちＣ末端側フラグメントは素通り
画分に溶出された。塩酸加水分解法（チオグリコール酸
存在下、減圧封管中、１１０℃、２４時間、５．７Ｎ塩
酸加水分解）に付し、６３８０型アミノ酸分析計（ベッ
クマン社）で分析したｈＰＴＨ（１−３４）ＯＨのアミ
ノ酸組成値は表１の通りであり、これらの値はｈＰＴＨ
（１−３４）ＯＨの理論値とよく一致していた。さらに
得られたｈＰＴＨ（１−３４）ＯＨのカルボキシル末端
アミノ酸、Ｐｈｅ³⁴がラセミ化していない事を以下の方
法で確かめた。

【００４１】アミノ酸分析に用いた加水分解物を試料と
して用い、オルトフタルアルデヒドにより、加水分解物
中の全てのアミノ酸をプレラベルした。カラムにはＹＭ
ＣＡ−３０３ ＯＤＳ（４．６×２５０ｍｍ）を用い、
逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析した。溶出
溶液は５０ｍＭ酢酸ナトリウム−４０％メタノールであ
った。その結果、加水分解物中のＰｈｅは全てＬ−Ｐｈ
ｅとして検出され、Ｄ−Ｐｈｅのピークは全く検出され
なかった。また、得られたｈＰＴＨ（１−３４）ＯＨの
分子量をＦＡＢ−ＭＳ（fast atom bombardment mass s
pectrometry）により測定した結果、mass（m／z）：
（Ｍ＋Ｈ)+＝４１１６．８が観測され、理論値４１１
８．１との差は誤差範囲であった。

【００４２】

【表１】 得られたｈＰＴＨ（１−３４）ＯＨのアミノ酸組成 実験値 理論値 Ａｓｐ＆Ａｓｎ ４．００ ４ Ｓｅｒ ２．５９ ３ Ｇｌｕ＆Ｇｌｎ ５．０１ ５ Ｇｌｙ １．１４ １ Ｖａｌ ２．８４ ３ Ｍｅｔ １．９４ ２ Ｉｌｅ ０．８５ １ Ｌｅｕ ４．８４ ５ Ｐｈｅ ０．８７ １ Ｌｙｓ ２．９４ ３ Ｈｉｓ ２．５８ ３ Ｔｒｐ ０．６５ １ Ａｒｇ １．７９ ２

【００４３】

【参考例５】〔Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ(１−８４)からｈＰ
ＴＨ(１−３４)ＮＨ₂の製造 〔Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−８４）のＣｙｓ³⁵のＳ−シ
アノ化はジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティ・
ケミカル・コミュニケーション（J. C. S. Chem. Com
m.）1967，21〜22に順じて、以下のように行なった。
８．４０ｍｇの〔Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ(１−８４)を３．
７８ｍｌの７Ｍ Ｕｒｅａ−０．１Ｍ酢酸アンモニウム
（ｐＨ３．５）に溶解し、２５℃、１５分間放置したの
ち、５９２μｇの１−シアノ−４−ジメチルアミノ ピ
リジニウム フルオロボレイトを０．４２ｍｌの上記緩
衝液に溶かして加えた。室温で１５分間反応させ、反応
終了後、直ちにセファデックスＧ−２５（Sephadex Ｇ
−２５）カラムを用いて脱塩した。カラム条件は、カラ
ムサイズ ２．６×３７ｃｍ、溶出溶媒 １０％酢酸；流
速２０ｍｌ／ｈ；検出波長２８０ｎｍであった。〔ＳＣ
Ｎ−Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−８４）を含む画分を集
め、凍結乾燥した。収量は７．５ｍｇであった。これを
用いて以下の切断反応を行った。２００μｇの〔ＳＣＮ
−Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−８４）を２００μｌの３Ｍ
−アンモニア水に溶解し、３７℃で１０分反応させた。
得られた反応液について、参考例４で示した分析条件で
逆相高速液体クロマトグラフィーを行なった。図３１に
示したように、〔ＳＣＮ−Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−８
４）は完全に消失し、保持時間３２分にショルダーを持
つ１つのピークが観察された。このピークのうち主ピー
ク部分が固相合成した標準ｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨ₂
の溶出位置と一致した。なお、切断産物のうちＣ末端側
フラグメントはこの分析条件では素通り画分に溶出され
た。

【００４４】

【参考例６】〔Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ(１−８４)からｈＰ
ＴＨ(１−３４)ＮＨＣ₂Ｈ₅の製造 参考例４で得られた〔ＳＣＮ−Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１
−８４）２００μｇを５００μｌの３．１Ｍエチルアミ
ンに溶解し、３７℃で２０分間反応させ、反応終了後等
量の氷酢酸を加えて反応を停止させた。得られた反応液
について逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析し
た。分析条件は参考例３に示した。図３２に示したよう
に、〔ＳＣＮ−Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−８４）はほぼ
消失し、主に２つのピークが検出された。保持時間３１
分および３６分に溶出されたピークをそれぞれピーク７
およびピーク８と名づけ、分取し、蛋白化学的分析を実
施した。参考例３に述べた方法に従って分析したピーク
８画分のアミノ酸組成値は表２のとおりであり、これら
の値はｈＰＴＨ(１−３４)ＮＨＣ₂Ｈ₅の理論値とよく一
致していた。さらにピーク８のカルボキシ末端アミノ酸
Ｐｈｅ³⁴について、アミノ酸分析に用いた加水分解物を
試料として用い、Ｄ，Ｌ体のいずれであるかを分析し
た。分析はオルトフタルアルデヒドにより全てのアミノ
酸をプレラベルしたのち、ＹＭＣＡ−３０３ ＯＤＳ
（４．６×２５０ｍｍ）カラムを用いる逆相高速液体ク
ロマトグラフィーにより行なった。溶出溶媒は５０ｍＭ
酢酸ナトリウム−４０％メタノールであった。その結
果、加水分解物中のＰｈｅは全てＬ−Ｐｈｅとして検出
され、Ｄ−Ｐｈｅのピークは全く検出されなかった。ま
た、得られたｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨＣ₂Ｈ₅の分子量
をＦＡＢ−ＭＳにより測定した結果、mass（m／z）：
（Ｍ＋Ｈ)+＝４１４４．９が観測され、理論値４１４
３．２との差は誤差範囲であった。ピーク７画分につい
ても同様にアミノ酸分析を行った。得られた値は〔ＳＣ
Ｎ−Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−８４）の組成比とほぼ一
致していた。原料である〔ＳＣＮ−Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ
（１−８４）は保持時間約３５分に溶出されることか
ら、ピーク７は〔ＳＣＮ−Ｃｙｓ³⁵〕ｈＰＴＨ（１−８
４）のＳ−シアノ基がβ脱離して生じた〔デヒドロアラ
ニン³⁵〕ｈＰＴＨ（１−８４）であることが示唆され
た。β脱離反応は切断反応と競争して起こることが Y.
Degani，A. Patchornik らによって報告されている〔バ
イオケミストリー（Biochemistry）13，１〜11（197
4）〕。なお、切断産物のうちのＣ末端側フラグメント
は、本分析条件では素通り画分に溶出された。

【００４５】

【表２】 得られたｈＰＴＨ（１−３４）ＮＨＣ₂Ｈ₅のアミノ酸組成 実験値 理論値 Ａｓｐ＆Ａｓｎ ４．０１ ４ Ｓｅｒ ２．７４ ３ Ｇｌｕ＆Ｇｌｎ ５．２２ ５ Ｇｌｙ １．３５ １ Ｖａｌ ２．７４ ３ Ｍｅｔ ２．０９ ２ Ｉｌｅ ０．９１ １ Ｌｅｕ ４．８６ ５ Ｐｈｅ １．００ １ Ｌｙｓ ２．８９ ３ Ｈｉｓ ２．５８ ３ Ｔｒｐ ０．７５ １ Ａｒｇ １．４３ ２ エチルアミン １．５８ １

【００４６】

【実施例１】ヒトＰＴＨ（５−８４）をコードする遺伝
子の製造とその発現 （１）ＤＮＡフラグメントの連結(図４参照) ヒトＰＴＨ（５−８４）遺伝子の２重鎖構成の１連の段
階は図４に示した通りである〔図中左端に突起のある棒
（・─）印は５'末端水酸基がリン酸化されていることを
示す〕。図３の12種（ＤＮＡフラグメント＃２−ｃおよ
び＃３から＃13（配列番号：39，44〜54）に各々対応す
る）のＤＮＡフラグメントのリン酸化反応液５μｌずつ
と５’末端に相当するＤＮＡフラグメント＃１-ｃ（配
列番号：38），＃14（配列番号：55）各々２μｇを混
ぜ、70μｌとした。これに５ユニットのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造）を加え、15℃で20時間インキュベートし
た。これを８％アクリルアミドゲルを用いて、緩衝液
（pH8.3）〔100mM Tris-HCl,100mMホウ酸、2mM EDTA〕
中、125Ｖで２時間電気泳動にかけた。泳動後、0.6ｍｇ
／ｌのEtBrでゲルを染色し、263bpのＤＮＡ断片を含む
ゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動用緩衝液内に沈
め、ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出した。この透析
チューブ内液についてフェノール処理を２回行ったの
ち、水層（上層）を回収し、２倍量のエタノールを加
え、−70℃に冷却した後、遠心でＤＮＡを沈殿させた。
このようにして約１μｇのＤＮＡフラグメントが得ら
れ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）によるリ
ン酸化を行ったのち、以下の実験（２）に供された。

【００４７】（２）ヒトＰＴＨ（５−８４）遺伝子のク
ローニング（図５） クローニングベクターには大腸菌のプラスミドpBR322由
来のpUC19〔Messing.J.，ジーン(Gene)，33 103-109（1
985)〕を使用した。pUC19 ＤＮＡを20μｌの反応液〔20
mM Tris-HCl，pH7.6,7mM MgCl₂，150mM NaCl，10mM 2-
メルカプトエタール，20ユニットのNdeＩ(ニューイング
ランド・バイオラボ社)，15ユニットのBamHＩ(宝酒
造)〕中、37℃、24時間反応させた後、水で５倍稀釈
し、65℃で20分間処理し、酵素を失活させた。この反応
液５μｌと上記（１）で得られた約５当量のＤＮＡフラ
グメントを混合し、50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgC
l₂，10mM DTT, １mM スペルミジン，0.1ｍｇ／mｌ BSA
および１mM ＡＴＰを含む20μｌの反応液として、14
℃、15時間Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・
バイオラボ社製）を作用させて、ヒトＰＴＨ（５−８
４）遺伝子をプラスミドに結合させた。この反応液を用
い、既知の方法に従い、大腸菌ＪＭ109株〔Messing.J.
ジーン(Gene), 33 103-119(1985)〕を形質転換させた。
すなわち、−70℃で保存していた50μｌのコンピテント
セル〔Hanahan,D.,ジャーナル オブ モレキュラー バイ
オロジー(J.Mol.Biol.)，166，557(1983)〕を０℃、15
分間インキュベートした後、10μｌの上記反応液を添加
した。さらに０℃、30分間インキュベートした後、42℃
で1.5分間、さらに０℃で２分間インキュベートした。
この反応液に200μｌのＬＢ倍地(1リットル当りバクト
トリプトン10ｇ、バクトイースト抽出物５ｇ、NaCl ５
ｇを含む)を加え、37℃、１時間インキュベートした。
この大腸菌を50μｇ/mｌのアンピシリン,100μg/mｌ X-
Gal,0.1mM ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地上にまき、37℃
で１晩培養した。生じたアンピシリン耐性コロニー中、
β-ガラクトシダーゼ欠損の14株を選び、この転換株の
プラスミドＤＮＡをアルカリ法〔Maniatis,T.ら、モレ
キュラー クローニング（Molecular Cloning（Cold Spr
ingHarbour)、368-369（1982）〕により粗精製し、Nｃo
ＩおよびＢamＨＩ消化、さらにNdeＩおよびBamHＩ消化
した。これら消化物の1.7％アガロースゲルでの泳動パ
ターンから、１株が正しくヒトＰＴＨ（５−８４）遺伝
子（配列番号：28，29）の挿入されている転換株である
ことがわかった。

【００４８】（３）ヒトＰＴＨ（５−８４）の発現用プ
ラスミドの構築ならびに形質転換体の製造（図５） ｉ）上記実験（２）で得られた約10μｇのpU-PTH(5-84)
-19を反応液〔150mM NaCl,20mM Tris-HCl（pH7.8),７mM
MgCl₂，10mM 2-メルカプトエタノール，40ユニットNde
Ｉ,20ユニットBamHＩ（宝酒造)〕中、37℃、５時間反応
させた後、1.7％アガロースゲル電気泳動により263bp
ＤＮＡ断片を常法に従って精製した。一方、発現用ベク
ターにはpET3C〔Stadier,F.W.ら、メソッズ イン エン
ザイモロジー（Methods in Enzymology), 195 60-89(19
90)〕を使用した。pET3C ＤＮＡを上記と同様にして、N
deＩ及びBamHＩ消化し、この反応液に４倍量の水を加
え、65℃で20分間加熱し、酵素を失活させた。この様に
して得た263bp ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは各々、
両端にNdeＩ消化およびBamHＩ消化により生じた単鎖の
付着端を有する。これら両者を混合し、50mM Tris-HC
l，pH7.6，10mM MgCl₂，10mM DTT，１mMスペルミジン0.
1ｍｇ／mｌ BSAおよび１mM ATP存在下、14℃，16時間Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ
社）を作用させてＤＮＡを結合し、前出と同様な方法で
大腸菌ＪＭ109株を形質転換させた。次にこの大腸菌を5
0μｇ/mｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にま
き、37℃で１日培養した。生じたアンピシリン耐性コロ
ニーを選んだ。さらに転換株のプラスミドＤＮＡをNde
Ｉ-BamHＩ，Bgl II-BamHＩ，EcoRＩ-NdeＩ，AvrII-Bgl
IIなどの制限酵素の組み合わせで消化し、ポリアクリル
アミド電気泳動のパターンから、正しくｈＰＴＨ遺伝子
を含む形質転換株を選択した。この様にして得た発現用
プラスミドをＰＥ−ＰＴＨ（５−８４）と、また形質転
換株をエシェリヒア コリＪＭ109／ｐＥ−ＰＴＨ（５
−８４）と名づけた。

【００４９】ii）ｉ）で得られたＪＭ109/ＰＥ−ＰＴＨ
（５−８４）よりプラスミドＤＮＡを単離、粗精製し
て、エシェリヒア コリＭＭ294にＴ７ファージのＲＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３
〔Studier, F. W. ら、ジャーナル オブ モレキュラー
バイオロジー(J.Mol.Biol.)，189，113(1986)〕を溶原
化させて作製したエシェリヒア コリＭＭ294（ＤＥ
３）を形質転換した。まず大腸菌ＭＭ294（DE3)１白金
耳をＬＤ培地10mｌに接種し、37℃でクレットが60から1
80の間になるまで振盪培養した。この培養液50mｌに10
％W/Vポリエチレングリコール、5％v/vジメチルスルホ
キシドおよび50mM MgCl₂(pH6.5)を加え、反応液が100μ
ｌになるようにＬＢ培地を加えた。これにプラスミドＤ
ＮＡ10ｍｇを加え４℃で10分間インキュベートした後、
50μｇ/mｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上にま
き、37℃で一夜培養した。生じたコロニーから前述と同
様にして得たプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化し、そ
の電気泳動パターンよりｈＰＴＨ遺伝子を含む形質転換
株を選び、これをエシェリヒア コリ ＭＭ294(DE3）/ｐ
Ｅ−ＰＴＨ（５−８４）と名づけた。 （４）ヒトＰＴＨ（５−８４）の発現 エシェリヒア コリ ＭＭ294(DE3）/ｐＥ−ＰＴＨ（５−
８４）を50μｇ/mｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中、
37℃で一晩振盪培養した。この培養液100μｌを200mｌ
のフラスコに分注した10mｌの同じ培地に加え、37℃で
クレット値が約170になるまで培養した後、イソプロピ
ル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG）を加えて、0.1
mMとなるようにした。さらに２時間培養を続けた後、こ
の培養液１mｌを15000rpm、４℃、５分間遠心分離し、
得られた菌体を、0.5M Tris.HCl(pH6.8)、10％グリセロ
ール、10％(W/V)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、β-メ
ルカプトエタール0.1％(W/V)、ブロモフェノールブルー
の入った水溶液100μｌ〔Laemmli，U.K，ネイチャー（N
ature）,227 680（1970)〕に溶かし３分間煮沸後、16％
SDSポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)に付した。泳動
の後ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色したとこ
ろ、標準品ｈＰＴＨとほぼ同じ移動度を示す濃いバンド
が観察された（図１３参照）。レーン１〜５は、各々レ
ーン１：分子量マーカー、レーン２：ＩＰＴＧを添加し
たプラスミドｐＥ−ＰＴＨ（５−８４）を保持する大腸
菌株培養液（１０μｌ）、レーン３：ＩＰＴＧを添加し
ないプラスミドｐＥ−ＰＴＨ（５−８４）を保持する大
腸菌株培養液（１０μｌ）、レーン４：ＩＰＴＧを添加
したヒトＰＴＨ発現株培養液（１０μｌ）、レーン５：
ＩＰＴＧを添加しないヒトＰＴＨ発現株培養液を示す。
ゲルの染色における標準品との量的比較より、ヒトＰＴ
Ｈ（５−８４）は１リットル培養液に換算して約100ｍ
ｇ発現していた。このようにして図６に示すアミノ酸配
列を有するヒトＰＴＨ（５−８４）（配列番号２１）が
得られた。

【００５０】

【実施例２】〔Ｃｙｓ³⁵〕ヒトＰＴＨ（１−８４）をコ
ードする遺伝子の製造とその発現 （１）〔Ｃｙｓ³⁵〕ヒトＰＴＨ（１−８４）をコードす
る遺伝子の製造（図７参照） まず、３５位のＶａｌのコドンをＣｙｓのコドンに変換
するためにオリゴヌクレオチドプライマーＡ：CACAATTT
TTGCGCCTTAGGTGC（配列番号１３）を合成した。Ｔ４キ
ナーゼ処理により５’ＯＨ末端をリン酸化した上記合成
オリゴヌクレオチド（４ピコモル）と、先に記した一本
鎖状のｐＵ−ＰＴＨ（５μｇ）を用いて、特定部位指向
性変異誘発キット（アマシャム社：オリゴヌクレオチド
・ディレクテッド・インビトロ・ミュータジェネシス・
システム・バージョン２）により、変異を導入したプラ
スミドを得た。このプラスミドで常法により大腸菌ＭＶ
１１８４を形質転換し、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む２倍ＹＴ培地寒天プレートに播いて３７℃、１
５時間培養し、多数のコロニーを得た。そのうち１０ケ
のコロニーから少量の菌体を取って０．３ｍｌの２倍Ｙ
Ｔ培地で約５時間培養した。この培養液３０μｌとヘル
パーファージＫ０７を含む溶液３０μｌを混合して３７
℃に１時間静置し、３ｍｌの２倍ＹＴ培地を加えて一晩
培養した。培養液を遠心操作で上清と菌体に分け、菌体
からはプラスミドをアルカリ法で粗精製し、上清から
は、常法によりファージ粒子として存在する一本鎖ＤＮ
Ａを回収した。前述のオリゴヌクレオチドプライマーＡ
には、鋳型となるヒトＰＴＨをコードする遺伝子中に存
在しなかった制限酵素ＨｈａＩ認識部位が含まれてい
る。したがって、正しく変異が導入されたプラスミドに
ＨｈａＩを作用させると、変異により新たに生じたＨｈ
ａＩ部位とｐＵＣ１１８に始めから存在するＨｈａＩ部
位の２５ケ所で切断され、２６０塩基対の断片が生じる
はずである。前述の１０ケのコロニーから得たプラスミ
ドをＨｈａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分析
したところ、４つのクローンで正しい大きさの断片が見
られた。さらに、この２つのクローンの一本鎖状プラス
ミドを鋳型として、アプライドバイオシステムズ社、モ
デル３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を
分析した結果、目的とする変異が導入されていることを
確認した（図９）（配列番号５６）。こうして得られた
〔Ｃｙｓ³⁵〕ヒトＰＴＨをコードする遺伝子（図９）を
含むプラスミドをｐＵ−Ｃ３５ＰＴＨと称する。

【００５１】（２）大腸菌での発現用プラスミドｐＥ−
Ｃ３５ＰＴＨの構築（図８参照） （１）で得られたｐＵ−Ｃ３５ＰＴＨを制限酵素Ｘｂａ
ＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ムテイン〔Ｃｙｓ³⁵〕
ヒトＰＴＨをコードする約０．３ｋｂｐの断片を得た。
これをアガロースゲル電気泳動で精製した後、前もって
制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化しておいた発現用
プラスミドベクターｐＥＴ３ｃ〔F. W.Stadier ら、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol
ogy），１９５，６０−８９（１９９０）〕に、Ｔ４リ
ガーゼにより結合させた。こうして得られた発現用プラ
スミドをｐＥ−Ｃ３５ＰＴＨと称する。大腸菌ＭＭ２９
４株に、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組
み込んだλファージＤＥ３〔F. W. Stadier ら、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Bio
l.) １８９，１１３−１３０（１９８６）〕を溶原化さ
せ、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）株を作成した。該プラ
スミドｐＥ−Ｃ３５ＰＴＨを用いて大腸菌ＭＭ２９４
（ＤＥ３）を形質転換することにより、図９に示すムテ
インをコードする遺伝子を含有するプラスミドを持つ菌
体ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＥ−Ｃ３５ＰＴＨを得た。

【００５２】（３）〔Ｃｙｓ³⁵〕ヒトＰＴＨの製造 ｉ）エシェリヒア コリ ＭＭ294(DE3）/ｐＥ−Ｃ３５Ｐ
ＴＨを50μｇ/mｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌ
中、37℃で一晩振盪培養した。この培養液100μｌを200
mｌのフラスコに分注した10mｌの同じ培地に加え、37℃
でクレット値が約170になるまで培養した後、イソプロ
ピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG）を加えて、
0.1mMとなるようにした。さらに２時間培養を続けた
後、この培養液１mｌを15000rpm、４℃、５分間遠心分
離し、得られた菌体を、0.5M Tris.HCl(pH6.8)、10％グ
リセロール、10％(W/V)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、
β-メルカプトエタール0.1％(W/V)、ブロモフェノール
ブルーの入った水溶液100μｌ〔Laemmli，U.K，ネイチ
ャー（Nature）,227 680（1970)〕に溶かし３分間煮沸
後、16％SDSポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)に付し
た。泳動の後ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色
したところ、標準品ヒトＰＴＨと同じ移動度を示す濃い
バンドが観察された（図１４参照）。図１４における各
レーンは各々、レーン１：ヒトＰＴＨ（１μg)、レーン
２：ＩＰＴＧを添加後のプラスミドｐＥ−Ｃ３５ＰＴＨ
を保持しない大腸菌株の培養液（１０μｌ）、レーン
３：ＩＰＴＧを添加後のプラスミドｐＥ−Ｃ３５ＰＴＨ
を保持する大腸菌株培養液（１０μｌ）のものを示す。
また別のゲルをヒトＰＴＨ抗体を用いたウエスタンブロ
ッティングに付した結果、ここでも標準ヒトＰＴＨと同
じ染色パターンが得られた（図１５参照）。図１５にお
ける各レーンの対象は図１４のものと同様である。ゲル
の染色における標準品との量的比較より、〔Ｃｙｓ³⁵〕
ヒトＰＴＨは１リットル培養液に換算して約200ｍｇ発
現していた。

【００５３】ii) Ｅ．ｃｏｌｉ内に蓄積された〔Ｃｙ
ｓ³⁵〕ヒトＰＴＨを以下のようにして精製した。上記と
同様にして得られた培養液200mlからの菌体を８Ｍ尿
素、50ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、50ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、20ｍＭ ２−メルカプトエタノール（以下２−
ＭＥと略す）１ｍＭ α−トルエンスルホニル フルオラ
イドを含有する緩衝液（５ｍｌ)に懸濁し、氷冷下で激
しく撹拌し(約１時間)、菌体を破壊した。15000ｒｐ
ｍ、４℃、20分間遠心分離し、上清を集め、沈殿につい
て同じ組成の緩衝液（３ｍｌずつ）で同様の抽出操作を
２度行なった。上清液を合わせ、２倍に希釈し、この液
を、４Ｍ尿素と10ｍＭ ２−ＭＥを含む50ｍＭ酢酸アン
モニウム緩衝液（ｐＨ５）で平衡化した、ＴＳＫ−ゲ
ル、ＣＭ−トーヨーパールのカラム（東ソー）（10ｍ
ｌ）に通し、目的物を吸着させた、４Ｍ尿素と10ｍＭ
２−ＭＥを含む、50ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
５）でカラムを洗浄し（約10ｍｌを要した）、280ｎｍ
における吸収がなくなったら、10ｍＭ ２−ＭＥを含む5
0ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５）緩衝液50ｍｌ−0.5Ｍ
酢酸アンモニウム（ｐＨ６）緩衝液50ｍｌを用いた直線
濃度勾配法でカラムを展開した（流速:10ｍｌ／時間、
１フラクション２ｍｌ）。フラクション35−43を集め、
これを凍結乾燥した。これを以下の条件の逆相高速液体
クロマトグラフィーに付した。カラム、ＹＭＣ−パック
Ａ−３２５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ（１×30ｃｍ）
（ワイ・エム・シー製）；溶媒，0.1％トリフルオル酢
酸を含む、25％から50％までのアセトニトリルによる直
線濃度勾配法（30分間）；流速、３ｍｌ／分。目的物の
ピーク（保持時間17.0分）を分取した。得られた溶出液
をＢｉｏ−Ｒａｄ ＡＧ１×８（酢酸型）（Bio-Rad lab
oratory）のカラムに通し洗液も合わせアセトニトリル
を留去した後、凍結乾燥した。目的のｈＰＴＨが白色粉
末として3.6ｍｇ得られた。

【００５４】本標品は以下の諸分析結果より、高純度の
〔Ｃｙｓ³⁵〕ヒトＰＴＨであることが示された。 ａ）逆相ＨＰＬＣにて鋭い単一ピークを示した（図16参
照）。カラム：ＹＭＣ−パックＡ−３０３ Ｓ−５ ＯＤ
Ｓ １２０Ａ φ4.6×250ｍｍ；溶出液：Ａ（0.1％トリ
フルオル酢酸、以下ＴＦＡと略記することがある）、Ｂ
（0.1％トリフルオル酢酸を含むアセトニトリル）；濃
度勾配：０−30分（30−38％，Ｂ）、流速１ml／分。 ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでもヒトＰＴＨと同じ移動度の単
一バンドを示した（図17参照）。各レーンは、レーン
１：分子量マーカー、レーン２：ヒトＰＴＨ、レーン
３：〔Cys³⁵〕ヒトＰＴＨのものを示す。 ｃ）アミノ酸分析（チオグリコール酸存在下、減圧封管
中、110℃、24時間、5.7Ｎ塩酸加水分解、カッコ内は理
論値を示す）：Ａsｐ（10），10.33；Ｔｈｒ（１），0.
91；Ｓｅｒ（７），6.10；Ｇｌｕ（11），11.82；Ｐｒ
ｏ（３），3.00；Ｇｌｙ（４）4.44；Ａｌａ（７），6.
91；Ｃｙｓ（１），1.11；Ｖａｌ（７），6.60；Ｍｅｔ
（２），2.11；Ｉｌｅ（１），1.01；Ｌｅｕ（10），1
0.83；Ｐｈｅ（１），1.10；Ｌｙｓ（９），9.32；Ｈｉ
ｓ（４），3.75；Ａｒｇ（５），5.21；Ｔｒｐ（１），
0.93（回収率84.2％、Ｃｙｓは過蟻酸酸化後の加水分解
物の分析値） ｄ）アプライドバイオシステムズ社 気相シークエンサ
ー モデル４７０ＡによりＮ末端アミノ酸配列分析で、
１位Ｓｅｒから15位Ｌｅｕまでの配列が正しいものであ
る事が示された。このようにして３５位バリンがシステ
インに置換された図９に示すアミノ酸配列（配列番号５
６）を有するムテインが得られた。

【００５５】

【実施例３】〔Ｌｅｕ¹⁸〕ヒトＰＴＨ（１−８４）をコ
ードする遺伝子の製造とその発現 （１）〔Ｌｅｕ¹⁸〕ヒトＰＴＨ（１−８４）をコードす
る遺伝子の製造（図１０参照） まず、１８位のＭｅｔのコドンをＬｅｕのコドンに変換
するためにオリゴヌクレオチドプライマーＢ：ACATTTGA
ACTCGCTGGAGCGTGTAGAA（配列番号９）を合成した。Ｔ４
キナーゼ処理により５’ＯＨ末端をリン酸化した上記合
成オリゴヌクレオチド（４ピコモル）と、一本鎖状のｐ
Ｕ−ＰＴＨ（５μｇ）を用いて、実施例２に記載した特
定部位指向性変異誘発キット（アマシャム社：オリゴヌ
クレオチド・ディレクテッド・インビトロ・ミュータジ
ェネシス・システム・バージョン２）により、変異を導
入したプラスミドを得た。このプラスミドで常法により
大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、１５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含む２倍ＹＴ培地寒天プレートに播いて
３７℃、１５時間培養し、多数のコロニーを得た。その
うち５つのコロニーから少量の菌体を取って０．３ｍｌ
の２倍ＹＴ培地で約５時間培養した。この培養液３０μ
ｌとヘルパーファージＫ０７を含む溶液３０μｌを混合
して３７℃に１時間静置し、３ｍｌの２倍ＹＴ培地を加
えて一晩培養した。培養液を遠心操作で上清と菌体に分
け、菌体からはプラスミドをアルカリ法で粗精製し、上
清からは、常法によりファージ粒子として存在する一本
鎖ＤＮＡを回収した。前述のオリゴヌクレオチドプライ
マーＢでは、鋳型となるヒトＰＴＨをコードする遺伝子
中に存在していた制限酵素ＮｃｏＩ認識部位が除かれて
いる。したがって、正しく変異が導入されたプラスミド
では、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩを作用させると、変異前に
存在したＮｃｏＩ部位では切断させず、ｐＵＣ１１８の
マルチクローニング部位に始めから存在するＥｃｏＲＩ
部位のみで切断され、２３０塩基対の断片は生じないは
ずである。前述の５つのコロニーから得たプラスミドを
ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳
動で分析したところ、２つのクローンで正しい断片パタ
ーンが見られた。さらに、このクローンの一本鎖状プラ
スミドを鋳型として、塩基配列を分析した結果、目的と
する変異が導入されていることを確認した（図１２）
（配列番号５７）。こうして得られた〔Ｌｅｕ¹⁸〕ヒト
ＰＴＨをコードする遺伝子（図９）を含むプラスミドを
ｐＵ−Ｌ１８ＰＴＨと称する（図１０）。

【００５６】（２）大腸菌での発現用プラスミドｐＥ−
Ｌ１８ＰＴＨの構築 （１）で得られたｐＵ−Ｌ１８ＰＴＨを制限酵素Ｘｂａ
ＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ムテイン〔Ｌｅｕ¹⁸〕
ヒトＰＴＨをコードする約０．３ｋｂｐの断片を得た。
これをアガロースゲル電気泳動で精製した後、前もって
制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化しておいた発現用
プラスミドベクターｐＥＴ３ｃ〔F. W.Stadier ら、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymol
ogy），１９５，６０−８９（１９９０）〕に、Ｔ４リ
ガーゼにより結合させた。こうして得られた発現用プラ
スミドをｐＥ−Ｌ１８ＰＴＨと称する。大腸菌ＭＭ２９
４株に、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組
み込んだλファージＤＥ３〔F. W. Stadier ら、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Bio
l.) １８９，１１３−１３０（１９８６）〕を溶原化さ
せ、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）株を作成した。該プラ
スミドｐＥ−Ｌ１８ＰＴＨを用いて大腸菌ＭＭ２９４
（ＤＥ３）を形質転換することにより、図１２に示すム
テインをコードする遺伝子を含有するプラスミドを持つ
菌体ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＥ−Ｌ１８ＰＴＨを得
た。

【００５７】（３）ムテイン〔Ｌｅｕ¹⁸〕ヒトＰＴＨの
製造 前記菌体ＭＭ294(DE3）/ｐＥ−Ｌ１８ＰＴＨを35μｇ/m
ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌ中で一晩振盪
し、そのうち２．５mｌを５０ｍｌのＬＢ培地（35μｇ/
mｌのアンピシリンを含む）に加えて37℃で２時間培養
した。クレット(Klett)値が170になった時にイソプロピ
ル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG）を0.1mMになる
ように添加し、さらに４時間培養した。ＩＰＴＧを加え
る前と添加後３時間培養した培養液の一部をとって、遠
心操作により菌体を集め、これを還元条件下のドデシル
硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAG
E)で分析するとＩＰＴＧ添加によりムテイン〔Ｌｅ
ｕ¹⁸〕ヒトＰＴＨの発現が誘導されていることがわかっ
た（図１８）。各レーンは、レーン１：分子量マーカ
ー、レーン２：ＩＰＴＧ添加後のプラスミドｐＥ−Ｌ１
８ＰＴＨを保持する大腸菌株の培養液（10μl)、レーン
３：ＩＰＴＧを添加しない、プラスミドｐＥ−Ｌ１８Ｐ
ＴＨを保持する大腸菌株の培養液（１０μｌ）、レーン
４：ＩＰＴＧを添加したヒトＰＴＨ発現株培養液（１０
μｌ）、レーン５：ＩＰＴＧを添加したヒトＰＴＨ遺伝
子を保持しない大腸菌株の培養液（１０μｌ）、のもの
を示す。この同じ形質転換体を実施例２（３）と同様に
培養し、菌体内に蓄積された目的蛋白質も同様に抽出精
製して５ｍｇの純品を得た。

【００５８】本標品は以下の諸分析結果より、高純度の
〔Ｌｅｕ¹⁸〕ヒトＰＴＨであることが示された。 ａ）逆相ＨＰＬＣにて鋭い単一ピークを示した（図19参
照）。カラム：ＹＭＣ−パックＲ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５
１２０Ａ φ4.6×250ｍｍ；溶出液：Ａ（0.1％トリフル
オル酢酸、以下ＴＦＡと略記することがある）、Ｂ（0.
1％トリフルオル酢酸を含むアセトニトリル）；溶出条
件：０分（０．１％ ＴＦＡ含有２３％アセトニトリ
ル）→30分（０．１％ ＴＦＡ含有３８％アセトニトリ
ル）の直線濃度勾配、流速１ml／分。 ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでもヒトＰＴＨと同じ移動度の単
一バンドを示した。 ｃ）アミノ酸分析（チオグリコール酸存在下、減圧封管
中、110℃、24時間、5.7Ｎ塩酸加水分解、カッコ内は理
論値を示す）：Ａsｐ（10），11.27；Ｔｈｒ（１），0.
97；Ｓｅｒ（７），6.04；Ｇｌｕ（11），12.0；Ｐｒｏ
（３），3.11；Ｇｌｙ（４）3.86；Ａｌａ（７），7.0
0；Ｖａｌ（８），7.12；Ｍｅｔ（１），0.98；Ｉｌｅ
（１），0.98；Ｌｅｕ（11），11.7；Ｐｈｅ（１），1.
02；Ｌｙｓ（９），9.81；Ｈｉｓ（４），3.75；Ａｒｇ
（５），5.21；Ｔｒｐ（１），0.93（回収率83％） ｄ）アプライドバイオシステムズ社 気相シークエンサ
ー モデル４７０ＡによりＮ末端アミノ酸配列分析で、
１位Ｓｅｒから20位Ａｒｇまでの配列である事が示され
た。このようにして１８位メチオニンがロイシンに置換
された図１２に示すアミノ酸配列（配列番号５７）を有
するムテインが得られた。

【００５９】

【実施例４】〔Ｌｅｕ⁸〕ヒトＰＴＨ（１−８４）をコ
ードする遺伝子の製造とその発現 （１）〔Ｌｅｕ⁸〕ヒトＰＴＨ（１−８４）をコードす
る遺伝子の製造 まず、８位のＭｅｔのコドンをＬｅｕのコドンに変換す
るためにオリゴヌクレオチドプライマー：TCCGAGATTCAG
CTGCTGCATAACCTT（配列番号６）を合成した。Ｔ４キナ
ーゼ処理により５’ＯＨ末端をリン酸化した上記合成オ
リゴヌクレオチド（４ピコモル）と、一本鎖状のｐＵ−
ＰＴＨ（５μｇ）を用いて、実施例２に記載した特定部
位指向性変異誘発キット（アマシャム社：オリゴヌクレ
オチド・ディレクテッド・インビトロ・ミュータジェネ
シス・システム・バージョン２）により、変異を導入し
たプラスミドを得た。このプラスミドで常法により大腸
菌ＭＶ１１８４を形質転換し、１５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含む２倍ＹＴ培地寒天プレートに播いて３７
℃、１５時間培養し、多数のコロニーを得た。そのうち
５つのコロニーから少量の菌体を取って０．３ｍｌの２
倍ＹＴ培地で約５時間培養した。この培養液３０μｌと
ヘルパーファージＫ０７を含む溶液３０μｌを混合して
３７℃に１時間静置し、３ｍｌの２倍ＹＴ培地を加えて
一晩培養した。培養液を遠心操作で上清と菌体に分け、
菌体からはプラスミドをアルカリ法で粗精製し、上清か
らは、常法によりファージ粒子として存在する一本鎖Ｄ
ＮＡを回収した。前述のオリゴヌクレオチドプライマー
では、鋳型となるヒトＰＴＨをコードする遺伝子中に存
在していない制限酵素ＰｖｕII 認識部位が挿入されて
いる。したがって、正しく変異が導入されたプラスミド
をＰｖｕII消化後のアガロースゲル電気泳動のパターン
から選択することができる。ここで３つのクローンが正
しい断片パターンを示した。さらに、このクローンの一
本鎖状プラスミドを鋳型として、塩基配列を分析した結
果、目的とする変異が導入されていることを確認した。
こうして得られた〔Ｌｅｕ⁸〕ヒトＰＴＨをコードする
遺伝子を含むプラスミドをｐＵ−Ｌ８ＰＴＨと称する。

【００６０】（２）大腸菌での発現用プラスミドｐＥ−
Ｌ８ＰＴＨの構築 （１）で得られたｐＵ−Ｌ８ＰＴＨを制限酵素ＸｂａＩ
およびＢａｍＨＩで消化して、ムテイン〔Ｌｅｕ⁸〕ヒ
トＰＴＨをコードする約０．３ｋｂｐの断片を得た。こ
れをアガロースゲル電気泳動で精製した後、前もって制
限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化しておいた発現用プ
ラスミドベクターｐＥＴ３ｃ〔F. W. Stadier ら、メソ
ッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１９５，６０−８９（１９９０）〕に、Ｔ４リガ
ーゼにより結合させた。こうして得られた発現用プラス
ミドをｐＥ−Ｌ８ＰＴＨと称する。大腸菌ＭＭ２９４株
に、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込
んだλファージＤＥ３〔F. W. Stadier ら、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.)
１８９，１１３−１３０（１９８６）〕を溶原化させ、
大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）株を作成した。該プラスミ
ドｐＥ−Ｌ８ＰＴＨを用いて大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ
３）を形質転換することにより、８位メチオニンをロイ
シンに置換したムテインをコードする遺伝子を含有する
プラスミドを持つ菌体ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＥ−Ｌ
８ＰＴＨを得た。

【００６１】（３）ムテイン〔Ｌｅｕ⁸〕ヒトＰＴＨの
製造 前記菌体ＭＭ294(DE3）/ｐＥ−Ｌ８ＰＴＨを35μｇ/mｌ
のアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌ中で一晩振盪し、
そのうち２．５mｌを５０ｍｌのＬＢ培地（35μｇ/mｌ
のアンピシリンを含む）に加えて37℃で２時間培養し
た。クレット(Klett)値が170になった時にイソプロピル
-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG）を0.1mMになるよ
うに添加し、さらに４時間培養した。ＩＰＴＧを加える
前と添加後３時間培養した培養液の一部をとって、遠心
操作により菌体を集め、これを還元条件下のドデシル硫
酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)
で分析するとＩＰＴＧ添加によりムテイン〔Ｌｅｕ⁸〕
ヒトＰＴＨの発現が誘導されていることがわかった。

【００６２】この同じ形質転換体を実施例２（３）と同
様に培養し、菌体内に蓄積された目的蛋白質も同様に抽
出精製して４．７ｍｇの純品を得た。

【００６３】本標品は以下の諸分析結果より、高純度の
〔Ｌｅｕ⁸〕ヒトＰＴＨであることが示された。 ａ）逆相ＨＰＬＣにて鋭い単一ピークを示した（図20参
照）。カラム：ＹＭＣ−パックＲ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５
１２０Ａ φ4.6×250ｍｍ；溶出液：Ａ（0.1％トリフル
オル酢酸）、Ｂ（0.1％トリフルオル酢酸を含むアセト
ニトリル）；溶出条件：０分（０．１％ ＴＦＡ含有２
５％アセトニトリル）→30分（０．１％ ＴＦＡ含有４
０％アセトニトリル）の直線濃度勾配、流速１ml／分。 ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでもヒトＰＴＨと同じ移動度の単
一バンドを示した。 ｃ）アミノ酸分析（チオグリコール酸存在下、減圧封管
中、110℃、24時間、5.7Ｎ塩酸加水分解、カッコ内は理
論値を示す）：Ａsｐ（10），10.09；Ｔｈｒ（１），0.
89；Ｓｅｒ（７），6.45；Ｇｌｕ（11），11.14；Ｐｒ
ｏ（３），3.08；Ｇｌｙ（４）4.03；Ａｌａ（７），7.
00；Ｖａｌ（８），7.57；Ｍｅｔ（１），1.05；Ｉｌｅ
（１），1.01；Ｌｅｕ（11），11.32；Ｐｈｅ（１），
0.98；Ｌｙｓ（９），8.62；Ｈｉｓ（４），3.72；Ａｒ
ｇ（５），4.80；Ｔｒｐ（１），0.64（回収率79.2％） ｄ）アプライドバイオシステムズ社 気相シークエンサ
ー モデル４７０ＡによりＮ末端アミノ酸配列分析で、
１位Ｓｅｒから15位Ｌｅｕまでの配列である事が示され
た。このようにして８位メチオニンがロイシンに置換さ
れた図２１に示すアミノ酸配列（配列番号５８）を有す
るムテインが得られた。

【００６４】

【実施例５】［Ｌｅｕ⁸］ヒトＰＴＨ（７−８４）遺伝
子の製造とその発現 （１）［Leu⁸］ヒトPTH(7-84)の発現用プラスミドの構
築ならびに形質転換体の製造（図２２） ｉ）発現用プラスミドは、pE-PTH(ヨーロッパ特許出願
第48509号公報)のヒトＰＴＨ遺伝子のＮ末端を改変した
ものである。pE-PTH ＤＮＡ ２μｇを１５μｌの反応液
〔10mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM MgCl₂, 1mM Dithiothre
itol, 80mM NaCl,15ユニットの制限酵素NcoI（宝酒
造）〕中、37℃、２時間反応させた後、NaClを150 mMに
なるように加え、また20ユニットのNdeI（ニューイング
ランド・バイオラボ社）を加えて37℃、２時間反応させ
た続いて、65℃で20分間処理し、酵素を失活させた後、
水で10倍希釈した。一方、NdeI結合部位にあたる開始コ
ドンATGに続いてLeu⁷、そしてMet⁸をLeuに置換したコド
ン、以下His⁹からNcoI結合部位にあたるSer¹⁷までのＮ
末端をコードした遺伝子を、ＡＢＩ社のＤＮＡシンセサ
イザー３８０Ａを用いて相補鎖と共に合成した。この２
種類のフラグメントの５’末端をそれぞれリン酸化した
〔図中左端に突起のある棒（●−）印は５’−末端水酸
基がリン酸化されていることを示す〕。 5' TATGTTACTCCATAACCTTGGCAAACATTTGAACTC 3' （配列
番号59） 5' CATGGAGTTCAAATGTTTGCCAAGGTTATGGAGTAACA 3' （配
列番号60） これら両者を混合し、50mM Tris-HCl, pH7.6, 10mM MgC
l₂, 10mM DTT, 1 mMスペルミジン、0.1mg/ml ＢＳＡお
よび1 mM ＡＴＰ存在下、14℃、16時間 T4 ＤＮＡリガ
ーゼ（（ニューイングランド・バイオラボ社）を作用さ
せてＤＮＡを結合し、前述と同様な方法で大腸菌JM109
株を形質転換させた。次にこの大腸菌を50μg/ml のア
ンピシリンを含むＬＢ培地上にまき、37℃で１日培養し
た。生じたアンピシリン耐性コロニーを選んだ。さらに
転換株のプラスミドＤＮＡを制限酵素NdeI-BamHIで消化
し、ポリアクリルアミド電気泳動のパターンから、正し
くｈＰＴＨ遺伝子を含む形質転換株を選択した。このよ
うにして得た発現用プラスミドをpE-L8PTH(7-84) と、
また形質転換株をエシェリヒア・コリJM109／pE-L8PTH
(7-84) と名付けた。

【００６５】ii）ｉ）で得られたJM109／pE-L8PTH(7-8
4) よりプラスミドＤＮＡを単離し、これを用いて実施
例１−（３）−ii）と同様にしてエシェリヒア・コリMM
294(DE3)を形質転換し、エシェリヒア・コリMM294(DE3)
／pE-L8PTH(7-84) 株を得た。

【００６６】（２）〔Ｌｅｕ¹⁸〕ヒトＰＴＨ（７−８
４）の製造 （１）で得られたエシェリヒア・コリMM294(DE3)／pE-L
8PTH(7-84) を実施例２（３）と同様に培養し菌体内に
蓄積された目的蛋白質（図23）を同様に抽出、精製し
５．３ｍｇを得た。この蛋白質はアミノ酸分析、及び末
端アミノ酸配列分析から、題記蛋白質のＮ末端Ｌｅｕに
さらにＭｅｔが付加したもの、すなわち〔Ｍｅｔ⁶，Ｌ
ｅｕ¹⁸〕ヒトＰＴＨ（６−８４）である事が判明した。

【００６７】本標品は以下の諸分析結果より、高純度の
〔Ｌｅｕ¹⁸〕ヒトＰＴＨ（７−８４）であることが示さ
れた（但しＮ末端にさらにＭｅｔ残基が付加）。 ａ）逆相ＨＰＬＣにて鋭い単一ピークを示した（図24参
照）。カラム：ＹＭＣ−パックＲ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５
１２０Ａ φ4.6×250ｍｍ；溶出液：Ａ（0.1％トリフル
オル酢酸）、Ｂ（0.1％トリフルオル酢酸を含むアセト
ニトリル）；溶出条件：０分（０．１％ ＴＦＡ含有２
３％アセトニトリル）→30分（０．１％ ＴＦＡ含有３
８％アセトニトリル）の直線濃度勾配、流速１ml／分。 ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも単一バンドを示した。 ｃ）アミノ酸分析（チオグリコール酸存在下、減圧封管
中、110℃、24時間、5.7Ｎ塩酸加水分解、カッコ内は理
論値を示す）：Ａsｐ（10），10.1；Ｔｈｒ（１），0.9
1；Ｓｅｒ（５），4.49；Ｇｌｕ（９），9.40；Ｐｒｏ
（３），2.96；Ｇｌｙ（４）3.67；Ａｌａ（７），7.0
0；Ｖａｌ（７），6.35；Ｍｅｔ（１），1.94；Ｌｅｕ
（11），11.41；Ｐｈｅ（１），1.07；Ｌｙｓ（９），
8.62；Ｈｉｓ（４），3.61；Ａｒｇ（５），4.81；Ｔｒ
ｐ（１），0.91（回収率79.7％） ｄ）アプライドバイオシステムズ社 気相シークエンサ
ー モデル４７０ＡによりＮ末端アミノ酸配列分析で、
１番目Met２番目Leuから20残基までの配列が正しい事が
示された。このようにして図２５に示すアミノ酸配列
（配列番号５７）を有するムテイン８位メチオニンがロ
イシンに置換されたヒトＰＴＨ（７−８４）が得られ
た。

【００６８】

【実施例６】［Ｌｅｕ⁸'¹⁸］ヒトＰＴＨ（１−８４）遺
伝子の製造とその発現 （１）［Ｌｅｕ⁸'¹⁸］ヒトＰＴＨ（１−８４）遺伝子の
製造（図26） 実施例４で得られた［Leu⁸］ヒトPTH発現用プラスミドp
E-L8PTHを先の参考例３で述べたプラスミドpU-PTHを得
るのと同様の操作をして特定部位指向性変異誘発を行な
うための［Ｌｅｕ⁸］ヒトＰＴＨ遺伝子を含む一本鎖状
のプラスミドpU-L8PTHを構築した。このＤＮＡを用い
て、実施例３に記したのと同様の方法で１８位Ｍｅｔコ
ドンをＬｅｕコドンに変異させた。［Ｌｅｕ⁸］ヒトＰ
ＴＨをコードする遺伝子を含むプラスミドpU-L8,18PTH
を得た。 （２）大腸菌での発現用プラスミドpE-L8,18PTHの構築
（図２７） （１）で得られたpU-L8,18PTHを用い実施例３の（２）
と同様に発現用プラスミドpE-L8,18PTH を得、次いでこ
れを用いて大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）を形質転換する
ことにより、図２８（配列番号６２）に示すムテインを
コードする遺伝子を含有するプラスミドを持つ菌体MM29
4(DE3)/pE-L8,18PTHを得た。

【００６９】（３）ムテイン〔Ｌｅｕ⁸'¹⁸〕ヒトＰＴＨ
の製造 （２）で得られた形質転換体MM294(DE3)/pE-L8,18PTHを
実施例２の（３）で記したものと同様の方法で培養し、
菌体内に蓄積された目的蛋白質を同様に抽出、精製して
〔Ｌｅｕ⁸'¹⁸〕ヒトＰＴＨ（１−８４）の純品を６．５
ｍｇ得た。

【００７０】本標品は以下の諸分析結果より、高純度の
〔Ｌｅｕ⁸'¹⁸〕ヒトＰＴＨであることが示された。 ａ）逆相ＨＰＬＣにて鋭い単一ピークを示した（図29参
照）。カラム：ＹＭＣ−パックＲ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５
１２０Ａ φ4.6×250ｍｍ；溶出液：Ａ（0.1％トリフル
オル酢酸）、Ｂ（0.1％トリフルオル酢酸を含むアセト
ニトリル）；溶出条件：０分（０．１％ ＴＦＡ含有２
５％アセトニトリル）→30分（０．１％ ＴＦＡ含有４
０％アセトニトリル）の直線濃度勾配、流速１ml／分。 ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも単一バンドを示した。 ｃ）アミノ酸分析（チオグリコール酸存在下、減圧封管
中、110℃、24時間、5.7Ｎ塩酸加水分解、カッコ内は理
論値を示す）：Ａsｐ（10），10.38；Ｔｈｒ（１），0.
88；Ｓｅｒ（７），6.37；Ｇｌｕ（11），11.82；Ｐｒ
ｏ（３），2.88；Ｇｌｙ（４）3.79；Ａｌａ（７），7.
00；Ｖａｌ（８），7.47；Ｉｌｅ（１），0.98；Ｌｅｕ
（12），13.00；Ｐｈｅ（１），1.10；Ｌｙｓ（９），
8.93；Ｈｉｓ（４），3.74；Ａｒｇ（５），5.09；Ｔｒ
ｐ（１），0.96（回収率80％） ｄ）アプライドバイオシステムズ社 気相シークエンサ
ー モデル４７０ＡによりＮ末端アミノ酸配列分析で、
１位Serから20位Argまでの配列が正しいものである事が
示された。このようにして８位および１８位メチオニン
がロイシンに置換された図２８に示すアミノ酸配列（配
列番号６２）を有するムテインが得られた。

【００７１】実験例 実施例２〜６でそれぞれ得られたｈＰＴＨムテイン及び
天然型ｈＰＴＨの生物活性をシゲノら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、第263巻、第18369
〜18377頁、1980年 〔Shigenoら The Journal of Bioio
gical Chemistry，263：18369−18377（1988）〕により
報告された方法を修正して評価した。96穴マルチ・プレ
ート〔ヌンクロン（Nunclon）、ヌンク〕上で培養した
マウス頭骸骨由来骨芽細胞様細胞株、ＭＣ３Ｔ３−ＥＩ
細胞に、0.01，0.1，1，10あるいは100ｎＭの類縁体を
含む、100μｌの培養液〔20ｍＭのＮ−２ヒドロキシエ
チルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、0.1％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び0.5ｍＭの
イソブチルメチルキサンチンを含む。Ｈａｎｋ’ｓ液〕
を加え、30分間室温で反応させた。0.2規定度の塩酸100
μｌを加えた後、沸騰水中に２分半浸し、ｈＰＨＴ受容
体によって産生されたサイクリック・アデノシン・１リ
ン酸（ｃＡＭＰ）を細胞から抽出した。培養液中及び細
胞中の総ｃＡＭＰ測定は、市販のラジオイムノアッセイ
キット〔サイクリックＡＭＰ［¹²⁵Ｉ］キット「デュポ
ン−第一」、第一化学薬品〕を用いて行なった。添加し
たＰＴＨムテインの濃度に依存したｃＡＭＰの産生量の
増加が常に認められた。天然型ｈＰＴＨに対するムテイ
ンの比活性を表に示す。

【００７２】

【配列表】

配列番号:1 配列の長さ:78 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列の特徴 特徴を表わす記号:mutation 存在位置:2 その他の情報: Xaa=Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp or
Met 特徴を決定した方法:E 存在位置:12 その他の情報: Xaa=Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp or
Met 特徴を決定した方法:E 存在位置:28 その他の情報: Xaa=Cys or Phe 特徴を決定した方法:E 存在位置:29 その他の情報: Xaa=Cys or Val 特徴を決定した方法:E 存在位置:31 その他の情報: Xaa=Cys or Leu 特徴を決定した方法:E 存在位置:33 その他の情報: Xaa=Cys or Ala 特徴を決定した方法:E 存在位置：３５ その他の情報： Ｘａａ＝Ｃｙｓ ｏｒ Ｌｅｕ 特徴を決定した方法:E 存在位置:37 その他の情報: Xaa=Cys or Pro 特徴を決定した方法:E 存在位置:38 その他の情報: Xaa=Cys or Arg 特徴を決定した方法:E 配列: Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Xaa Glu Arg Val Glu 1 5 10 15 Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Xaa Xaa Ala Xaa Gly 20 25 30 Xaa Pro Xaa Ala Xaa Xaa Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys 35 40 45 Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala 50 55 60 Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln 65 70 75。

【００７３】配列番号:2 配列の長さ:79 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列の特徴 特徴を表わす記号:mutation 存在位置:3 その他の情報： Ｘａａ＝Ｌｅｕ， Ｉｌｅ， Ｖａ
ｌ， Ｐｈｅ， Ｔｙｒ， Ｔｒｐ ｏｒ Ｍｅｔ 存在位置：１３ その他の情報: Xaa=Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp or
Met 特徴を決定した方法:E 存在位置:29 その他の情報: Xaa=Cys or Phe 特徴を決定した方法:E 存在位置:30 その他の情報: Xaa=Cys or Val 特徴を決定した方法:E 存在位置:32 その他の情報: Xaa=Cys or Leu 特徴を決定した方法:E 存在位置:34 その他の情報: Xaa=Cys or Ala 特徴を決定した方法:E 存在位置:36 その他の情報: Xaa=Cys or Leu 特徴を決定した方法:E 存在位置:38 その他の情報: Xaa=Cys or Pro 特徴を決定した方法:E 存在位置:39 その他の情報: Xaa=Cys or Arg 特徴を決定した方法:E 配列: Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Xaa Glu Arg Val 1 5 10 15 Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Xaa Xaa Ala Xaa 20 25 30 Gly Xaa Pro Xaa Ala Xaa Xaa Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys 35 40 45 Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu 50 55 60 Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln 65 70 75。

【００７４】配列番号:3 配列の長さ:80 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列の特徴 特徴を表わす記号:mutation 存在位置:4 その他の情報: Xaa=Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp or
Met 特徴を決定した方法:E 存在位置:14 その他の情報: Xaa=Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp or
Met 特徴を決定した方法:E 存在位置:30 その他の情報: Xaa=Cys or Phe 特徴を決定した方法:E 存在位置:31 その他の情報: Xaa=Cys or Val 特徴を決定した方法:E 存在位置:33 その他の情報: Xaa=Cys or Leu 特徴を決定した方法：Ｅ 存在位置：３５ その他の情報: Xaa=Cys or Ala 特徴を決定した方法:E 存在位置:37 その他の情報: Xaa=Cys or Leu 特徴を決定した方法:E 存在位置:39 その他の情報: Xaa=Cys or Pro 特徴を決定した方法:E 存在位置:40 その他の情報: Xaa=Cys or Arg 特徴を決定した方法:E 配列: Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Xaa Glu Arg 1 5 10 15 Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Xaa Xaa Ala 20 25 30 Xaa Gly Xaa Pro Xaa Ala Xaa Xaa Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg 35 40 45 Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly 50 55 60 Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln 65 70 75 80。

【００７５】配列番号:4 配列の長さ:81 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 配列の特徴 特徴を表わす記号:mutation 存在位置:5 その他の情報: Xaa=Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp or
Met 特徴を決定した方法:E 存在位置:15 その他の情報: Xaa=Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp or
Met 特徴を決定した方法:E 存在位置:31 その他の情報: Xaa=Cys or Phe 特徴を決定した方法:E 存在位置:32 その他の情報: Xaa=Cys or Val 特徴を決定した方法:E 存在位置:34 その他の情報: Xaa=Cys or Leu 特徴を決定した方法:E 存在位置:36 その他の情報: Xaa=Cys or Ala 特徴を決定した方法:E 存在位置:38 その他の情報: Xaa=Cys or Leu 特徴を決定した方法:E 存在位置:40 その他の情報: Xaa=Cys or Pro 特徴を決定した方法:E 存在位置:41 その他の情報: Xaa=Cys or Arg 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｘａａ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｘａａ Ｇｌｕ 1 5 10 15 Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Xaa Xaa 20 25 30 Ala Xaa Gly Xaa Pro Xaa Ala Xaa Xaa Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro 35 40 45 Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu 50 55 60 Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser 65 70 75 80 Gln。

【００７６】配列番号:5 配列の長さ:84 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列の特徴 特徴を表わす記号:mutation 存在位置:8 その他の情報: Xaa=Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp or
Met 特徴を決定した方法:E 存在位置:18 その他の情報: Xaa=Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp or
Met 特徴を決定した方法:E 存在位置:34 その他の情報: Xaa=Cys or Phe 特徴を決定した方法：Ｅ 存在位置：３５ その他の情報: Xaa=Cys or Val 特徴を決定した方法:E 存在位置:37 その他の情報: Xaa=Cys or Leu 特徴を決定した方法:E 存在位置:39 その他の情報: Xaa=Cys or Ala 特徴を決定した方法:E 存在位置:41 その他の情報: Xaa=Cys or Leu 特徴を決定した方法:E 存在位置:43 その他の情報: Xaa=Cys or Pro 特徴を決定した方法:E 存在位置:44 その他の情報: Xaa=Cys or Arg 特徴を決定した方法:E 配列: Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Xaa Xaa Ala Xaa Gly Xaa Pro Xaa Ala Xaa Xaa Asp Ala Gly Ser 35 40 45 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Ser Gln。

【００７７】配列番号:6 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: TCCGAGATTC AGCTGCTGCA TAACCTT 27。

【００７８】配列番号:7 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: TCCGAGATTC AGTTAATCCA TAACCTT 27。

【００７９】配列番号:8 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、ｐｒｉｍｅｒ 配列： ＴＣＣＧＡＧＡＴＴＣ ＡＧＴＴＡＡＣＧＣＡ ＴＡＡＣＣＴＴ
27。

【００８０】配列番号:9 配列の長さ:28 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: ACATTTGAAC TCGCTGGAGC GTGTAGAA 28。

【００８１】配列番号:10 配列の長さ:28 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: ACATTTGAAC TCGATCGAGC GTGTAGAA 28。

【００８２】配列番号:11 配列の長さ:28 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Ｎｏ 配列の種類：他の核酸、合成DNA、primer 配列: ACATTTGAAC TCGACGGAGC GTGTAGAA 28。

【００８３】配列番号:12 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: GATGTGCACA ATTGTGTTGC CTTAGGTGCC 30。

【００８４】配列番号:13 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: CACAATTTTT GCGCCTTAGG 20。

【００８５】配列番号:14 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: AATTTTGTTG CCTGTGGTGC CCCATTG 27。

【００８６】配列番号:15 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: GTTGCCTTAG GTTGCCCATT GGCTCCT 27。

【００８７】配列番号:16 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: TTAGGTGCCC CATGTGCTCC TCGTGAT 27。

【００８８】配列番号:17 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: GCCCCATTGG CTTGTCGTGA TGCTGGT 27。

【００８９】配列番号:18 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：No 配列の種類:他の核酸、合成DNA、primer 配列: CCATTGGCTC CTTGTGATGC TGGTTCC 27。

【００９０】配列番号:19 配列の長さ:234 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・234 特徴を決定した方法:E 配列: TTA ATG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC TCC ATG GAG CGT GTA GAA 48 Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu 1 5 10 15 TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC AAT TTT GTT GCC TTA GGT 96 Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly 20 25 30 GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC CAA AGA CCA CGT AAA AAG 144 Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys 35 40 45 GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA AAA TCC CTA GGC GAG GCA 192 Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala 50 55 60 GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA GCT AAA TCC CAG 234 Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln 65 70 75。

【００９１】配列番号:20 配列の長さ:237 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・237 特徴を決定した方法:E 配列: CAG TTA ATG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC TCC ATG GAG CGT GTA 48 Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val 1 5 10 15 GAA TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC AAT TTT GTT GCC TTA 96 Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu 20 25 30 GGT GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC CAA AGA CCA CGT AAA 144 Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys 35 40 45 AAG GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA AAA TCC CTA GGC GAG 192 Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu 50 55 60 GCA GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA GCT AAA TCC CAG 237 Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln 65 70 75。

【００９２】配列番号:21 配列の長さ:240 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・240 特徴を決定した方法:E 配列: ATT CAG TTA ATG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC TCC ATG GAG CGT 48 Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg 1 5 10 15 GTA GAA TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC AAT TTT GTT GCC 96 Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Val Ala 20 25 30 TTA GGT GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC CAA AGA CCA CGT 144 Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg 35 40 45 AAA AAG GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA AAA TCC CTA GGC 192 Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly 50 55 60 GAG GCA GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA GCT AAA TCC CAG 240 Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln 65 70 75 80。

【００９３】配列番号:22 配列の長さ:243 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・243 特徴を決定した方法:E 配列: GAG ATT CAG TTA ATG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC TCC ATG GAG 48 Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu 1 5 10 15 CGT GTA GAA TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC AAT TTT GTT 96 Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Val 20 25 30 GCC TTA GGT GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC CAA AGA CCA 144 Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro 35 40 45 CGT AAA AAG GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA AAA TCC CTA 192 Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu 50 55 60 GGC GAG GCA GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA GCT AAA TCC 240 Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser 65 70 75 80 CAG 243 Gln。

【００９４】配列番号:23 配列の長さ:252 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・252 特徴を決定した方法:E 配列: TCT GTG TCC GAG ATT CAG TTA ATG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC 48 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 TCC ATG GAG CGT GTA GAA TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC 96 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 AAT TTT GTT GCC TTA GGT GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC 144 Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 CAA AGA CCA CGT AAA AAG GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA 192 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 AAA TCC CTA GGC GAG GCA GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA 240 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 GCT AAA TCC CAG 252 Ala Lys Ser Gln。

【００９５】配列番号:24 配列の長さ:245 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Ｎｏ 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・244 特徴を決定した方法:E 配列: TATGTTAATG CATAACCTTG GCAAACATTT GAACTCCATG GAGCGTGTAG AATGGCTGCG 60 TAAGAAGTTG CAGGATGTGC ACAATTTTGT TGCCTTAGGT GCCCCATTGG CTCCTCGTGA 120 TGCTGGTTCC CAAAGACCAC GTAAAAAGGA AGACAATGTC TTAGTTGAGA GCCATGAAAA 180 ATCCCTAGGC GAGGCAGACA AGGCCGATGT GAATGTATTA ACTAAAGCTA AATCCCAGTA 240 ATGAG 245 。配列番号:25 配列の長さ：２４７ 配列の型：核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・245 特徴を決定した方法:E 配列: GATCCTCATT ACTGGGATTT AGCTTTAGTT AATACATTCA CATCGGCCTT GTCTGCCTCG 60 CCTAGGGATT TTTCATGGCT CTCAACTAAG ACATTGTCTT CCTTTTTACG TGGTCTTTGG 120 GAACCAGCAT CACGAGGAGC CAATGGGGCA CCTAAGGCAA CAAAATTGTG CACATCCTGC 180 AACTTCTTAC GCAGCCATTC TACACGCTCC ATGGAGTTCA AATGTTTGCC AAGGTTATGC 240 ATTAACA 247。

【００９６】配列番号:26 配列の長さ:248 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Ｎｏ 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・247 特徴を決定した方法:E 配列: TATGCAGTTA ATGCATAACC TTGGCAAACA TTTGAACTCC ATGGAGCGTG TAGAATGGCT 60 GCGTAAGAAG TTGCAGGATG TGCACAATTT TGTTGCCTTA GGTGCCCCAT TGGCTCCTCG 120 TGATGCTGGT TCCCAAAGAC CACGTAAAAA GGAAGACAAT GTCTTAGTTG AGAGCCATGA 180 AAAATCCCTA GGCGAGGCAG ACAAGGCCGA TGTGAATGTA TTAACTAAAG CTAAATCCCA 240 GTAATGAG 248。

【００９７】配列番号:27 配列の長さ:250 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・248 特徴を決定した方法:E 配列: GATCCTCATT ACTGGGATTT AGCTTTAGTT AATACATTCA CATCGGCCTT GTCTGCCTCG 60 CCTAGGGATT TTTCATGGCT CTCAACTAAG ACATTGTCTT CCTTTTTACG TGGTCTTTGG 120 GAACCAGCAT CACGAGGAGC CAATGGGGCA CCTAAGGCAA CAAAATTGTG CACATCCTGC 180 AACTTCTTAC GCAGCCATTC TACACGCTCC ATGGAGTTCA AATGTTTGCC AAGGTTATGC 240 ATTAACTGCA 250。

【００９８】配列番号:28 配列の長さ:251 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Ｎｏ 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・250 特徴を決定した方法:E 配列: TATGATTCAG TTAATGCATA ACCTTGGCAA ACATTTGAAC TCCATGGAGC GTGTAGAATG 60 GCTGCGTAAG AAGTTGCAGG ATGTGCACAA TTTTGTTGCC TTAGGTGCCC CATTGGCTCC 120 TCGTGATGCT GGTTCCCAAA GACCACGTAA AAAGGAAGAC AATGTCTTAG TTGAGAGCCA 180 TGAAAAATCC CTAGGCGAGG CAGACAAGGC CGATGTGAAT GTATTAACTA AAGCTAAATC 240 CCAGTAATGA G 251。

【００９９】配列番号:29 配列の長さ:253 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・251 特徴を決定した方法:E 配列: GATCCTCATT ACTGGGATTT AGCTTTAGTT AATACATTCA CATCGGCCTT GTCTGCCTCG 60 CCTAGGGATT TTTCATGGCT CTCAACTAAG ACATTGTCTT CCTTTTTACG TGGTCTTTGG 120 GAACCAGCAT CACGAGGAGC CAATGGGGCA CCTAAGGCAA CAAAATTGTG CACATCCTGC 180 AACTTCTTAC GCAGCCATTC TACACGCTCC ATGGAGTTCA AATGTTTGCC AAGGTTATGC 240 ATTAACTGAA TCA 253。

【０１００】配列番号:30 配列の長さ:254 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Ｎｏ 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・253 特徴を決定した方法:E 配列: TATGGAGATT CAGTTAATGC ATAACCTTGG CAAACATTTG AACTCCATGG AGCGTGTAGA 60 ATGGCTGCGT AAGAAGTTGC AGGATGTGCA CAATTTTGTT GCCTTAGGTG CCCCATTGGC 120 TCCTCGTGAT GCTGGTTCCC AAAGACCACG TAAAAAGGAA GACAATGTCT TAGTTGAGAG 180 CCATGAAAAA TCCCTAGGCG AGGCAGACAA GGCCGATGTG AATGTATTAA CTAAAGCTAA 240 ATCCCAGTAA TGAG 254。

【０１０１】配列番号:31 配列の長さ:256 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置：２・・・２５４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列: GATCCTCATT ACTGGGATTT AGCTTTAGTT AATACATTCA CATCGGCCTT GTCTGCCTCG 60 CCTAGGGATT TTTCATGGCT CTCAACTAAG ACATTGTCTT CCTTTTTACG TGGTCTTTGG 120 GAACCAGCAT CACGAGGAGC CAATGGGGCA CCTAAGGCAA CAAAATTGTG CACATCCTGC 180 AACTTCTTAC GCAGCCATTC TACACGCTCC ATGGAGTTCA AATGTTTGCC AAGGTTATGC 240 ATTAACTGAA TCTCCA 256。

【０１０２】配列番号:32 配列の長さ:263 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Ｎｏ 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・262 特徴を決定した方法:E 配列: TATGTCTGTG TCCGAGATTC AGTTAATGCA TAACCTTGGC AAACATTTGA ACTCCATGGA 60 GCGTGTAGAA TGGCTGCGTA AGAAGTTGCA GGATGTGCAC AATTTTGTTG CCTTAGGTGC 120 CCCATTGGCT CCTCGTGATG CTGGTTCCCA AAGACCACGT AAAAAGGAAG ACAATGTCTT 180 AGTTGAGAGC CATGAAAAAT CCCTAGGCGA GGCAGACAAG GCCGATGTGA ATGTATTAAC 240 TAAAGCTAAA TCCCAGTAAT GAG 263。

【０１０３】配列番号:33 配列の長さ:265 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・263 特徴を決定した方法:E 配列: GATCCTCATT ACTGGGATTT AGCTTTAGTT AATACATTCA CATCGGCCTT GTCTGCCTCG 60 CCTAGGGATT TTTCATGGCT CTCAACTAAG ACATTGTCTT CCTTTTTACG TGGTCTTTGG 120 GAACCAGCAT CACGAGGAGC CAATGGGGCA CCTAAGGCAA CAAAATTGTG CACATCCTGC 180 AACTTCTTAC GCAGCCATTC TACACGCTCC ATGGAGTTCA AATGTTTGCC AAGGTTATGC 240 ATTAACTGAA TCTCGGACAC AGACA 265。

【０１０４】配列番号:34 配列の長さ:12 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・12 特徴を決定した方法:E 配列: TATGTTAATG CA 12。

【０１０５】配列番号：３５ 配列の長さ：１４ 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA アンチセンス：ｙｅｓ 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・12 特徴を決定した方法:E 配列: AGGTTATGCA TTCA 14。

【０１０６】配列番号:36 配列の長さ:15 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・15 特徴を決定した方法:E 配列: TATGCAGTTA ATGCA 15。

【０１０７】配列番号:37 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA アンチセンス：ｙｅｓ 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・17 特徴を決定した方法:E 配列: AGGTTATGCA TTCTGCA 17。

【０１０８】配列番号:38 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・18 特徴を決定した方法:E 配列: TATGATTCAG TTAATGCA 18。

【０１０９】配列番号:39 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA アンチセンス：ｙｅｓ 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・20 特徴を決定した方法:E 配列: AGGTTATGCA TTCTGAATCA 20。

【０１１０】配列番号:40 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・21 特徴を決定した方法:E 配列: TATGGAGATT CAGTTAATGC A 21。

【０１１１】配列番号:41 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA アンチセンス：ｙｅｓ 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・23 特徴を決定した方法:E 配列: AGGTTATGCA TTCTGAATCT CCA 23。

【０１１２】配列番号:42 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:2・・・30 特徴を決定した方法:E 配列: TATGTCTGTG TCCGAGATTC AGTTAATGCA 30。

【０１１３】配列番号:43 配列の長さ:34 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１・・・３４ 特徴を決定した方法:E 配列: AGGTTATGCA TTAACTCAAT CTCGGACACA GACA 34。

【０１１４】配列番号:44 配列の長さ:45 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・45 特徴を決定した方法:E 配列: TAACCTTGGC AAACATTTGA ACTCCATGGA GCGTGTAGAA TGGCT 45。

【０１１５】配列番号:45 配列の長さ:45 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・45 特徴を決定した方法:E 配列: TTACGCAGCC ATTCTACACG CTCCATGGAG TTCAAATGTT TGCCA 45。

【０１１６】配列番号:46 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・30 特徴を決定した方法:E 配列: GCGTAAGAAG TTGCAGGATG TGCACAATTT 30。

【０１１７】配列番号:47 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロロジー:直鎖状 アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・30 特徴を決定した方法:E 配列: GCAACAAAAT TGTGCACATC CTGCAACTTC 30。

【０１１８】配列番号:48 配列の長さ:46 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・46 特徴を決定した方法:E 配列: TGTTGCCTTA GGTGCCCCAT TGGCTCCTCG TGATGCTGGT TCCCAA 46。

【０１１９】配列番号:49 配列の長さ:46 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・46 特徴を決定した方法:E 配列: TGGTCTTTGG GAACCAGCAT CACGAGGAGC CAATGGGGCA CCTAAG 46。

【０１２０】配列番号：５０ 配列の長さ：４１ 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・41 特徴を決定した方法:E 配列: AGACCACGTA AAAAGGAAGA CAATGTCTTA GTTGAGAGCC A 41。

【０１２１】配列番号:51 配列の長さ:41 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・41 特徴を決定した方法:E 配列: TTTTCATGGC TCTCAACTAA GACATTGTCT TCCTTTTTAC G 41。

【０１２２】配列番号:52 配列の長さ:42 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を表わす記号:CDS 存在位置:1・・・42 特徴を決定した方法:E 配列: TGAAAAATCC CTAGGCGAGG CAGACAAGGC CGATGTGAAT GT 42。

【０１２３】配列番号:53 配列の長さ:42 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を表わす記号:CDS 存在位置:1・・・42 特徴を決定した方法:E 配列: GTTAATACAT TCACATCGGC CTTGTCTGCC TCGCCTAGGC AT 42。

【０１２４】配列番号:54 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を表わす記号:CDS 存在位置:1・・・28 特徴を決定した方法:E 配列: ATTAACTAAA GCTAAATCCC AGTAATGAG 29。

【０１２５】配列番号:55 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロロジー:直鎖状 アンチセンス:Yes 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:6・・・27 特徴を決定した方法:E 配列: GATCCTCATT ACTGGGATTT AGCTTTA 27。

【０１２６】配列番号:56 配列の長さ:252 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:mutation 存在位置:103・・・105 特徴を決定した方法:E 配列: TCT GTG TCC GAG ATT CAG TTA ATG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC 48 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 TCC ATG GAG CGT GTA GAA TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC 96 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 AAT TTT TGC GCC TTA GGT GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC 144 Asn Phe Cys Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 CAA AGA CCA CGT AAA AAG GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA 192 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 AAA TCC CTA GGC GAG GCA GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA 240 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 GCT AAA TCC CAG 252 Ala Lys Ser Gln 84。

【０１２７】配列番号:57 配列の長さ:252 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置:51・・・52 特徴を決定した方法:E 配列: TCT GTG TCC GAG ATT CAG TTA ATG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC 48 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 TCG CTG GAG CGT GTA GAA TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC 96 Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 AAT TTT GTT GCC TTA GGT GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC 144 Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 CAA AGA CCA CGT AAA AAG GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA 192 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 AAA TCC CTA GGC GAG GCA GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA 240 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 GCT AAA TCC CAG 252 Ala Lys Ser Gln 84。

【０１２８】配列番号:58 配列の長さ:252 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:mutation 存在位置:19・・・24 特徴を決定した方法:E 配列: TCT GTG TCC GAG ATT CAG CTG CTG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC 48 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 TCC ATG GAG CGT GTA GAA TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC 96 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 AAT TTT GTT GCC TTA GGT GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC 144 Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 CAA AGA CCA CGT AAA AAG GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA 192 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 AAA TCC CTA GGC GAG GCA GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA 240 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 GCT AAA TCC CAG 252 Ala Lys Ser Gln。

【０１２９】配列番号:59 配列の長さ:36 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Ｎｏ 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・36 特徴を決定した方法:E 配列: TATGTTACTC CATAACCTTG GCAAACATTT GAACTC 36。

【０１３０】配列番号:60 配列の長さ:38 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 アンチセンス：Yes 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:1・・・38 特徴を決定した方法:E 配列: CATGGAGTTC AAATGTTTGC CAAGGTTATG GAGTAACA 38。

【０１３１】配列番号:61 配列の長さ:234 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を示す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置:4,6 特徴を決定した方法:E 配列: TTA CTC CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC TCC ATG GAG CGT GTA GAA 48 Leu Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu 1 5 10 15 TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC AAT TTT GTT GCC TTA GGT 96 Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly 20 25 30 GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC CAA AGA CCA CGT AAA AAG 144 Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys 35 40 45 GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA AAA TCC CTA GGC GAG GCA 192 Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala 50 55 60 GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA GCT AAA TCC CAG 234 Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln 65 70 75。

【０１３２】配列番号:62 配列の長さ:252 配列の型:核酸 鎖の数:2本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 特徴を示す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：１９，２１，２２，５１，５２ 特徴を決定した方法:E 配列: TCT GTG TCC GAG ATT CAG CTG CTG CAT AAC CTT GGC AAA CAT TTG AAC 48 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Leu His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 TCG CTG GAG CGT GTA GAA TGG CTG CGT AAG AAG TTG CAG GAT GTG CAC 96 Ser Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 AAT TTT GTT GCC TTA GGT GCC CCA TTG GCT CCT CGT GAT GCT GGT TCC 144 Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 CAA AGA CCA CGT AAA AAG GAA GAC AAT GTC TTA GTT GAG AGC CAT GAA 192 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 AAA TCC CTA GGC GAG GCA GAC AAG GCC GAT GTG AAT GTA TTA ACT AAA 240 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 GCT AAA TCC CAG 252 Ala Lys Ser Gln。

【０１３３】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＰＴＨおよびそのＮ端末部を欠如したヒト
ＰＴＨアナログに対応する本発明のＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を示した図である。

【図２】本発明のヒトＰＴＨおよびそのＮ末端部を欠如
したアナログをコードする遺伝子合成の際のＤＮＡフラ
グメントの分割の一例を示した図である。

【図３】本発明ヒトＰＴＨアナログ対応合成遺伝子製造
用ＤＮＡフラグメントの一例を示す図である。

【図４】図３の各ＤＮＡフラグメントを連結してヒトＰ
ＴＨアナログ合成遺伝子を製造する模式図である。

【図５】図４で得られる合成遺伝子を組み込んだ発現プ
ラスミドの構築図をヒトＰＴＨ（５−８４）（実施例
１）を例にして示してある。

【図６】実施例１、ヒトＰＴＨ（５−８４）に対応する
ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示した図である。

【図７】実施例２におけるプラスミドｐＵ−Ｃ３５ＰＴ
Ｈの構築図を示す。

【図８】実施例２におけるプラスミドｐＥ−Ｃ３５ＰＴ
Ｈの構築図を示す。

【図９】実施例２における、〔Cys³⁵〕ヒトＰＴＨに対
応するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。

【図１０】実施例３におけるプラスミドｐＵ−Ｌ１８Ｐ
ＴＨの構築図を示す。

【図１１】実施例３におけるプラスミドｐＥ−Ｌ１８Ｐ
ＴＨの構築図を示す。

【図１２】実施例３における、〔Leu¹⁸〕ヒトＰＴＨに
対応するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。

【図１３】実施例１において目的蛋白質を発現させた後
のＳＤＳ・ＰＡＧＥの結果を対照実験と共に示す。レー
ン１〜５は次のものを示す。 レーン１：分子量マーカー レーン２：ＩＰＴＧを添加したプラスミドｐＥ−ＰＴＨ
（５−８４）を保持する大腸菌株培養液（１０μｌ）。 レーン３：ＩＰＴＧを添加しないプラスミドｐＥ−ＰＴ
Ｈ（５−８４）を保持する大腸菌株培養液（１０μ
ｌ）。 レーン４：ＩＰＴＧを添加したヒトＰＴＨ発現株培養液
（１０μｌ）。 レーン５：ＩＰＴＧを添加しないヒトＰＴＨ発現株培養
液。

【図１４】実施例２において目的蛋白質を発現させた後
のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を対照実験と共に示す。 レーン１：ヒトＰＴＨ（１μg) レーン２：ＩＰＴＧを添加後のプラスミドｐＥ・Ｃ３５
ＰＴＨを保持しない大腸菌株の培養液（１０μｌ）。 レーン３：ＩＰＴＧを添加後のプラスミドｐＥ・Ｃ３５
ＰＴＨを保持する大腸菌株培養液（１０μｌ）。

【図１５】図１４のウエスタンブロッティングを示す。

【図１６】実施例２における精製〔Cys³⁵〕ヒトＰＴＨ
のＨＰＬＣのカラムクロマトグラムを示す。カラム；YM
C ODS A-303 4.6×250mm；溶出条件：０分（0.1% TFA
含有30% アセトニトリル）→30分（0.1% TFA 含有 38%
アセトニトリル）の直線濃度勾配、流速１ml／分。

【図１７】実施例２における精製〔Cys³⁵〕ヒトＰＴＨ
のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（18%ポリアクリルアミド）の結果
を示す。 レーン１：分子量マーカー レーン２：ヒトＰＴＨ レーン３：〔Cys³⁵〕ヒトＰＴＨ

【図１８】実施例３における〔Leu¹⁸〕ヒトＰＴＨの発
現。 レーン１：分子量マーカー レーン２：ＩＰＴＧ添加後のプラスミドｐＥ−Ｌ１８Ｐ
ＴＨを保持する大腸菌株の培養液（10μl)。 レーン３：ＩＰＴＧを添加しない、プラスミドｐＥ−Ｌ
１８ＰＴＨを保持する大腸菌株の培養液（１０μｌ）。 レーン４：ＩＰＴＧを添加したヒトＰＴＨ発現株培養液
（１０μｌ）。 レーン５：ＩＰＴＧを添加したヒトＰＴＨ遺伝子を保持
しない大腸菌株の培養液（１０μｌ）。

【図１９】実施例３における精製〔Leu¹⁸〕ヒトＰＴＨ
のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。

【図２０】実施例４における精製〔Leu⁸〕ヒトＰＴＨの
ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。

【図２１】実施例４で得られた〔Leu⁸〕ヒトＰＴＨに対
応するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示した図であ
る。

【図２２】実施例５で得られた〔Leu⁸〕ヒトＰＴＨ（７
−８４）の発現プラスミドの構築図である。

【図２３】実施例５において目的蛋白質を発現させた後
のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。 レーン１：分子量マーカー レーン２〜４：ＩＰＴＧを添加後のMM294(DE3)／pE-L8P
TH(7-84) の全菌体。〔Leu⁸〕ヒトPTH(7-84) が発現さ
れている。 レーン５：ヒトＰＴＨをコードする遺伝子を有する大腸
菌にＩＰＴＧを添加してヒトＰＴＨを発現させた全菌
体。 レーン６：標準ヒトＰＴＨ（１−８４）（１μｇ） ゲルはクマシーブルーで発色させた。

【図２４】実施例５における精製〔Leu⁸〕ヒトＰＴＨ
（７−８４）のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。

【図２５】実施例５で得られた〔Leu⁸〕ヒトＰＴＨ（７
−８４）に対応するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示
した図である。

【図２６】実施例６におけるプラスミドｐＵ・L8,18ＰＴ
Ｈの構築図を示す。

【図２７】実施例６におけるプラスミドｐＥ・L8,18ＰＴ
Ｈの構築図を示す。

【図２８】実施例６で得られた〔Leu⁸'¹⁸〕ヒトＰＴＨ
に対応するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示した図で
ある。

【図２９】実施例６における精製〔Leu⁸'¹⁸〕ヒトＰＴ
ＨのＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。

【図３０】参考例４で得られた、逆相高速液体カラムク
ロマトグラフィーの結果を示す。

【図３１】参考例５で得られた、逆相高速液体カラムク
ロマトグラフィーの結果を示す。

【図３２】参考例６で得られた、逆相高速液体カラムク
ロマトグラフィーの結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＢＪ ＡＤＤ ＡＥＧ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列にお
   いて、（１）Ｎ末端部アミノ酸残基が３ないし６個欠
   損、（２）少なくとも１個のメチオニン残基が他の脂溶
   性アミノ酸残基で置換、（３）アミノ酸残基番号３４か
   ら４７位の領域中のいずれか１個のアミノ酸残基がシス
   テイン残基で置換、のうち少なくとも１つの変換をして
   なるヒト副甲状腺ホルモンムテイン。
2. 【請求項２】Ｎ末端部アミノ酸残基３ないし６個を欠損
   し、かつ少なくとも１個のメチオニン残基を他の脂溶性
   アミノ酸残基で置換してなる請求項１記載のヒト副甲状
   腺ホルモンムテイン。
3. 【請求項３】Ｎ末端部アミノ酸残基３ないし６個を欠損
   し、かつアミノ酸残基番号３４から４７位の領域中のい
   ずれか１個のアミノ酸残基をシステイン残基で置換して
   なる請求項１記載のヒト副甲状腺ホルモンムテイン。
4. 【請求項４】少なくとも１個のメチオニン残基を他の脂
   溶性アミノ酸残基で置換し、かつアミノ酸残基番号３４
   から４７位の領域中のいずれか１個のアミノ酸残基をシ
   ステイン残基で置換してなる請求項１記載のヒト副甲状
   腺ホルモンムテイン。
5. 【請求項５】さらにＮ末端部アミノ酸残基３ないし６個
   を欠損してなる請求項４記載のヒト副甲状腺ホルモンム
   テイン。
6. 【請求項６】請求項１，２，３，４または５記載のヒト
   副甲状腺ホルモンムテインをコードする塩基配列を有す
   る組み換えＤＮＡ。
7. 【請求項７】請求項６記載の組み換えＤＮＡを含有する
   ベクター。
8. 【請求項８】請求項６記載の組み換えＤＮＡが大腸菌Ｔ
   ７プロモーターの制御領域に挿入されているベクター。
9. 【請求項９】請求項６記載の組み換えＤＮＡにより形質
   転換された形質転換体。
10. 【請求項１０】請求項９記載の形質転換体を培地に培養
    することを特徴とするヒト副甲状腺ホルモンムテインの
    製造法。