KR100249534B1 - 펩티드의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

시스테인 없는 펩티드는 N-말단에 시스테인을 갖는 단백질 및 N-말단에 연결된 시스테인이 없는 단백질로 구성된 융합 단백질을 제조한 후에, 융합 단백질을 펩티드 결합을 분해하는 반응을 시킴으로써 제조된다.

Description

펩티드의 제조방법
제1도는 본 발명의 반응 개략도이다.
제2도는 글루코오즈-의존 인슐린 유발 폴리펩티드(GIP)의 아미노산 서열을 나타낸다.
제3도는 글루카곤-유사 펩티드(GLUCAGON-LIKE PEPTIDE, GLPI)의 아미노산 서열(7-37)을 나타낸다.
제4도는 상피소체 호르몬(PTH)의 아미노산 서열을 나타낸다.
제5도는 참고예 1에서 수득되는 플라스미드 pHP901의 조립 개략도이다.
제6도는 참고예 1에서 수득되는 플라스미드 pME901의 조립 개략도이다.
제7도는 참고예 1에서 수득되는 플라스미드 pCM901의 조립 개략도이다.
제8도는 실시예 1에서 사용되는 유전자 단편을 나타낸다.
제9도 및 제10도는 실시예 1에서 수득되는 플라스미드 pGS23의 조립 개략도이다.
제11도 및 제12도는 실시예 1에서 수득되는 융합 단백질의 전체 아미노산 서열을 나타낸다.
제13도는 실시예 5에서 수득되는 플라스미드 pTB960-1의 조립 개략도이다.
제14도는 실시예 5에서 수득되는 플라스미드 pTB960-2의 조립 개략도이다.
제15도는 실시예 5에서 수득되는 플라스미드 pTB960-3의 조립 개략도이다.
제16도는 실시예 6에서 수득되는 인슐리노트로핀을 코딩하는 DNA 서열을 나타낸다.
제17도는 실시예 6에서 수득되는 플라스미드 pTB960-7의 조립 개략도이다.
제18도는 실시예 6에서 수득되는 GLP-I(7-37)-hbFGF 뮤테인 CS23의 아미노산 서열을 나타낸다.
제19도는 실시예 7에서 수득되는 DNA 단편을 나타낸다.
제20도는 실시예 7에서 수득되는 이중 스트랜드 hPTH의 조립 개략도이다.
제21도는 실시예 7에서 수득되는 이중 스트랜드 DNA의 제조방법을 나타낸다.
제22도는 실시예 7에서 수득되는 플라스미드 pE-PTH의 조립 개략도이다.
제23도는 실시예 7에서 수득되는 플라스미드 pU-C35PTH를 제조하기 위한 특정부위의 돌연변이유발 방법을 나타낸다.
제24도는 실시예 7에서 수득되는 플라스미드 pE-C35PTH의 조립개략도이다.
제25도는 실시예 7에서 수득되는 [Cys35] 인간 PTH 를 코딩하는 DNA 서열 및 그의 추론된 아미노산 서열을 타나낸다.
제26도는 실시예 7에서 [Cys35]인간 PTH의 제조를 나타내는 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(Comassie Brilliant Blue로 염색됨)을 나타내며, 여기에서 레인 1은 인간 PTH의 표준샘플을, 레인 2는 [Cys35]인간 PTH 유전자가 없는 플라스미드를 함유하는 형질전환체의 추출물을, 레인 3은 IPTG에 의한 유도후의 플라스미드 pE-C35PTH를 함유하는 형질전환체의 추출물을 나타낸다.
제27도는 제26도의 웨스턴 법(Western blotting)의 결과를 나타낸다.
제28도는 실시예 7에서의 역상 HPLC의 결과를 나타낸다.
제29도는 SDS-PAGE의 결과를 나타내며, 여기에서 레인 1은 분자량 마커를, 레인 2는 표준 인간 PTH를, 레인 3은 실시예 7에서 수득되는 정제된 [Cys35]인간 PTH를 나타낸다.
제30도는 실시예 7에서의 역상 HPLC의 결과를 나타낸다.
제31도는 실시예 8에서의 역상 HPLC의 결과를 나타낸다.
제32도는 실시예 9에서의 역상 HPLC의 결과를 나타낸다.
제33도는 실시예 10, 11 및 12에서의 역상 HPLC의 결과를 나타낸다.
본 발명은 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하고 이렇게 수득된 단백질 또는 폴리펩티드에서 상기 융합 단백질 또는 폴리펩티드의 시스테인 잔기에서의 펩티드 결합을 분해하는 것을 특징으로 하는 시스테인이 없는 펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술을 이용하여 펩티드를 제조하기 위하여는 펩티드가 세포내에서 분해되기 쉬우므로, 주로 융합 단백질 형태로 펩티드를 발현시킨다. 융합 단백질로 부터 목적 펩티드를 분해하는 공지 방법은 시아노겐 브로마이드를 사용하는 화학적 방법(Itakura 일행, Science, 198, 1056(1977)또는 효소 팩터 Xa를 사용하는 효소적 방법(Nagai 일행, Methods in Enzymology, 153, 46(1987))이 있다.
선행 기술 방법에 있어서 시아노겐 브로마이드를 사용할때, 메티오닌-함유 펩티드가 제조될 수 없으며 ; 팩터 Xa가 사용될 경우에는 목적 펩티드의 수율이 매우 낮다는 문제점이 발생한다.
분해 방법으로서는, 아실 시스테인 결합이 2-니트로-5-티오시아노벤조산에 의해 분해되는 방법이 공지되어 있다(Seikagaku Jikken Koza(생화학실험), 1, Chemistry of Protein, pp. 247 ~ 250, Tokyo Kagaku Dohjin).
이러한 상황에서, 본 발명자들은 시아노겐 브로마이드 또는 팩터 Xa를 사용하지 않고 융합 단백질로 부터 목적 단백질을 효율적으로 분해하기 위한 방법을 연구하였으며 N-말단에 시스테인을 갖는 단백질 및 유전자 조작 기술 또는 화학 합성에 의해 N -말단에 연결된 시스테인이 없는 펩티드로 구성된 융합 단백질을 제조하고 융합 단백질을 펩티드 결합을 분해하는 반응을 시킴으로써 목적하는 시스테인이 없는 펩티드를 효율적으로 제조할 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 이 발견을 기초로 하여 더 연구하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기를 제공한다 :
(1) N-말단에 시스테인을 갖는 단백질 및 N-말단에 연결된 시스테인이 없는 펩티드로 구성되는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 벡터 함유 형질전환체를 배양하여 상기 융합 단백질을 발현시키고 발현된 단백질을 시스테인 잔기의 아미노산 부분에서 펩티드 결합을 분해하는 반응을 시키는 것을 특징으로 하는 시스테인이 없는 펩티드의 제조방법 ;
(2) 시스테인이 없는 펩티드가 N-말단에 시스테인을 갖는 펩티드의 N-말단에 연결된 구조를 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 조립하고, 상기 유전자를 운반하는 벡터를 함유하고 있는 형질전환체를 배양하여 단백질을 발현시키고, 발현된 단백질을 시스테인 잔기의 아미노기 부분에서 펩티드 결합을 분해하는 반응을 시키는 것을 특징으로 하는 시스테인이 없는 펩티드의 제조방법 ;
(3) 시스테인이 없는 펩티드가 N-말단에 연결된 시스테인을 갖는 펩티드의 N- 말단에 연결되어 있는 구조를 갖는 폴리펩티드를 화학적으로 합성하고, 이렇게 수득된 펩티드를 시스테인 잔기의 아미노기 부분에서 펩티드 결합을 분해하는 반응을 시키는 것을 특징으로 하는 시스테인이 없는 펩티드의 제조방법 ;
(4) 상기 방법(1), (2) 또는 (3)에 있어서, 아미노 화합물 또는 치환 아미노 화합물을 펩티드 결합을 분해하기 위한 반응에 사용하여 시스테인이 없는 펩티드의 아미드 또는 치환 아미드 유도체를 제조하는 방법.
(5) 하기 구조식(Ⅰ)의 펩티드 또는 그의 염.
R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-R3-R4-R5-
His-Leu-Asn-Ser-R6-R7-Arg-R8-Glu-R9-Leu-R10-R11-R12-
Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R13(Ⅰ)
[상기식에서, R1은 Ser 또는 Aib를 나타내고 ; R2는 Met 또는 천연 소수성 아미노산을 나타내며 ; R3는 Leu, Ser, Lys 또는 방향족 아미노산을 나타내며 ; R4는 Gly 또는 D--아미노산을 나타내며 ; R5는 Lys 또는 Leu를 나타내며 ; R6은 Met 또는 천연 소수성 아미노산을 나타내며 ; R7은 Glu 또는 염기성 아미노산을 나타내며 ; R8은 Val 또는 염기성 아미노산을 나타내며 ; R9는 Trp 또는 2-(1,3-디티올란-2-일) Trp를 나타내며 ; R10은 Arg 또는 His를 나타내며 ; R11은 Lys 또는 His를 나타내며 ; R12는 Lys, Gln 또는 Leu를 나타내며 ; R13은 페닐알라닌 치환 아미드를 나타낸다.]
구조식(Ⅰ)에 있어서, Aib는 아미노이소부티르산을 나타낸다. R2및 R6의 천연 소수성 아미노산은 동물, 식물 또는 미생물로 부터의 천연 단백질로 구성된 아미노산중의 하나이며, Leu, Ile, Val, Phe 및 Trp를 포함한다. R3의 방향족 아미노산은 Phe, β-나프틸 Ala, Trp 및 Tyr을 포함한다. R4의 D--아미노산은 임의의 D--아미노산일 수 있으며, D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(But), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D-B-나프틸-Ala, D-Trp, D-Tyr, D-Lys, D-Lys(Fmoc), D-Phe 및 D-Asn을 포함한다. R7및 R8의 염기성 아미노산은 Arg, Lys, Asn 및 His를 포함한다.
치환 아미노로서는, 일-또는 이-치환 아미노를 예로들 수 있다. 치환기의 예를 들면, (i) 치환기가 없거나, 탄소원자상에 하나 내지 세개의 아미노 또는 히드록실기 치환기를 가질 수 있는 C1~20알킬, C3~8시클로알킬, 아릴 또는 아릴-C1~3알킬기, (ii) 아미노 또는 치환 아미노, 또는 (iii) 히드록실 또는 C1~6알콕실기이다.
(ⅱ)의 치환 아미노로서, 아미노산 및 2 내지 10 개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 예로들 수 있다.
상기 C1~20알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 1-에틸펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 옥틸, 모나밀, 데카닐, 운데카닐, 도데카닐, 테트라데카닐, 펜타데카닐, 헥사데카닐, 헵타데카닐, 옥타데카닐, 모나데카닐 또는 에이코사닐을 포함한다.
C3~8시클로알킬의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 또는 시클로옥틸을 포함한다.
아릴의 예는 페닐, 나프틸, 안트릴, 페난트릴 또는 아세나프틸레닐을 포함한다.
아릴-C1~3알킬의 예는 벤질, 페네틸, 3-페닐프로필(1-나프틸)메틸 또는(2-나프틸)메틸을 포함한다.
C1~6알콕실기의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 펜틸옥시 또는 헥실옥시를 포함한다.
아미노산의 예는 Ala, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val을 포함한다.
펩티드의 예는 H-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5또는 H-Val-Ala-Leu-D-Ala-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-OH를 포함한다.
염의 예는 무기 염기와의 염, 예컨대 나트륨 및 암모늄, 유기 염기와의 염, 예컨대 트리에틸아민, 에틸아민 및 메틸아민, 무기산과의 염, 예컨대 히드로클로라이드, 술페이트 및 니트레이트 및 유기산과의 염, 예컨대 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 타르트레이트 및 시트레이트를 포함한다.
본 발명에 있어서, 목적하는 펩티드는 시스테인이 없는 한 임의의 펩티드 일 수 있다. 시스테인이 없는 펩티드로서, 분자량 100 내지 12000, 바람직하게는 200 내지 7000의 펩티드를 예로들 수 있다. 또한, 시스테인이 없는 펩티드로서 2 내지 100개의 아미노산, 바람직하게는 3 내지 70개의 아미노산을 함유하는 펩티드를 예로들 수 있다. 상기 펩티드의 예는 부신피질자극 호르몬(ACTH), 상피소체 호르몬(PTH), 엔케팔린(enkephalin), 엔도르핀(endorphin), 다양한 오피오이드(opioid)펩티드, β-멜라노사이트(melanocyte)자극 호르몬, 글루코오즈-의존 인슐린 자극 폴리펩티드(GIP), 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드(GLP-I 및 Ⅱ), 모틸린(motilin), 티모포이에틴(Thymopoietin), 티모신(thymosin), 유비퀴틴(ubiquitine), 세륨 티믹 인자(serum thymic factor), 티믹 액소성 인자(thymic humoral factor), 다양한 퀴닌(quinine), 뉴로텐신(neurotensin), 터프트린(tuftsin) 및 이들 펩티드의 단편을 포함한다.
다수의 펩티드는 그들의 C-말단에서 아미드를 또는 그들의 분자내에서 -S-S- 결합을 갖는다. 이들 또한 목적하는 펩티드에 포함된다. 상기 펩티드의 예는 가스트린(gastrin), 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 결합 펩티드, 콜레시스토키닌-판크레오지민(cholecystokinin-pancreozymin, CCK-PZ) 엘레도이신(eledoisin), 상피조직 성장 인자(EGF), 종양 성장 인자(TGF-), 판크레아스타틴(pancreastatin), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 황체화 호르몬-방출호르몬(LH-RH), 멜리틴(mellitin), 옥시토신(oxytosin), 바소프레신(vasopressin), 판크레아틴 폴리펩티드(pancreatic polypeptide), 트립신 저해제, 릴랙신(relaxin), 세크레틴(secretin), 소마토스타틴(somatostatin), 소마토메틴(somatomedin), 서브스턴스 P(substance P), 뉴로텐신(neurotensin), 캐룰레인(caerulein), 티로트로핀-방출 호르몬(TRH), 바소액티브 인테스티날 폴리펩티드(vasoactive intestinal polypeptide, VIP), 뇌하수체 아데닐 시클라제-활성 폴리펩티드(pituitary adenyl cyclase-acivating polypeptide, PACAP), 가스트린-방출 펩티드(GRP), 엔도세린(endotherin), 코르티코트로핀 방출 인자(CRF), 성장 호르몬-방출 인자(GRF), PTH-관련 단백질, 갈라닌(galanin), 펩티드 YY, 뉴로펩티드 Y, 판크레아스타틴(Pancreastatin), 아트리알 나트리우레틱 펩티드(atrial natriuretic peptide)및 이들 펩티드의 단편을 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 N-말단에 시스테인을 갖는 펩티드는 한정되지는 않는다. N-말단에 시스테인을 갖지 않는 임의의 펩티드도 사용전에 그의 N-말단에 시스테인이 부여될 수 있는한 사용될 수 있다. N-말단에 시스테인을 갖는 펩티드로서, 분자량 100 내지 100,000, 바람직하게는 300 내지 50,000의 펩티드를 예로 들 수 있다. 또한, N-말단에 시스테인을 갖는 펩티드로서, 또한 1 내지 1000개의, 바람직하게는 3 내지 500개의 아미노산을 갖는 펩티드를 예로들 수 있다.
상기 펩티드의 예는 인터페론(interferon), 인터류킨(interleukin), 섬유아세포 성장 인자(FGR)와 같은 그의 N-말단에 시스테인을 갖는 것들, (프로) 우로키나제((pro)urokinase), 림포톡신(lymphotoxin), 종양 괴사 인자(TNF) 및 β-갈락토시다제와 같은 효소 단백질, 저장 단백질, 스트렙토아비딘(streptoavidin), 단백질 A, 단백질 G 및 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA)를 포함하며, 이들 중 약간은 그들의 N-말단에 시스테인을 가질 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 유전자는, (1) 전체 염기 서열을 합성하는 화학적 합성, 또는 (2) 단백질을 코딩하는 염기서열의 N-말단면상에 시스테인을 코딩하는 염기 서열을 위치시키고 시스테인이 없는 펩티드를 코딩하는 염기서열을 N-말단면상에 위치시킴에 의해 조립될 수 있다. 또한 상기 펩티드의 단편을 얻고자 하는 경우에, 유전자는 (3) 목적하는 단편 바로 뒤의 아미노산 잔기를 시스테인으로, 예를 들면 특정 부위 돌연변이 유발 또는 다른 기술에 의해 치환함으로써 조립될 수 있다.
상기 (1)의 경우에 있어서, 목적하는 유전자는 전체 서열을 한번에 또는 너무 길다면, 예를 들면 포스포아미다이드법, 인산 트리에스테르법, 디에스테르법 또는 수소 포스포네이트법에 의해 개별적으로 합성한 후에 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결함으로써 제조할 수 있다.
상기 (2)의 경우에 있어서는, 목적하는 유전자를 하기와 같이 수득할 수 있다 : C -말단 단백질을 코딩하는 유전자는 염색체를 적절한 제한 효소로 분해한 후, 벡터와 연결시킴으로써 또는 cDNA를 수득한 다음, 이를 제한 효소로 분해하여 그의 N-말단에 시스테인이 존재하게 하거나, 합성 DNA를 전체 단백질 또는 그의 부분 유전자의 5'-말단에 합성 DNA를 연결시킴으로써 변성시켜 N-말단에 시스테인을 갖도록 함으로써 수득된다. 5'-말단에 목적 단백질을 코딩하는 유전자(화학적으로 합성되거나 생체로부터 클로닝될 수 있다)를 연결시킨다.
상기 DNA를 예를 들면 하기와 같다 :
(ⅰ) TACGCGGAAGGGACTTTCATCAGTGACTACAGTATTGCCATGGACAAG
ATTCACCAACAAGACTTTGTGAACTGGCTGCTGGCCCAAAAGGGGAA
GAAGAATGACTGGAAACACAACATCACCCAGTGC 또는 TGTR
(ⅱ)
TCTGTGAGTGAAATACAGCTTATGCATAACCTGGGAAAACATCTGAAC
TCGATGGAGAGAGTAGAATGGCTGCGTAAGAAGCTGCAGGATGTGCA
CAATTTTTGC 또는 TGTR
(ⅲ)
CATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGC
CAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGGCCGAGGA
TGC 또는 TGTR
DNA(ⅰ)은 글루코오즈-의존 인슐린 자극 폴리펩티드를 코딩하고 ; DNA(ⅱ)는 상피소체 호르몬의 1-34 아미노산 서열에 상응하는 펩티드, PTH(1-34)를 코딩하고 ; DNA(ⅲ)는 글루카곤-유사펩티드 I(7-37)[GLP-I(7-37)(인슐리노트로핀)]을 코딩한다.
이들 구조식에서, R은 하기와 같은 염기서열을 나타낸다 :
CCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGAC
CCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGA
GTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAG
AGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGAGCGCTAATCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGAT
GGAAGATTACTAGCTTCTAAGTCTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAA
TCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAA
CGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTT
CTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGC
(hbFGF의 단편).
목적하는 펩티드가 C-말단에 아미드를 갖는다면, 아미드-전환성 글리신을 코딩하는 임의의 서열 GCT, GGC, GGA 및 GGG 가 TGT 또는 TGC의 5'면에 삽입된다.
5'-말단에 그의 하부 융합 단백질을 코딩하는 영역인 ATG와 더 하부로의 번역 종결 코돈을 갖는 DNA(플라스미드)를 화학 합성에 의해 또는 공지된 유전공학에 의해 제조된 상기 단백질의 cDNA 또는 상기 단백질의 염색체-유도 DNA를 가공함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 (2)경우에 있어서, 통상적인 DNA에 기술에 덧붙여서, 특정 부위 돌연변이 유발을 사용하여 시스테인이 없는 펩티드가 N-말단에 시스테인을 갖는 펩티드의 N-말단에 연결되어 있는 구조를 갖는 단백질으 코딩하는 유전자를 제조한다.
상기 기술은 공지되어 있으며, Genetic Engineering, Lather, R.F. 및 Lecop, J.P., Academic Press, pp. 31 내지 50(1983)에 기술되어 있다. 올리고뉴클레오티드로의 돌연변이 유발은 Genetic Engineering : Principles and Methods, Smith, M. 및 Gillam, S., Plenum Press, Vol. 3, pp, 1 내지 32(1981)에 기술되어 있다.
상기 단백질을 코딩하는 구조적 유전자의 제조는 하기와 같이 실행될 수 있다 :
(a) 구조 유전자의 하나의 스트랜드만을 포함하는 단일 - 스트랜드 DNA를 돌연변이 유발 올리고뉴클레오티드 프라이머와 잡종형성시키고,
(b) DNA 폴리머라제를 사용하여 프라이머를 연장시켜서 돌연변이 헤테로 이중쇄를 형성하고,
(c) 돌연변이 이중쇄를 복제시킨다.
올리고뉴클레오티드 프라이머의 크기는 프라이머를 돌연변이가 도입되는 유전자 영역으로의 안정한 잡종형성에 필수적인 조건 및 일반적으로 사용되는 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서의 제한에 의존한다. 올리고뉴클레오티드에 의한 돌연변이 유발에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 고안할때 고려해야 하는 요소(예를 들면, 뉴클레오티드의 전체 크기 및 돌연변이 부위에서의 부적정 부분의 크기)가 상기 문헌에 Smith, M. 및 Gillam, S.에 의해 기술되어 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 전체 길이는 돌연변이 부위에서의 안정하고 유일한 잡종형성이 최적화되는 길이로 조정되며, 돌연변이 부위와 5'- 및 3'-말단 사이가 충분한 길이로 연장되어 DNA 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성으로 인한 돌연변이 교정(editing)을 방지한다.
본 발명에 따른 돌연변이유발에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 통상적으로, 12 내지 24개의 염기, 바람직하게는 14 내지 20개의 염기, 보다 바람직하게는 14 내지 18개의 염기를 함유한다. 이들은 통상적으로 변경될 코돈의 적어도 약 세개의 염기 3'-말단을 함유한다.
상기 구조식(Ⅰ)로 나타낸 펩티드는 인간 PTH의 유도체이다. 원래의 인간 PTH 의 아미노산 서열은 하기와 같다 :
예를 들면, 인간 PTH(1-84)를 코딩하는 유전자로 부터, 구조식(Ⅰ)의 펩티드를 코딩하는 유전자를 특정부위 돌연변이 유발 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 인간 PTH내의 발린이 시스테인으로 치환된 뮤테인이 수득될때, 뮤테인을 코딩하는 유전자가 합성 뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 특정 부위 돌연변이 유발방법에 의해 제조된다.
예를 들면, 인간 PTH의 35-위치에서의 발린이 시스테인으로 치환될 때, 바람직한 프라이머는 5'-CACAATTTTTGCGCCTTAGG-3'(올리고뉴클레오티드 프라이머 A)를 포함한다.
프라이머는 M13[Yanisch-Perror, C., Vieira, J. Messing, Gene, 33, 103~ 119(1985) ; Messing J., Methods in Enzymology, 101, 20~78(1983)]와 같은 단일 스트랜드 파아지로 잡종형성되고, 인간 PTH 유전자의 단일 스트랜드 DNA, fd [R. Herrman 일행, Molecular and General Genetics, 177, 231(1980)] 또는 Φ×174 [M. Smith 및 S. Gillam, Genetic Engineering, Plenum Press, Vol. 3, pp. 1 ~ 32(1981)] 또는 파아지-플라스미드 키메릭 벡터, 예컨대 pUC118 또는 pUC119[J. Vieira 및 J. Messing, Methods in Enzymology, 153, 3 ~ 11(1987)]로 부터 클로닝된다. 파아지는 유전자의 센스(sense) 사슬 및 안티센스(antisense)사슬을 모두 함유할 수 있는 것으로 여겨진다. 파아지가 안티센스 사슬을 함유할 경우, 프라이머는 코돈 퇴화성으로 인하여, 돌연변이될 코돈과의 불일치에 덧붙여서 이 코돈을 함유하는 센스 사슬 영역과 일치하지 않게 되어 다른 아미노산을 코딩하는 트리플렛을 결정한다. 유사하게, 파아지가 센스 사슬을 함유할 경우, 프라이머는 결실될 코돈과 쌍을 형성할 트리플렛내의 적절한 불일치를 제외하고는 돌연변이될 코돈을 함유하는 센스 사슬영역과 상보적이지 않을 것이다. 이 잡종형성에 사용되는 조건은 상기 문헌에 M. Smith 및 S. Gillam에 의해 기술되어 있다. 온도는 통상적으로 0℃ 내지 70℃, 보다 통상적으로는 10 내지 50℃ 이다. 잡종 형성 후에 프라이머는, 파아지 DNA 상에서 에스케리키아 콜리 DNA 폴리머라제 I, T4 DNA폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase), 또는 다른 적절한 DNA 폴리머라제와의 반응에 의해 연장된다. 생성 이중 스트랜드 DNA(dsDNA)는 T4 DNA 리가제와 같은 DNA 리가제와의 처리에 의해 시클릭 dsDNA로 전환된다. 단일 스트랜드 영역을 갖는 DNA 분자는 Sl 엔도뉴클레아제 처리에 의해 파괴될 수 있다.
생성 돌연변이 유발성 헤테로 다이머는 감염성 숙주 유기체 또는 세포를 형질전환시키는데 사용된다. 숙주내에서의 헤테로 다이머의 복제시, 양쪽 사슬로 부터 오프스프링(offspring)이 출현한다. 복제후에 돌연변이 사슬 오프스프링으로 부터 돌연변이 유전자를 단리하고, 이를 적절한 벡터내로 삽입시킨다. 벡터는 적절한 숙주 유기체 또는 세포를 형질전환시키는데 사용된다.
그 다음에, 돌연변이된 유전자를 운반하는 파아지 DNA를 단리하고 플라스미드내로 삽입시킨다.
상기 융합 단백질을 코딩하는 영역을 갖는 DNA 를 운반하는 플라스미드를 제조하기 위해 벡터로서 사용되는 플라스미드의 예는 ColEI-유도 플라스미드, 예컨대 pBR322 [Gene, 2, 95(1977)], pBR313 [Gene, 2, 75(1977)], pBR324, pBR325 [Gene, 4, 124 1978)], pBR327, pBR328 [Gene, 9, 287(1980)], pBR329 [Gene, 17, 79(1982)], pKY2289 [Gene, 3, 1(1978)], pKY2700 [Seikagaku, 52, 770(1980)], pACYC177, pACYC184 [Journal of Bacteriology, 134, 1141(1978)], pRK248, pRK646, pDF [Methods in Enzymology, 68, 268(1979)], pUC12 [Gene, 19, 259(1982)], pUC13 [Gene, 19, 259(1982)], pUC18, pUC19 [Janisch - Perror 일행, Gene, 33, 103(1985)], pUB110, pTP5, pC194, pSH19 및 pSH15를 포함한다. 또한 상기 예는 λ파아지 또는 다른 박테리오파아지, 예컨대 λgtㆍ λC [Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 71, 4579(1974)], λgt·λB [Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 72, 3461(1975)]. λDam [Gene, 1, 255(1977)], 케론(charon)벡터 [Science, 196, 161(1977) ; Journal of Virology, 29, 555(1979)]를 사용하는 벡터 및 선상 파지, 예컨대 mp18 및 mp19 [Janisch-Perror 일행, Gene, 33, 103(1985)] 를 사용하는 mp 벡터를 포함한다.
DNA는 바람직하게 ATG의 프로모터 상부를 가지며, 형질전환체를 제조하기 위한 숙주에 적절하다면 임의의 프로모터가 허용가능하다.
상기 프로모터의 예는 에스케리키아 콜리에 대한 trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, 1pp 프로모터 및 T-7 프로모터, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 대한 SP01 프로모터, SP02 프로모터 및 penP 프로모터, 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)대한 PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터 및 ADH 프로모터 및 동물세포에 대한 SV40-유도 프로모터를 포함한다. SD(Shine 및 Dalgarno)서열은 필요하다면 프로모터의 하부에 삽입될 수 있다.
T-7 프로모터 시스템을 사용할때, T-7 프로모터는 T7DNA 상에서 발견되는 17개의 프로모터중 임의의 프로모터일 수 있다 [J. L. Oakley 일행, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 4266 ~ 4270(1977); M. D. Rosa, Cell, 16, 815 ~ 825(1979) ; N. Panayotatoes 일행, Nature, 280, 35(1979) ; J. J. Dunn 일행, J. Mol. Biol., 166, 477 ~ 535(1983)]. 그들 중에서, Φ10 프로머터 [A. H. Rosenberg 일행, Gene, 56, 125 ~ 135(1987)]가 가장 바람직하다.
에스케리키아 콜리 시스템 내에서 작동하는 한 임의의 전사 터미네이터가 사용될 수 있으나 TΦ 터미네이터 [F. W. Studier 일행, J. Mol. Biol., 189, 113~ 130(1986)] 가 바람직하다.
T7 RNA 폴리머라제 유전자는 T7 유전자[F. W. Studier 일행, J. Mol. Biol., 189, 113~130(1986)]의 한예이다.
벡터는 T7 프로모터 및 T7 터미네이터를 상기 벡터내로 삽입함으로써 조립된다. 그러한 벡터의 예는 pET-1, pET-2, pET-3, pET-4 및 pET-5[A. H. Rosenberg, Gene, 56, 125~135(1987)]을 포함하며, 바람직하게는 pET-3C[A. H. Rosenberg] 이다.
본 발명의 형질전환체는, 숙주를 공지방법[예, Cohen S. N. 일행의 방법, Proceedings of National Academy of Science, USA, 69, 2110(1972)]을 사용하여 수득한 발현 플라스미드로 형질전환시킴으로써 제조될 수 있다.
형질전환될 숙주의 예는, 에스케리키아 종에 속하는 세균, 바실러스 종에 속하는 세균, 효모 및 동물세포를 포함한다.
에스케리키아 종에 속하는 세균의 예는 에스케리키아 콜리, 특히 에스케리키아 콜리 K12DH1 [Proceedings of National Academy of Science, USA, 60, 160(1968)], JM-103 [Nucleic Acids Research, 9, 309(1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517(1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459(1969)], C600 [Genetics, 39, 440(1954)], N4830 [Cell, 25, 713(1981)], K-12MM294 [Proceedings of National Academy of Science, USA, 73, 4174(1976)] 및 BL21을 포함한다.
바실러스 종에 속하는 세균의 예는 바실러스 서브틸리스, 특히 바실러스 서브틸리스 MI114[Gene, 24, 255(1983)] 및 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87(1984)]를 포함한다.
효모의 예는 사카로마이세스 세레비지아, 특히 사카로마이세스 세레비지아 AH22[Proceedings of National Academy of Science, USA, 75, 1929(1978)], XSB 52-23C [Proceedings of National Academy of Science, USA, 77, 2173(1980)], BH-641A(ATCC 29339), 20B-12 [Genetics, 85, 23(1976)] 및 GM3C-2 [Proceedings of National Academy of Science, USA, 78, 2258(1981)] 을 포함한다.
동물의 세포의 예는 원숭이 세포 COS-7[Cell, 23, 175(1981)], Vero [Japanese Journal of Clinical Medicine, 21, 1209(1963)], 중국 햄스터 세포 CHO [Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1985)], 생쥐 L 세포 [Journal of National Cancer Institute, 4, 165(1943)], 인간 FL 세포 [Proceedings of the Society for Experimental Biology and medicine, 94, 532(1957)] 및 햄스터 C 세포를 포함한다.
T-7 프로모터 시스템을 사용할때, T7 RNA 폴리머라제 유전자(T7 유전자 1)[F.W. Studier 일행, J. Mol. Biol., 189, 113~130(1986)] 를 포함하는 에스케리키아 콜리 균주인한, 임의 숙주세포, 예컨대 MM294, DH-1, C600, JM109, BL21 또는 T7 RNA 폴리머라제 유전자(T7 유전자 1)와의 다른 플라스미드를 갖는 에스케리키아 콜리 균주가 사용될 수 있어서 목적하는 형질전환체를 수득할 수 있다. T7 유전자 1을 포함하는 λ파아지의 용원화(lysogenization)에 의해 생성된 MM294 균주 또는 BL21 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우에, lac 프로모터가 T7 유전자 1의 프로모터로서 사용되며, 이는 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(약어로서 IPTG로도 언급)의 존재하에 발현을 유도한다.
숙주, 바실러스 종의 형질 전환은 공지방법, 예컨대 Molecular ＆ General Genetics, 168, 111(1979)의 방법을 사용하여 실행될 수 있다.
숙주, 효모의 형질 전환은, 공지방법, 예컨대 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978)의 방법을 사용하여 실행될 수 있다.
숙주, 동물 세포의 형질 전환은, 공지방법, 예컨대 Virology, 52, 456(1973)의 방법을 사용하여 실행될 수 있다.
융합 단백질은 상기 형질전환체를 배양하고, 융합 단백질을 배양배지내에 제조하고 축적시킨 다음 수득함으로써 제조될 수 있다.
배지의 pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하다.
에스케리키아 종의 세균 배양을 위한 적절한 배지의 예는 클루코오즈 adn 카사미노산을 함유하는 M9 배지 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431 ~ 433, Cold Spring Harbor Labaratory, New York(1972)]일 수 있다. 프로모터의 효율을 증가시키기 위해 필요하다면 3β-인돌릴아크릴 산과 같은 화학약품을 거기에 첨가할 수 있다.
숙주가 에스케리키아 종의 세포라면, 배양은 약 15 내지 43℃에서, 약 3 내지 24 시간 동안 통상적으로 실행되며, 필요하다면 통기 및/또는 교반을 더 실행할 수도 있다.
숙주가 바실러스 종의 세포라면, 배양은 약 30 내지 40℃에서, 약 6 내지 24시간 동안 통상적으로 실행되며, 필요하다면, 통기 및/또는 교반을 더 실행할 수도 있다.
숙주가 효모인 경우 형질 전환체를 배양시키기에 적절한 배지는, 예를 들면 버크홀더(Burkholder)의 최소 배지[Bostian, K.L. 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505(1980)]를 언급할 수 있다. 배지의 pH는 약 5 내지 8로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상적으로 약 20 내지 35℃에서 약 24 내지 72시간 동안 실행되며, 필요하다면, 통기 및/또는 교반을 더 실행할 수도 있다.
숙주가 동물세포인 경우 형질 전환체를 배양시키기에 적절한 배지는, 예를 들면 약 0.2 내지 20%, 바람직하게는 약 5 내지 20%의 소태아혈청을 함유하는 MEM 배지 [Science, 122, 501(1952)], DMEM 배지[Virology, 8, 396(1959)], RPMI1640 배지 [Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)] 및 199 배지 [Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)]을 언급할 수 있다. 배지의 pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 약 30 내지 40℃에서, 약 15 내지 60시간동안 통상적으로 실행되며, 필요하다면, 통기 및/또는 교반을 더 실행할 수도 있다.
λcIts 리프레서 및 λPL-프로모터를 함유하는 발현벡터를 갖는 재조합 벡터를 사용할때, 형질전환체의 배양을 약 15 내지 36℃, 바람직하게는 약 30 내지 36℃의 온도에서 실행하고, 37 내지 42℃의 온도에서 λcIts 리프레서를 불활성화시키는 것이 바람직하다. 또한 recA 프로모터 효율을 증가시키기 위하여, 즉 recA 유전자 발현 억압 기능을 저하시키기 위하여, 미토마이신 C 또는 날리디신산과 같은 약품을 첨가하거나, 필요하다면 자외선을 조사시킬 수 있다.
T-7 프로모터 시스템을 사용할때, IPTG를 첨가하여 T7 파아지 RNA 폴리머라제1의 생성에 의하여 T7 프로모터를 특별하게 활성화 시킴으로서 lac 프로모터 하부에 연결된 T7 유전자(RNA 폴리머라제 유전자)를 발현시킨다.
배양후에, 세포를 공지방법에 의해 수집하고 완충액내에 현탁시키는데, 예를 들면 단백질 변성 처리, 초음파 처리, 라이소자임을 사용하는 효소 처리, 유리 비드 처리, 프렌치 프레스 처리(French press treatment), 동결-융해법 및 다른 방법에 의해 세포를 파괴시킨 후에, 원심분리 및 다른 공지방법에 의해 상청액을 수득한다.
이렇게 수득한 상청액으로 부터, 융합 단백질을 단백질 정제의 공지된 통상적인 방법에 따라서 단리시킬 수 있다. 예를 들면, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 흡수 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 전기영동을 적절하게 혼합하여 사용할 수 있다. 융합 단백질을 정제하지 않고 또는 부분적으로 정제된 상태로 다음의 반응 방법에 사용할 수 있다.
시스테인이 없는 펩티드가 N-말단에 시스테인을 갖는 펩티드의 N-말단에 연결된 구조를 갖는 폴리펩티드를 화학적으로 합성하는 본 발명의 (3)경우에 있어서, 펩티드 합성은 자동 펩티드 합성기를 사용하여 실행될 수 있다. R.B. Merrifield Advances in Enzymology 32, 221~296(1969)의 방법은 염기 합성 경로에 상응하게 사용된다. 본 방법에 있어서, 카르복실 말단의 아미노산은 수지 담체에 공유 결합되고,-아미노기의 보호기의 제거 및 보호 아미노산의 축합을 번갈아 반복하여 펩티드 사슬을 아미노말단까지 연장시켜서 목적하는 아미노산 서열을 갖는 보호 펩티드를 수득한다. 이 방법은 상기 원칙을 근거로 한다. 각각의 아미노산의 축합 및-아미노기의 보호기의 제거는 대략 유사한 조건 하에서 실행되며, 중간체의 정제는 실행하지 않는다. 펩티드를 합성하는데 있어서, 일반적으로 고도의 기술이 요구되는 것은 아니다. 또한, 본 방법에 의해 펩티드가 빨리 합성되기 때문에, 본 방법은 다양한 펩티드를 합성하는데 매우 편리하다. 이렇게 수득된 보호 펩티드 수지는 예를 들면 다양한 첨가제의 공존하에 무수 히드로겐 플루오라이드, 트리플루오로메탄술폰산 또는 트리플루오로아세트산과 반응되어서, 수지로 부터 펩티드의 제거 및 모든 보호기의 제거를 한 단계로 달성할 수 있다.
생성 조 펩티드는 펩티드 또는 단백질을 정제하는 공지 방법에 의해 정제될 수 있다. 상기 방법의 예는 다양한 원칙의 컬럼 크로마토그래피, 예컨대 겔 여과, 양이온 교환 수지 또는 음이온 교환 수지를 사용하는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 부분 흡수 크로마토그래피, 및 고성능 액체 크로마토그래피를 포함한다.
이렇게 수득된 단백질 또는 폴리펩티드를 시스테인 잔기의 아미노기 부분상의 펩티드 결합을 분해하는 반응을 시킨다.
반응을 예로 들면 시아닐화 후의 가수분해이다.
시아닐화는 출발 화합물에 S-시아닐화제를 반응시킴으로써 실행된다.
S-시아닐화제의 예는 2-니트로-5-티오시아네이토벤조산(NTCB), 1-시아노- 4-디메틸아미노피리디늄염(DMAP-CN) 및 CN-이온을 포함한다. S-시아닐화제의 양은 티올기의 총량의 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 10배이다.
반응 온도는 약 0 내지 80℃. 바람직하게는 약 0 내지 50℃의 범위내에서 임의의 온도일 수 있다. 임의의 완충액이, 시아닐화제와 반응하지 않는한 용매로서 사용될 수 있다. 상기 완충액의 예는 트리스-HCl완충액, 트리스-아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액 및 보레이트 완충액을 포함한다. 유기 용매가, 시아닐화제와 반응하지 않는 한 존재할 수 있다.
반응은 통상적으로 1 내지 12의 pH에서 실행된다. 특히 NTCB를 사용할때는, 7 내지 10의 pH가 바람직하다. DMAP-CN을 사용할때는 S-S 교환 반응을 피하기 위하여 2 내지 7의 pH가 바람직하다. 반응 혼합물은 구아니딘 히드로클로라이드와 같은 변성제를 함유할 수도 있다.
가수분해 또는 가아민분해에 의한 분해 반응은 예를 들면 알칼리처리에 의해 실행될 수 있다.
알칼리 처리는 출발 화합물을 함유하는 수용액의 pH를 6 내지 14, 바람직하게는 7 내지 14로 조정함으로써 실행될 수 있다.
상기 pH 조정은 예를 들면, 적절한 양의 나트륨 히드록사이드, 암모니아, 치환 아미노 화합물, 트리즈마 염기(트리스 [히드록시메틸]-아미노메탄), 이차 나트륨 포스페이트, 칼륨 히드록사이드, 또는 바륨 히드록사이드의 용액을 출발 화합물을 함유하는 수용액에 첨가함으로써 실행된다. 상기 치환 아미노 화합물의 예는 상기한 바와 같다.
상기 용액의 양 또는 농도는 예를 들면, 나트륨 히드록사이드 0.01~20N, 바람직하게는 약 0.1N~1N이다. 암모니아 또는 치환 아미노 화합물은 약 0.01~15N, 바람직하게는 약 0.1N~3N이다. 트리즈마 염기는 약 1mM~1M, 바람직하게는 약 20mM~ 200mM이다. 아차 아민 나트륨 포스페이트는 약 1mM∼1M, 바람직하게는 약 10mM∼100mM이다. 칼륨 히드록사이드는 약 0.01~14N, 바람직하게는 약 0.1~2N이다. 바륨 히드록사이드는 약 0.01~0.2M, 바람직하게는 약 약 0.1M~0.2M이다.
반응 온도는 약 0 내지 80℃, 바람직하게는 약 0 내지 50℃의 범위에서 임의의 온도일 수 있다. 반응시간은 예를들면 시아닐화 시간은 약 10~60분, 바람직하게는 약 15~30분이다. 가수분해 시간은 약 5분~100시간, 바람직하게는 약 10분~15시간이다. 가아민분해시간은 약 5분~24시간, 바람직하게는 약 10분∼180분이다.
제1도에 나타낸 반응은 상기한 바와 같은 시아닐화, 및 가수분해 또는 가아민 분해로 실행되는 것으로 믿겨진다. 제1도에서, X는 OH 또는 R-NH-(R-NH는 아미노 또는 치환 아미노기를 의미한다)를 나타낸다.
pH 조정시, 아미노 화합물 또는 아민 유도체 화합물을 사용하는 것은 상응하는 아미드 화합물 또는 치환 아미드 화합물의 제조를 가능하게 한다.
분해된 목적 펩티드는 공지된 펩티드 정제 방법에 따라서 정제될 수 있다. 예를 들면, 겔 여과, 이온 교화 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 박-막 크로마토그래피 및 전기 영동을 적절하게 혼합하여 사용할 수 있다. 이렇게 수득된 펩티드는 그의 N-말단에 번역 개시 코돈 ATG에 상응하는 메티오닌을 가질 수 있다.
이렇게 수득된 목적하는 펩티드를, 필요하다면 동결건조시켜서 분말로 만들 수 있다. 동결건조시, 소르비톨, 만니톨, 덱스트로오즈, 말토오즈, 트리할로오즈 또는 글리세롤과 같은 안정제를 첨가할 수 있다.
본 방법은 다양한 생활성의 펩티드를 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 GIP(글루코오즈-의존 인슐린 자극 폴리펩티드)(그의 아미노산 서열을 제2도에 나타낸다) 및 GLPI(7-37)(그의 아미노산 서열을 제3도에 나타낸다)는 생리학적 농도의 글루코오즈의 존재하에 인슐린 분비를 촉진하므로 당뇨병 치료 약품으로서 매우 안정하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 상피소체 호르몬(PTH) 및 N-말단으로부터 34개의 펩티드를 포함하는 그의 활성 단편 PTH(1-34)(그의 아미노산 서열을 제4도에 나타낸다)은 뼈의 대사를 증진시키기 때문에 골다공증의 치료약품으로서 유용하다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 펩티드는 살균수, 인간의 혈청 알부민(HSA), 생리 식염수 및 다른 공지된 생리학적으로 허용가능한 담체와 혼합되어서 비경구적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 정맥내, 근육내 또는 다른 방법에 의해, 약 2,000 내지 2,000,000U/kg, 바람직하게는 약 80,000 내지 800,000U/kg의 일일 투여량으로 비경구 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 펩티드를 함유하는 제제는 염, 희석제, 보조제 및 다른 담체, 완충제, 결합제, 계면 활성제 및 다른 생리학적으로 허용 가능한 활성 성분을 함유한다. 비-경구 제제는 살균 수용액, 생리학적으로 허용가능한 용매내의 현탁액의 앰풀 또는 각각의 사용시 생리학적으로 허용가능한 희석제와 희석시 순수하게 제조될 수 있는 살균 분말(통상적으로 펩티드 용액을 동결건조함으로써 수득된다)의 앰플로서 공급된다.
본 발명의 방법은 목적하는 펩티드를 분해함이 없이 제조할 수 있으므로 제약학적 및 다른 용도에 사용될 수 있는 펩티드를 산업적으로 대량으로 제조하는데 유리하다.
본 발명의 일반 구조식(Ⅰ)로 표시되는 인간 PTH(1-34)유도체 펩티드는 골다공증, 상피소체기능 감퇴증, 및 고혈압의 치료제로서 사용될 수 있다. 그의 형태는 주사제, 비기관 흡수제, 경직장 흡수제, 경질 흡수제, 경피 흡수제, 또는 점안제를 포함한다. 특정 경우에 있어서, 경구로 투여될 수도 있다.
펩티드가 치료제로서 사용될때, 유효량이 사용되어서 포유동물, 특히 인간을 치료한다. 비록 일반적으로 1ng 내지 100㎍/체중kg의 양으로 사용되나, 정확한 양은 당분야 숙련인에 의해 결정될 수 있다.
펩티드가 치료제로서 사용될때, 다른 세균 또는 발열물질을 함유하지 않도록 신중히 정제하여야만 한다.
골다공증등의 치료제로서 사용될때, 펩티드는 단독으로 또는 제약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 결합하여 상기 주사제, 비기관 흡수제, 경직장 흡수제, 경질 흡수제, 경피 흡수제 또는 점안제 형태로 비경구 투여될 수 있다. 주사제의 경우에, 성인에게는 1 내지 3일간 50ng/kg 내지 5mg/kg의 투여량, 바람직하게는 1 내지 3일간 1 내지 50㎍/kg의 투여량으로 펩티드를 투여하는 것이 적절하다. 주사제의 경우 치료제의 농도는 10 내지 100㎍/ml인 것이 적절하다.
본 명세서 및 첨부된 도면에서 사용되는 아미노산, 펩티드, 보호기, 활성기 및 다른 물질의 약어는 당분야에서 통상적으로 사용되는 약어 또는 IUPAC-IUB(Commision on Biochemical Nomenclature)에 의해 특정화된 약어를 근거로한 것이다. 특정 예를 표 1에 나타내었다. 아미노산에는 광학 이성질체의 존재가능성이 있으며, 다른 언급이 없는한 L-형태이다.
[표 1]
DNA : 데옥시리보핵산
A : 아데닌
T : 티민
G : 구아닌
C : 시토신
RNA : 리보핵산
EDTA : 에틸렌디아민테트라아세트산
Gly : 글리신
Ala : 알라닌
Val : 발린
Leu : 로이신
Ile : 이소로이신
Ser : 세린
Thr : 트레오닌
Met : 메티오닌
Glu : 글루타민산
Asp : 아스파라긴산
Lys : 리신
Arg : 아르기닌
His : 히스티딘
Phe : 페닐알라닌
Tyr : 티로신
Trp : 트립토판
Pro : 프롤린
Asn : 아스파라긴
Gln : 글루타민
Aib : 아미노이소부티르산
Nle : 노르로이신
β-Ala : β-알라닌
hPTH : 인간 PTH
Fmoc : 9-플루오레닐메톡시카르보닐
Nva : 노르발린
Abu :-아미노부티르산
하기 실시예 5(2)에서 수득되는 형질 전환체 에스케리키아 콜리 MM294(DE3)/pTB 960-3은 1991년 10월 16일에 수탁번호 IFO 15241호로 IFO(Institute for Fermentation, 일본국, 오오사까)에 기탁되었으며, 1991년 10월 19일에 부다페스트 조약하에 수탁번호 FERM BP-3615호로 FRI(Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)에 기탁되었다.
하기 실시예 6(1)에서 수득되는 형질 전환체 에스케리키아 콜리 MM294(DE3)/pTB 960-7은 1991년 12월 17일에 수탁번호 IFO 15254호로 IFO에 기탁되었으며, 1991년 12월 24일에 부다페스트 조약하에 수탁번호 FERM BP-3690 호로 FRI에 기탁되었다.
본 발명은 하기 참고예 및 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명된다.
[참고예 1]
rhbFGF 뮤테인 CS23을 제조하는 테트라사이클린 내성 마커를 갖는 재조합체의 제조
hbFGF 내의 네개의 시스테인 잔기중 69- 및 87-시스테인 잔기를 세린잔기로 치환하여 생성된 rhbFGF 뮤테인 CS23을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pTB를 Aval 및 PstI으로 완전히 소화시켜서 대부분의 rhbFGF 뮤테인 CS23을 함유하는 약 0.45 kbp의 단편을 수득한다. 단편을 합성 DNA GATCTGC(ACGTCTAGACG)와 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨 후에 AvaI 및 PstI 로 소화시켜서 PstI 분해부위가 BglII 분해 부위로 교환된 단편 A를 수득한다. 그 다음에 hbFGF의 C-말단 결실로서 생성된 rhbFGF 뮤테인 CS128을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pTB955 [Seno 일행, European Journal of Biochemistry, 188, 239~245(1990)]를 SalI 및 BamHI으로 완전히 소화시켜서 약 4.1 kbp 단편 B를 수득한다. 또한, pTB955를 AvaI 및 SalI로 완전히 소화시켜 액 390 bp 단편 C를 수득한다. 이들 세개의 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결하여 암피실린 내성 마커를 갖는 발현 플라스미드, pHP901을 제조한다(제5도).
pHP901을 EcoRI 및 BglⅡ로 완전히 소화시켜서 rhbFGF 뮤테인 CS23을 코딩하는 유전자, T7 프로모터 및 T7 터미네이터를 함유하는 약 1.1 kbp 단편을 수득한다. T4 DNA 리가제를 사용하여, 이단편은 EcoRI 및 BamHI으로 완전히 소화된 pUC18과 연결되어 플라스미드 pME901을 수득한다(제6도).
pME901을 완전히 EcoRV 및 HindIII로 소화시켜서 rhbFGF 뮤테인 CS23을 코딩하는 유전자, T7 프로모터 및 T7 터미네이터를 함유하는 약 0.77 kbp 단편을 수득한다. T4 DNA 리가제를 사용하여, 이 단편을 ScaI으로 소화된 pBR322과 연결시켜서 테트라사이클린 내성 마커를 갖는 발현 플라스미드인 pCM901을 얻는다(제7도).
[실시예 1]
GIP-CS23 융합 단백질을 생산하는 재조합체의 제조
참고예 1에서 수득한 rhbFGF 뮤테인 CS23 발현 플라스미드인 pCM901을 제한 효소 EcoRI 및 AvaI으로 소화시켜서 CS-23 유전자 영역 및 T7-프로모터를 함유하는 단편을 수득한다. T4 DNA 리가제를 사용하여, 이 단편을 DNA 합성기(ABI 사, 381A)를 사용하여 합성된 제8도에 보여진 바와 같은 5'-말단에서 XbaI 분해 부위와 3' 말단에서 AvaI 분해 부위를 갖는 GIP 유전자 단편과 연결시켜서 GIP-CS23 융합 유전자 단편을 수득한다. T4 DNA 리가제를 사용하여, 이 단편을 제한효소 EcoRI 및 XbaI으로 소화된 pCM901 내로 삽입시켜서 pCM901-1을 수득한다. 이 플라스미드의 XbaI 분해 부위에 pCM-901로부터 제한 효소 XbaI을 사용하여 분해된 T7-프로모터를 삽입시켜서 발현 플라스미드 pGS23(제9도 및 제10도)를 수득하고, 이를 에스케리키아 콜리 MM294(DE 3)균주를 형질전환시키는데 사용하여 제11도 및 제12도에 나타낸 바와 같은 rhGIP-CS23 유전자를 운반하는 재조합체, 에스케리키아 콜리 MM294(DE 3)/pGS23을 수득한다.
[실시예 2]
재조합체의 배양
LB 배지(10g/ℓ박토 트립톤, 5g/ℓ박토 효모 추출물, 5g/ℓ나트륨 클로라이드)에 5mg/ℓ 테트라사이클린을 첨가함으로써 제조된 30ml의 배지에 1루프(loop)의 재조합체 에스케리키아 콜리 MM294(DE3)/pGS23을 접종시킨 후에 37℃에서 하룻밤 동안 진탕시킨다. 이 배양액의 1.5ml를 M-9배지(16.8g/ℓNa2HPO4ㆍ12H2O, 3g/ℓKH2PO4, 1 g/ℓ NH4Cl, 0.5g/ℓ 나트륨 클로라이드, 0.246g/ℓ MgSO4ㆍ7H2O)에 15g/ℓ 글루코오즈, 15g/ℓ 카사미노산, 1mg/ℓ 티아민 히드로클로라이드 및 5 mg/ℓ테트라사이클린을 첨가함으로써 제조된 30ml의 배지에 계대 배양한 후에 37℃에서 진탕 배양시킨다. 혼탁도가 100 내지 120 Klett 단위에 다다르면, IPTG를 첨가한 후에 4 시간 동안 더 배양한다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고 -20℃에서 저장한다.
[실시예 3]
GIP-CS23 융합 단백질의 정제
-20℃에서 저장된 실시예 2에서 수득한 세포(에스케리키아 콜리 MM 294(DE23)/pGS23)을 24mM 포스페이트 완충액(pH 6.0)+0.1mM APMSF(p-아미노페닐메탄술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드)+2mM DTT(디티오트레이톨)로 구성된 추출 완충액에 현탁시킨다. 유리 비드를 사용하여 현탁된 세포를 빙냉 조건하에서 Dynomill(KD-S 모델, Willey Buchofen, 스위스)내에서 파괴시킨다. 생성 추출물을 원심분리(모델 21, Bechman Instrument, 미합중국)시킨다. 생성 상청액을 50mM 인산완충액(pH 6.0)으로 평형화된 Heparin-5PW(7.5mmID×75mm, Tosoh Corporation.)에 흡수시킨 후에 50mM 포스페이트 완충액(pH 6.0)내지 50mM 포스페이트 완충액(pH 6.0)+2M 나트륨 클로라이드의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 주 용출 분획을 0.1 % 트리플루오로아세트산으로 평형화된 ODP-50(4.6mmID×150mm, Asahi Chemical)에 흡수시킨 후에 0.1% 트리플루오로아세트산 내지 0.1% 트리플루오로아세트산+80% 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 주 용출 분획을 원심분리 감압 냉각기(동결 건조기)(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 처리하여 정제 GIP-CS23 융합 단백질의 무수 표준 제제를 수득한다.
[실시예 4]
GIP-CS23 융합 단백질로 부터의 GIP의 분리
GIP-CS23 융합 단백질을 6M 구아니딘 히드로클로라이드+10mM 디티오트레이톨을 함유하는 0.2M 트리스-아세트산 완충액(pH 8.0)에 용해시킨 다음 37℃에서 1 내지 2시간 동안 배양한다. 티올기 총량의 5 내지 10배의 양으로 2-니트로-5-티오시아노벤조산을 첨가한 후에, 혼합물의 pH를 나트륨 히드록사이드로 8.0으로 재조정한다. 그 다음, 반응을 37℃에서 15분간 실행한다. 아세트산을 첨가하여 pH를 4이하로 하고 혼합물을 4℃로 냉각시킨 후에, 투석 또는 겔 여과(50% 아세트산)에 의해 탈염을 실행한다. 원심분리 감압 냉각기(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 동결 건조시킨 후에, 주 용출 분획을 0.01N 아세트산에 용해시키고 5% 암모니아로 pH를 6.4로 조정한다. 용액을 CM-5PW(7.5mmID×75mm, Tosoh Corporation)에 흡수시킨 후에 0.01M 암모늄 아세테이트 내지 0.2M 암모늄 아세테이트의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 원심분리 감압 냉각기(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 동결건조시킨 후에, 주 용출 분획을 0.1% TFA에 용해시킨다. 용액을 Nucleosil 5C18(10mmID ×2.5cm)에 흡수시킨 후에 0.1% TFA 내지 0.1% TFA+80% 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 주 용출 분획을 원심분리 감압 냉각기(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 동결건조시켜서 정제 CIP의 무수 표준 제제를 수득한다.
[실시예 5]
(1) rhbFGF 뮤테인 CS23을 생산하는 테트라사이클린 내성 마커를 갖는 재조합체의 제조
PCT 국제 특허출원 공개 No. WO 91/09126호에 기술된 방법에 따라서 수득된 PTB960을 EcoRV 및 BalII로 분해한다. rhbFGF 뮤테인 CS23 구조 유전자를 함유하는 생성 분획을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 그의 말단을 블런트화 한다. T4 DNA 리가제를 사용하여, 이 단편을 ScaI - 소화 pBR322에 연결시켜서 pTB960-1을 수득한다(제13도).
pTB960-1을 BsmI 및 PvuII로 더 분해한다. T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 분획의 양쪽 말단을 블런트화 시킨후에, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시켜서 테트라사이클린 내성 마커를 갖는 발현 플라스미드, pTB960-2를 수득한다(제14도).
(2) GIP-CS23 융합 단백질을 생산하는 재조합체의 제조
상기 (1)에서 수득된 rhbFGF 뮤테인 CS23 발현 플라스미드, pTB960-2를 XbaI 및 AvaI으로 소화시킨다. T4 DNA 리가제를 사용하여, 이 단편을 그의 3'-말단에는 AvaI 분해 분위 및 5'-말단에서는 XbaI 분해 분위를 갖는 GIP 유전자 단편(DNA 합성기(ABI Company, 381A)를 사용하여 합성된 5'TCT AG(N-말단참조)가 5'TCT AGA AAG GAG ATA TAC ACT로 치환된 제8도의 DNA 서열)과 연결시켜서 플라스미드 pTB960-3(제15도)을 수득한다. 이 발현 플라스미드 pTB960-3을 에스케리키아 콜리 MM294(DE3)균주를 형질전환시키는데 사용하여 융합단백질(제11도 및 제12도에 보여짐)을 코딩하는 rhGIP-hbFGF 뮤테인 CS23 유전자(이후에는 GIP-CS23으로 언급)를 운반하는 재조합체인 에스케리키아 콜리 MM 294(DE3)/pTB960-3(IFO 15241, FERM BP-3615)를 수득한다.
(3) 재조합체의 배양
LB 배지(10g/ℓ 박토 트립토판, 5g/ℓ 박토 효모 추출물, 5g/ℓ 나트륨 클로라이드)에 5mg/ℓ 테트라사이클린을 첨가하여 제조한 30ml의 배지에 1 루프의 상기(2)에서 수득한 재조합체 에스케리키아 콜리 MM 294(DE3)/pTB960-3을 접종시킨 후에 37℃에서 하룻밤 동안 진탕시킨다. 이 배양액의 1.5ml를 M-9 배지(16.8 g/ℓNa2HPO4ㆍ12H2O, 3g/ℓKH2PO4, 1g/ℓNH4Cl, 0.5g/ℓ나트륨 클로라이드, 0.246g/ℓ MgSO4ㆍ7H2O)에 15g/ℓ 글루코오즈, 15g/ℓ 카사미노산, 1mg/ℓ 티아민 히드로클로라이드 및 5mg/ℓ 테트라사이클린을 첨가함으로써 제조한 30ml의 배지에 계대배양시킨 후에 37℃에서 진탕 배양시킨다. 혼탁도가 100 내지 120 Klet 단위에 다다르면, IPTG를 첨가한 후에 4시간 동안 더 배양시킨다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고 -20℃에서 저장한다.
(4) GIP-CS23 융합 단백질의 정제
상기 (3)에서 수득된 -20℃에서 저장된 재조합체 에스케리키아 콜리 MM 294(DE23)/pTB960-3의 세포를 25mM 포스페이트 완충액(pH 6.0)+0.1mM APMSF(p-아미디노페닐메탄술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드)+2mM DTT(디티오트레이톨)+50㎍/ml 라이소자임으로 구성되는 추출 완충액에 현탁시킨다. 빙냉 조건하에서 1시간 동안 방치 시킨 후에, 이 현탁액을 초음파 세포 파괴기(Insonater, 모델 200M, Kubota, Ltd.)내에서 빙냉 조건하에서 10분간 처리한다. 생성 조 추출물을 원심 분리기(모델 J2-21, Beckman Instrument, 미합중국)를 사용하여 원심분리시킨다. 생성 추출물(GIP-CS23 융합 단백질 포함)을 25mM 포스페이트 완충액으로 세척한 후에, 2% SDS 또는 6M 구아니딘 히드로클로라이드 및 100mM DTT를 함유하는 0.2M 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)에 현탁시키고 100℃에서 5분간 열처리하여 용해시킨다. 생성 가용성 단백질을 0.1% 트리플루오로아세트산으로 평형화된 페닐 5PW RP(4.5 mmID×7.5cm, Tosoh Corporation.)의 컬럼에 흡수시킨 후에 0.1% 트리플루오로아세트산 내지 0.1% 트리플루오로아세트산+80% 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 주 용출 분획을 감압하에서 원심 분리 감압 냉각기(동결 건조기)(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 증발시켜서 정제 GIP-CS23 융합 단백질 제제의 무수 표준을 수득한다.
(5) GIP-CS23 융합 단백질로 부터의 GIP의 분리
GIP-CS23 융합 단백질을 6M 구아니딘 히드로클로라이드+10mM 디티오트레이톨을 함유하는 0.2M 트리스-아세트산 완충액(pH 8.0)에 용해시킨 후에 37℃에서 1 내지 2시간 동안 배양시킨다. 티올기 총량의 5 내지 10배의 양으로 2-니트로-5-티오시아노벤조산을 첨가한 후에, 혼합물의 pH를 나트륨 히드록사이드로 8.0으로 조정한다. 그 후에, 반응을 37℃에서 15분동안 실행한다. 아세트산을 첨가하여 pH를 4이하로 하고 혼합물을 4℃로 냉각시킨 후에 탈염을 투석 또는 겔 여과(50 % 아세트산)에 의해 실행한다. 원심분리 감압 냉각기(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 냉각시킨 후에, 주 용출 분획을 6M 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 0.2M 트리스-HCl 완충액(pH 9.0)에 용해시킨 후에 37℃에서 12시간 동안 배양시킨다.
그 다음, 이 용액을 10KD막(Centricon, Amicon Corporation)을 통하여 여과시킨다. 10KD하의 생성 분획을 0.1% TFA+24% 아세토니트릴로 평형회된 페닐 5PW RP(4.5mmID×7.5cm, Tosoh Corporation)의 컬럼에 흡수시킨 후에 0.1% TFA+24% 아세토니트릴 내지 0.1% TFA+80% 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 원심분리 감압 냉각기(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 냉각시킨 후에, 주 용출 분획을 20mM 포스페이트 완충액(pH 6.5)에 용해시킨다. 생성 조 GIP 용액을 20mM 포스페이트 완충액으로 평형화된 CM-5PW(7.5mmID×7.5cm, Tosoh Corporation)의 컬럼에 흡수시킨 후에 20mM 포스페이트 완충액(pH 6.5)내지 20mM 포스페이트 완충액(pH 6.5)+1.0M NaCl의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 생성 주 용출 분획을 0.1% TFA로 평형화된 ODS-120T(7.8mmID×7.5cm, Tosoh Corporation)의 컬럼에 흡수시킨 후에 0.1% TFA 내지 0.1% TFA+80% 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 주 용출 분획을 원심분리 감압 냉각기(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 냉각시켜서 정제 GIP의 무수 표준 제제를 수득한다.
(6) rhGIP의 아미노산 분석
상기 (5)에서 수득한 rhGIP를 모델 477A 단백질 시퀀서(Applid Biosystems)를 사용하여 N-말단 아미노산 서열에 대해 분석한다. N-말단에 Met가 첨가된 hGIP 서열이 검출된다(표 1). 그의 아미노산 서열을 모델 6330 아미노산 분석기(Beckman)을 사용하여 측정한다. 얻어진 값은 이론치와 일치한다(표 2).
[표 1]
모델 477A 단백질 시퀀서(Applied Biosystems)를 사용하여 분석
[표 2]
* 산 가수분해는 6N 염산으로 실행된다(110℃, 24 시간).
* 아미노산 비율은 모델 6330 아미노산 분석기(Beckman)로 측정한다.
1) Edelhoch 방법에 의해 측정
(7) rhGIP의 박막 크로마토그래피
상기 (5)에서 수득된 rhGIP 를 실리카 겔(Kieselgel, Merck ＆ Co., Inc.) 및 셀룰로오즈의 박막 플레이트(Avicel SF, Funakoshi Yakuhin K.K.)를 사용하여 분석한다. 사용된 전개 용매는 n-부탄올 : 피리딘 : 아세트산 : 물 = 4 : 1 : 1 : 2 이다. Rf1값(실리카 겔)은 0.30이며 Rf2값(셀룰로오즈)은 0.43인 것으로 발견되었다.
[실시에 6]
(1) GLP-I(7-37)-CS23 융합 단백질을 생산하는 재조합체의 제조.
상기 실시예 5(1)에서 수득한 rhbFGF 뮤테인 CS23 발현 플라스미드 pTB960-2를 XbaI 및 AvaI으로 소화시킨다. T4 DNA 리가제를 사용하여, 이 단편을 DNA 합성기(ABI Company, 381A)를 사용하여 합성한 제16도에 나타낸 바와 같은 5'-말단에 XbaI 분해 부위 및 3'-말단에 AvaI 분해 부위를 갖는 GLP-I(7-37) (종종 "인슐니로트로핀"으로도 불림) 유전자 단편에 연결시켜서, 플라스미드 pTB960-7(제17도)을 수득한다. 이 발현 플라스미드 pTB-960-7을 사용하여 에스케리키아 콜리 MM294(DE3)균주를 형질전환시켜서 GLP-I(7-37)-hbFGF 뮤테인 CS23 유전자(이후에는 또한 인슐리노트로핀-CS23으로도 언급) 융합 단백질(제18도에 보여짐)을 운반하는 재조합 체인 에스케리키아 콜리 MM294(DE3)/pTB960-7(IFO 15254, FERM BP-3690)을 수득한다.
(2) 재조합체의 배양.
LB 배지(10g/ℓ박토 트립토판, 5g/ℓ박토 효모 추출물, 5g/ℓ나트륨 클로라이드)에 5mg/ℓ 테트라사이클린을 첨가하여 제조한 30ml의 배지에 1루프의 상기 (1)에서 수득한 재조합체 에스케리키아 콜리 MM 294(DE3)/pTB960-7을 접종한 후에 37℃에서 하룻밤 동안 진탕시킨다. 이 배양액의 1.5ml를 M-9 배지(16.8 g/ℓ Na2HPO4ㆍ12H2O, 3g/ℓKH2PO4, 1g/ℓ NH4Cl, 0.5g/ℓ 나트륨 클로라이드, 0.246g/ℓMgSO4ㆍ7H2O)에 15g/ℓ 글루코오즈, 15g/ℓ 카사미노산, 1mg/ℓ 티아민 히드로클로라이드 및 5mg/ℓ 테트라사이클린을 첨가하여 제조한 30ml의 배지에 계대배양시킨 후에 37℃에서 진탕 배양시킨다. 혼탁도가 100 내지 200 Klett 단위에 다다르면, IPTG를 첨가한 후에 4시간 동안 더 배양한다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고 -20℃에서 저장한다.
(3) 인슐리노트로핀 - CS23 융합 단백질의 정제
-20℃에서 저장된 상기 (2)에서 수득한 재조합체 에스케리키아 콜리 MM 294(DE23)/pTB 960-7의 세포를 25mM 포스페이트 완충액(pH 6.0)+0.1mM APMSF(p-아미디노페닐메탄술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드)+2mM DTT(디티오트레이톨)+50㎍/ml 라이소자임으로 구성된 추출 완충액에 현탁시킨다. 빙냉 조건하에서 1시간 동안 방치 시킨 후에, 이 현탁액을 초음파 세포 파괴기(Insonater, 모델 200M, Kubota, Ltd.)내에서 10분간 빙냉 조건하에서 처리한다. 생성 조 추출물을 원심 분리기(모델 J2-21, Beckman Instrument, 미합중국)를 사용하여 원심분리시킨다. 생성 추출물(인슐리노트로핀 -CS23 융합 단백질 포함)을 25mM 포스페이트 완충액으로 세척한 후에 이를 2% SDS 또는 6M 구아니딘 히드로클로라이드 및 100 mM DTT를 함유하는 0.2M 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)에 현탁시킨 후에 100℃에서 5분간 열처리하여 용해시킨다. 생성 가용성 단백질을 0.1% 트리플루오로아세트산으로 평형화시킨 페닐 5PW RP(4.5 mmID×7.5cm, Tosoh Corporation)의 컬럼에 흡수시킨 후에 0.1 % 트리플루오로아세트산 내지 0.1% 트리플루오로아세트산+80% 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 주 용출 분획을 감압 냉각기(동결 건조기)(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 감압하에서 증발시켜서 정제 인슐리노트로핀- CS23 융합 단백질 제제의 무수 표준을 수득한다.
(4) 인슐리노트로핀-CS23 융합 단백질로 부터의 인슐리노트로핀의 분리
인슐리노트로핀-CS23 융합 단백질을 6M 구아니딘 히드로클로라이드+10mM 디티오트레이톨을 함유하는 0.2M 트리스-아세트산 완충액(pH 8.0)에 용해시킨 후에 37℃에서 1 내지 2시간 동안 배양시킨다. 티올기의 총량의 5 내지 10배의 2-니트로- 5-티오시아노벤조산을 첨가한 후에, 혼합물의 pH를 나트륨 히드록사이드로 8.0으로 조정한다. 그후, 반응을 37℃에서 15분간 실행한다. 아세트산을 첨가하여 pH를 4이하로 하고 혼합물을 4℃로 냉각시킨 후에, 투석 또는 겔여과(50 % 아세트산)에 의해 탈염을 실행한다. 원심분리 감압 냉각기(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 동결건조시킨 후에, 주 용출 분획을 6M 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 0.2M 트리스- HCl 완충액(pH 9.0)에 용해시킨 후에 37℃에서 12시간 동안 배양시킨다.
이 용액을 10KD막(Centricon, Amicon Corporation)을 통하여 여과시킨다. 10KD보다 작은 입자를 함유하는 생성 분획을 0.1% TFA+20% 아세토니트릴로 평형화된 페닐 5PW RP(4.5mmID×7.5cm, Tosoh Corporation)의 컬럼에 흡수시킨 후에 0.1% TFA+20% 아세토니트릴 내지 0.1% TFA+80% 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 원심분리 감압 냉각기(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 동결건조시킨후에, 주 용출 분획을 20mM 포스페이트 완충액(pH 6.5)에 용해시킨다. 생성조 인슐리노트로핀 용액을 20mM 포스페이트 완충액으로 평형화된 CM-5PW의 컬럼(7.5mmID×7.5cm, Tosoh Corporation)에 흡수시킨 후에 20mM 포스페이트 완충액(pH 6.5)내지 20mM 포스페이트 완충액(pH 6.5)+1.0M NaCl의 선형 농도 구배로 용출시킨다.
생성 주 용출 분획을 0.1% TFA로 평형화된 ODS-120T의 컬럼(7.8mmID ×30cm, Tosoh Corporation)에 흡수시킨 후에 0.1% TFA 내지 0.1% TFA+80% 아세토니트릴의 선형 농도 구배로 용출시킨다. 주 용출 분획을 원심분리 감압 냉각기(Servant Company, 미합중국)를 사용하여 동결건조시켜서 정제 인슐리노트로핀의 무수 표준 제제를 수득한다.
(5) 인슐리노트로핀의 아미노산 분석
상기 (4)에서 수득한 인슐리노트로핀을 모델 477A 단백질 시퀀서(Applied Biosystems)를 사용하여 N-말단 아미노산 서열에 대해 분석한다. N-말단에 Met가 첨가된 인슐리노트로핀 서열이 검출된다(표 3). 아미노산 조성을 모델 6330 아미노산 분석기(Beckman)를 사용하여 염산과의 가수분해 방법에 의해 측정한다. 수득된 값은 이론치와 일치한다(표 4).
[표 3]
[표 4]
[실시예 7]
(1) 인간 PTH를 코딩하는 유전자의 제조
(a) DNA 단편의 합성
제19도의 14개의 DNA 단편 #1 내지 #14를 적절하게 보호된 DNA β-시아노에틸 포스포아미다이트를 사용하고 자동 합성기(모델 380A, Applied Biosystems)를 사용하여 합성한다. 합성 방법으로서, Applied Biosystems에 의해 특정화된 것을 사용한다. 이렇게 합성된 보호 DNA 올리고머-수지(0.2㎛ole 수지)를 2ml의 농축 수성 암모니아 내에서 60℃에서 6시간 동안 가열한다. 생성물을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(이후에는 역상 HPLC로 언급)로 정제하여 5'-말단 히드록실기만이 디메톡시트리틸기에 의해 보호된 DNA 올리고머를 수득한다. 이들 DNA 올리고머를 2ml의 80% 아세트산으로 20분간 처리하여 말단의 디메톡시트리틸기를 제거하고 생성물을 역상 HPLC 및 이온 교환 HPLC에 의해 정제한다. 이렇게 합성된 14개의 DNA 올리고머를 제19도에 나타낸다.
(b) DNA 올리머의 포스포릴화
#1 및 #14를 제외한 5'-말단으로 부터 형성된 #2 내지 #13의 12개의 DNA 올리고머 각각을 25㎕의 포스포릴화 반응 용액 [10㎕의 DNA 올리고머, 50mM 트리스 -HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 1mM 스페르미딘, 10mM 디티오트레이톨(이후에는 DTT로 언급), 0.1mg/ml 소 태아 혈청(이후에는 BSA로 언급), 1mM ATP, 10 유니트의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Takara Shuzo)] 내에서 37℃에서 1시간 동안 반응시켜서 5'-말단을 포스포릴화시킨다. 이 반응 용액을 65℃에서 10분간 처리한 후에 동결 및 해동시킨다. 생성물을 하기 반응에 적용시킨다.
(c) DNA 단편의 연결(제20도 및 제21도 참조)
(c-1) hPTH 유전자의 이중 스트랜드 구조를 형성시키기 위한 일련의 단계를 제20도에 나타내었다. 제20도를 참조하면,표시는 5'-말단 히드록실기가 포스포릴화 되었음을 나타낸다. 예를 들면, 블럭 I의 연결은 하기와 같이 실행된다. 상기 항목 2에 기술된 조작에 의해 수득된 5개의 DNA 단편(#2 내지 #6의 DNA 단편에 상응함)의 포스포릴화된 반응 용액 7.5㎕부분을 50㎕의 5'-말단에 상응하는 2.5㎍의 DNA 단편 #1 과 합한다. 그후, 5 유니트의 T4 DNA 리가제(New England Bidabs)를 거기에 첨가한 후에 14℃에서 5시간 동안 배양한다. 그 후에, 생성물을 65℃에서 10분간 처리하여 반응을 종결시켜서 블록 I을 수득한다. 블럭 Ⅱ 및 Ⅲ를 유사하게 제조한다. 20부분의 이들 블럭 I 내지 Ⅲ을 혼합하고 5 유니트의 T4 DNA 리가제를 첨가한 후에 14℃에서 20 분간 동안 배양한다. 생성물을 65℃에서 10분간 처리하여 반응을 종결시킨다.
이렇게 수득된 생성물을 완충액(pH 8.3, 100mM 트리스-HCl, 100 mM 보레이트, 2 mM EDTA)내 7.5% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 160V에서 1.5시간 동안 전기영동시킨다. 전기영동 후에, 겔을 0.6mg/ℓ 에티듐 브로마이드(EtBr)로 염색시킨다. 263-bp의 DNA 단편을 함유하는 겔 분획을 투석 시험관 내에 밀봉하고 전기 영동 완충액 내에 침지시킨다. 그후, DNA 단편을 겔로 부터 전기적으로 용출시킨다[J. Mol. Biol. 110. 119(1977)]. 이 투석관내 용액을 회수하고 Elutip-d 컬럼(Schleicher ＆ Schnell)에 0.2M NaCl, 20mM 트리스-HCl(pH 7.4) 및 1.0mM EDTA를 함유하는 용액과 함께 부어서 DNA 단편이 흡수되도록 한다. 용출제2배량의 에탄올을 용출제에 첨가하고 혼합물을 -20℃로 냉각시킨다. 그 다음, DNA 단편을 원심분리에 의해 침전시킨다.
(c-2) hPTH 유전자의 이중 스트랜드 구조를 형성하는 일련의 단계는 제21도에 나타낸 방법으로 실행될 수 있다. 제21도를 참조하면표시는 5'-말단 히드록실기가 포스포릴화 되었음을 나타낸다. 상기 항목 2에서 수득한 12개 종류의 DNA 단편(DNA 단편 #2 내지 #13에 상응)의 포스포릴화 반응 용액의 5㎕ 부분을 50㎕의 5'-말단에 상응하는 2㎍의 DNA 단편 #1 및 #14와 합한다. 그후, 5 유니트의 T4 DNA 리가제(Takara Shuzo)를 거기에 첨가한 후에 15℃에서 20시간 동안 배양한다.
이렇게 수득된 생성물을 완충액(pH 8.3, 100mM 트리스-HCl, 100mM 붕산, 2 mM EDTA)내 8% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 125V에서 2시간 동안 전기영동시킨다. 전기영동시킨 후에, 겔을 0.6mg/ℓEtBr로 염색시킨다. 263-bp의 DNA 단편을 함유하는 겔 분획을 투석 시험관 내에 밀봉하고 전기 영동 완충액 내에 침지시킨다. 그후에, DNA 단편을 겔로부터 전기적으로 용출시킨다. 이 투석관내 용액을 2회 페놀 처리한 후에 수성 층(상층)을 회수한다. 수성층 2배 양의 에탄올을 거기에 첨가하고 혼합물을 -70℃ 로 냉각시킨다. DNA 단편을 원심분리에 의해 침전시킨다. 그리하여, 약 1 ㎍의 DNA 단편을 수득한다. T4 폴리 뉴클레오티드 키나제(Takara Shuzo)로 포스포릴화 시킨 후에, DNA 단편을 하기 실험(d-2)에 적용시킨다.
(d) hPTH 유전자의 클로닝(제22도)
(d-1) 클로닝 벡터로서, 이. 콜리 플라스미드 pBR 322-유도 pUC19[J. Messing, Gene 33, 103 ~ 109(1985)]를 사용한다. pUC19 DNA를 20㎕의 반응 용액[20mM 트리스 - HCl(pH 7.6), 7mM MgCl2, 150mM NaCl, 10mM 2-메르캅토에탄올, 20 유니트의 NdeI(New England Biolabs), 15 유니트의 BamHI(Takara Shuzo)]에 37℃에서 24시간 동안 반응시킨다. 그후, 생성물을 물로 5배 희석시킨 후에 65℃에서 20분간 처리하여 효소를 불활성화시킨다. 5㎕의 이 반응 용액을 상기 항목 c-1에서 수득한 5 당량의 DNA 단편과 혼합시켜서 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1 mM 스페르미딘, 0.1 mg/ml BSA 및 1mM ATP를 함유하는 20㎕의 반응 용액을 제조한다. 그후, T4 DNA 리가제(New England Biolab)를 이 용액과 14℃에서 15시간 동안 반응시켜서 hPTH 유전자를 플라스미드에 연결시킨다.
이 반응 용액을 사용하여, 이. 콜리 JM 109 균주[J. Messing, Gene, 33, 103~ 119(1985)]를 당분야 공지 기술에 따라서 형질전환시킨다. 즉, -70℃에서 저장된 50㎕의 컴피턴드 세포[D. Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557(1983)]를 0℃에서 15시간 동안 배양시킨 후에 10㎕의 상기 반응 용액을 거기에 첨가한다. 반응 용액을 0℃에서 15 시간 동안 더 배양시킨 후에 42℃에서 1.5분간 그리고 0℃에서 2분간 배양시킨다. 이 반응 용액에 200㎕의 LB 배지(10g의 박토-트립톤, 5g의 박토 효모 추출물 및 5 g의 NaCl)를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양시킨다. 이. 콜리를 50㎍/ml 암파실린, 100㎍/ml X-Gal 및 0.1mM 이소프로필-β-D-티오 갈라토피라노 사이드(IPTG)를 함유하는 LB 아가 배지상에 접종하고 37℃에서 하룻밤 동안 배양시킨다. 생성 암피실린-내성 콜로니중 14 β-갈락토시다제-결핍 균주를 선택하고 그의 형질전환된 균주의 플라스미드 DNA를 알칼리법[T. Maniatis 일행., Molecular Cloning, (Cold Spring Harbor Labaratory) 368~369(1982)]에 의해 조야하게 정제한 후에 NcoI 및 BamHI 으로 소화시키고, NdeI 및 BamHI로 더 소화시킨다. 이들 소화물의 1.7% 아가로오즈 겔 상에서의 전기 영동 형태는 한 균주가 hPTH유전자가 정확하게 삽입된 균주로 형질전환되었음을 나타낸다.
(d-2) hPTH 유전자는 또한 하기 방법에 의해서 클로닝 된다. 클로닝 벡터로서, pUC19(Takara Shuzo)를 사용한다. 0.5㎍의 pUC19 DNA를 10㎕의 반응용액[50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 100mM NaCl, 1mM 디티오트레이톨, 20 유니트의 NdeI(New England Biolabs), 10 유니트의 BamHI(Takara Shuzo)]내에서 37℃에서 5시간 동안 반응시킨다. 생성물을 65℃에서 15분간 처리하여 효소를 불활성화시킨다. 1㎕의 반응 용액을 상기 항목 c-2에서 수득된 DNA 단편 약 10 당량과 혼합시키고 hPTH 유전자를 DNA 연결 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 플라스미드에 연결시킨다. 이. 콜리 JM109 균주내로의 형질전환을 상기 항목 d-1과 동일한 방법으로 실행한다. 생성 암피실린-내성 콜로니중에서, 17β-갈락토시다제-결핍 균주를 선택하고 그의 형질전환된 균주의 플라스미드 DNA를 알칼리법에 의해 조야하게 정제시킨 후에 NcoI 및 BamHI으로 소화시키고 NdeI 및 BamHI으로 더 소화시킨다. 이들 소화물의 1.5% 아가로오즈 겔상에서의 전기 영동 형태는 세개의 균주가 hPTH 유전자가 정확하게 삽입된 균주로 형질전환되었음을 보여준다.
상기 항목 d-1 및 d-2에서 수득된 클로닝 벡터를 pUㆍPTHㆍC29로 명명한다. 50㎕/ml 암피실린을 함유하는 20ml의 LB 배지에 1루프의 이 플라스미드 pUㆍPTHㆍC19를 갖는 이. 콜리 JM109 재조합체를 접종하고 37℃에서 하룻밤 동안 진탕시키면서 배양한다. 플라스미드 DNA를 이 배양 용액으로 부터 조야하게 정제하고 20㎕/ml RNase를 함유하는 80㎕의 TE 완충액[10 mM 트리스 - HCl(pH 8.0), 1mM EDTA] 에 용해시킨다.
(e) hPTH의 발현 플라스미드의 조립 및 형질전환체의 제조(제22도)
상기 항목 d에서 수득한 약 10㎍의 pUㆍPTHㆍC19를 반응용액[150mM NaCl, 20mM 트리스-HCl(pH 7.8), 7mM MgCl2, 10mM 메르캅토에탄올, 40 유니트의 NdeI, 20 유니트의 BamHI(Takara Shuzo)]내에서 37℃에서 5시간 동안 반응시킨다. 그후, 263-bp DNA 단편을 공지 방법에 따라서 1.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 의해서 정제시킨다. 한편, 발현 벡터로서, pET3C[F.W. Stadier 일행, Methods in Enzymology 195, 60~89(1990)]을 사용한다. pET3C DNA를 상기한 바와 동일한 방법으로 NdeI 및 BamHI으로 소화시키고 생성 반응 용액의 4배의 물을 거기에 첨가한 후에 65℃에서 20분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨다.
각각의 263-bp DNA 및 플라스미드 DNA는 양쪽 말단의 NdeI 소화 및 BamHI 의 소화에 의해 생성된 단일 스트랜드 부착 말단을 갖는다.
이들을 서로 혼합하고, 혼합물을 T4 DNA 리가제(New England Biolabs)와 50 mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM 스페르미딘, 0.1 mg/ml BSA 및 1mM ATP의 존재하에 14℃에서 16시간 동안 반응시켜서 DNA를 서로 연결시킨 후에, 상기한 바와 동일한 방법으로 이. 콜리 JM 109 균주를 형질전환시킨다. 그후, 이. 콜리를 50㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 아가 배지상으로 접종하고 37℃에서 1일간 배양시킨다. 형질전환된 균주의 플라스미드 DNA를 NdeI-BamHI, BalII-BamHI, EcoRI-NdeI 및 AvrII-BglII와 같은 제한 효소의 조합에 의해 더 소화시킨다. 정확한 hPTH 유전자를 함유하는 형질 전환된 균주를 그의 폴리아크릴아미드 전기 영동의 형태에 따라서 선택한다. 이렇게 수득된 발현 플라스미드를 pE-PTH로 명명한다.
(Ⅱ) [Cys35]인간 PTH(1-84)의 제조 :
(ⅰ) 특정부위 돌연변이 유발을 위한 인간 PTH 유전자를 함유하는 플라스미드, pU- PTH의 조립
인간 PTH DNA를 포함하고 있는 상기(Ⅰ)에서 수득된 프라스미드 pE-PTH를 BamHI 및 XbaI으로 소화시켜서 인간 PTH DNA 및 pET3C 발현 프로모터를 함유하는 0.3 kbp DNA 단편을 수득한다. 단일-스트랜드 사슬을 제조하는데 사용하는 플라스미드 벡터, pUC118을 BamHI 및 XbaI으로 소화시키고 상기 인간 PTH 유전자를 함유하는 DNA 단편과 혼합시키고, 이들을 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다. 연결된 DNA를 에스케리키아 콜리 MV 1184를 형질전환시키는데 사용한다. 생성 형질전환체의 세포를 플레이트에 지시제로서 Xgal과 함께 접종하여 인간 PTH 유전자가 pUC118 로 정확하게 삽입되어 생성된 재조합 플라스미드 pU-PTH를 배양 배지내에 파아지 입자 형태로 퍼지게 된다. 이 단일-스트랜드 DNA를 정제하고 특정 부위 돌연변이유발의 주형으로서 사용한다. 여기에 사용된 에스케리키아 콜리 MV 1184 및 헬퍼 파아지 K07은 Method in Enzymology, 153, 3~11(1987)에 J. Vieira 및 J. Messing에 의해 기술되어 있다.
(ⅱ) [Cys35] 인간 PTH(1-84)를 코딩하는 유전자의 제조 및 발현
(a) [Cys35] 인간 PTH(1-84)를 코딩하는 유전자의 제조(참조 제23도).
먼저, 35-Val 코돈을 Cys 코돈으로 전환시키기 위하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머 A : CGACAATTTTTGCGCCTTAGGTGC를 합성한다. 특정 부위 돌연변이 유발 키트( Amersham Corporation, 생체내 돌연변이유발 시스템의 올리고뉴클레오티드, 변형 2)을 사용하여, 5' 말단이 T4 키나제에 의해 포스포릴화된 상기 합성 올리고머 뉴클레오티드(4 피코몰)과 상기 단일-스트랜드 pU-PTH(5㎍)을 조합하여 돌연변이된 플라스미드를 수득한다. 이 플라스미드를 통상적인 방법에 의해 에스케리키아 콜리 MV 1184 를 형질전환시키는데 사용한다. 생성 형질전환체의 세포를 150㎍/ml 암피실린을 함유하는 2×YT 배지 아가 플레이트에 접종하고 37℃에서 15시간동안 배양하여 많은 수의 콜로니를 수득한다. 10개의 콜로니로부터 소량의 세균세포를 수집한 다음 약 5시간동안 0.3ml의 2×YT 배지에서 배양한다. 이 배양액의 30μl부분 및 헬퍼 파아지 K07을 함유하는 30μl의 용액을 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 방치시킨후에 3ml의 2 ×TY 배지존재하에 하룻밤 동안 배양시킨다. 이 배양액을 원심분리하여 상청액과 세포를 분리한다. 세포로 부터 알칼리법에 의해 플라스미드를 조야하게 정제하고 ; 상청액으로 부터 통상적인 방법에 의해 파아지 입자로서의 단일-트렌드 DNA 를 회수한다.
상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 A는 제한 효소 HhaI 인식부위를 함유하는데, 이것은 인간 pTH를 코딩하는 주형 유전자에는 존재하지 않는다.
결과적으로, 정확하게 돌연변이된 플라스미드 상에서 Hha를 반응시키면, 두 부위, 즉 돌연변이에 의해 새롭게 결과한 HhaI 부위 및 pUC118에 원래 존재하던 HhaI 부위에서의 분해를 유발하여 260bp 단편을 산출한다. 상기 10개의 콜로니로 부터 수득한 플라스미드를 HhaI 로 소화시키고 아가로오즈 겔 전기영동에 의해 분석하면 ; 정확한 크기의 단편이 네개의 클론에서 발견된다.
주형으로서 사용되는 두개의 클론으로 부터의 단일-스트랜드 플라스미드와 DNA 시퀀서 모델 373A(Applied Biosystems Inc. )를 사용하여 DNA 시퀀싱을 실행하고 ; 이것으로 목적하는 돌연변이가 도입되었음이 확인된다( 제25도).
[Cys35] 인간 PTH를 코딩하는 유전자(제25도)를 함유하는 이렇게 수득된 플라스미드를 pU-C35PTH로 부른다.
(b) 에스케리키아 콜리 발현 플라스미드인 pE - C35PTH의 조립(참고 제24도).
상기 (a)에서 수득한 pU - C35PTH를 제한 효소 XbaI 및 BamHI으로 소화시켜 뮤테인 [Cys35] 인간 PTH 를 코딩하는 약 0.3 Kp 단편을 수득한다. 아가로 오스 겔 전기영동에 의해 정제한 후의 이 단편을 제한 효소 XbaI 및 BamHI에 의해 미리 소화된 발현 플라스미드 벡터 pET3c [F. W. Stadier 일행 ; Methods in Enzymology, 195, 60 ~ 89(1990)]에 T4 리가제를 사용하여 연결시킨다. 이렇게 수득된 발현 플라스미드를 pE-C35PTH 로 부른다.
T7 파아지 RNA 폴리머라제 유전자를 포함하는 λ 파아지 DE 3 [F. W. Stadier 일행 ; Journal of Molecular Biology, 189, 113~130(1986)]을 에스케리키아 콜리 MM294 균주에 용원화시켜서 에스케리키아 콜리 MM294(DE3)균주를 수득한다.
플라스미드를 pE-C35PTH 를 에스케리키아 콜리 MM294(DE3)균주를 형질전환 시키는데 사용하여, 제25도에서 보여진 뮤테인-코딩 유전자를 함유하는 플라스미드를 갖는 균주, MM294(DE3)/pE - C35PTH의 세포를 수득한다.
(c)[Cys35] 인간 PTH 의 제조
ⅰ)에스케리키아 콜리 MM294(DE3)/pE - C35PTH 를 60㎍/ml 암피실린을 함유하는 3ml의 LB 배지내에서 37℃에서 하룻밤 동안 진탕배양시킨다. 이 배양액의 100μl 부분을 200ml 플라스크에 분배되어 있는 10ml 의 동일한 배지에 첨가하고 Klett 값이 약 170에 다다를 때까지 37℃에서 배양시킨후에 이소프로필 - β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 최종 농도를 1.0mM로 한다. 2시간 더 배양시킨후에, 1ml의 배양액을 4℃, 15000 rpm에서 5분간 원심분리시킨다. 이렇게 분리된 세포를 0.5M 트리스-HCl(pH 6.8), 10% 글리세롤, 10 %(W/V)나트륨 도데실 술페이트(SDS), 0.1 %(W/V)β-메르캅토에탄올 및 브로모페놀 블루 [ Laemmli, U.K. ; Nature, 227, 680(1970)]를 함유하는 100μl의 수용액에 용해시키고 3분간 비등시킨후에 16 % SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)시킨다. 전기영동후에, 겔을 Comassie Brilliant Blue 로 염색하며 ; 인간 PTH 의 참고용 샘플과 동일한 이동도를 갖는 진한 밴드가 나타난다(참조 제26도). 제26도의 레인은 각각 1 레인은 인간 PTH(1㎍)으로 부터 결과한 레인을, 2레인은 IPTG 를 첨가한 후의 플라스미드 pE-C35PTH를 함유하지 않은 에스케리키아 콜리 균주의 배양액(10㎕)로부터 결과한 레인을, 그리고 3레인은 IPG를 첨가한 후의 플라스미드 pE-C35PTH를 운반하는 에스케리키아 콜리 균주의 배양액(10μl)로 부터 결과한 레인을 나타낸다. 다른 겔은 인간 PTH 항체를 사용하는 웨스턴 법에 적용시키면 ; 인간 PTH 의 참고용 샘플과 동일한 염색 패턴이 수득된다( 제27도 참조 ). 제27도의 레인은 제26도의 레인과 유사하다. 겔 염색 패턴과 표준 샘플과의 양적 비교는 배양액 1ℓ당 약 200mg 의 [Cys35] 인간 PTH 가 발현되었음을 나타낸다.
i i ) 에스케리키아 콜리 내에 축적된 [Cys35] 인간 PTH 는 하기와 같이 정제된다. 상기와 동일한 방법으로 수득된 배양액 200ml로 부터의 세포를 8M 요소, 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 50mM EDTA, 20mM 2-메르캅토에탄올(이후에는 2-ME 로 약칭함) 및 1mM-톨루엔술포닐 플루오라이드를 함유하는 완충액(5ml)에 현탁시키고, 이 현탁액을 빙냉하에서 약 1시간동안 강하게 진탕시켜서 세포를 파괴시킨다. 15000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리시킨 후에, 생성 상청액을 수집하고, 침전물을 동일한 조성의 완충액(각 실행당 3ml)을 사용하여 동일한 추출공정을 2회 실행한다. 상청액을 합하고 2배 희석시킨다. 이 희석액을 4M 요소 및 10mM 2-ME를 함유하는 50mM 암모늄 아세테이트 완충액(pH5)으로 평형화된 TSK-RPF CM-Toyoperal(Tosoh Corporation)(10ml)의 컬럼을 통과시켜 목적물질을 흡수시킨다. 컬럼을 4M 요소 및 10mM 2ME를 함유하는 50mM 암모늄 아세테이트 완충액(PH5)를 세척한다(약 10ml의 완충액이 요구됨). 280nm에서의 흡수가 사라진후에, 컬럼을 10mM 2-ME 를 함유하는 50ml의 50mM 암모늄 아세테이트 완충액(pH 5)및 50ml의 0.5M 암모늄 아세테이트 완충액(pH 6)을 함께 사용하는 선형 구배 방법(유속 10ml /hr, 부피 각각의 추출시 2ml)에 의해 전개시킨다. 분획 No.35 내지 43 합하고 동결건조시킴다음 하기 조건하에서 역상 고성능 액체 크로마토그래피시킨다. 컬럼, YMC-팩 A-325 S-120A ODS(1×30cm)(Y.M.C. 에 의해 제조); 용매, 0.1 % 트리플루오로아세트산을 사용하는 아세토니트릴, 선형 농도 구배 25 % 내지 50 % ; 유속, 3ml/분. 목적 물질의 피이크(체류시간 17.0분)를 분리한다. 이렇게 수득한 용출물을 Bio-Rad AG 1×8(아세테이트 형태)( Bio-Rad Laboratory)의 컬럼을 통과시킨다. 컬럼을 세척한 후에, 세척물을 합하고, 아세토니트릴을 증류시킨후에 동결건조시킨다. 목적 hPTH를 백색 분말 3.6mg으로 수득한다.
이 샘플은 하기 분석에 의해 확인한 결과 고도로 정제된 [Cys35] 인간 PTH 인 것으로 동정되었다.
a) 역상 HPLC 에 날카로운 단일 피이크가 나타난다( 참고, 제28도). 컬럼, YMC - 팩 A-303S-5 ODS 120A, 4.6 직경×260mm ; 용출제, A(0.1 % 트리플루오로아세트산) 및 B(0.1 % 트리플루오로아세트산 함유 아세토니트릴); 구배 프로그램, 0~30 분( 30~38 %, B); 유속, 1ml / 분.
b)인간 PTH 와 동일한 이동도의 단일 밴드가 SDS-PAGE에 나타난다(참고 제29도). 제29도의 레인은 각각 레인 1은 분자 마커로 부터 결과한 레인을, 레인 2는 인간 PTH로 부터 결과한 레인을 그리고 레인 3은 [Cys35] 인간 PTH 로 부터 결과한 레인을 보여준다.
c) 아미노산 분석의 결과는 하기와 같다.(티오글리콜산 존재하, 갑압 밀봉시험관내, 110℃, 24시간, 5.7N 염산 가수분해, 괄호안의 숫자는 이론치를 나타낸다.)
Asp(10), 10.33 ; Thr(1), 0.91 ; Ser(7), 6.10 ; Glu(11), 11.82 ; Pro(3), 3.00 ; Gly(4), 4.44 ; Ala(7), 6.91 ; Cys(1), 1.11 ; Val(7), 6.60 ; Met(2), 2.11 ; Ile(1), 1.01 ; Leu(10), 10.83, Phe(1), 1.10 ; Lys(9), 9.32 ; His(4), 3.75 ; Arg(5), 5.21 ; Trp(1), 0.93(회수율 84.2 % ; Cys에 대한 값은 퍼폼 산과의 산화후에 가수분해물로 부터 수득한 것이다).
d) 기체상-상 시퀀서 모델 470A(Applied Biosystems Inc.)을 사용하는 N-말단 아미노산 시퀀싱은 1 - Ser에서 부터 15-Leu까지의 서열이 정확함을 보여준다.
35-발린이 시스테인으로 교체된 제25도에 보여진 아미노산 서열을 갖는 뮤테인이 수득된다.
(I I I) [Cys35]hPTH(1-84)로 부터의 hPTH(-34)의 제조
[Cys35]hPTH(1-84)의 Cys35의 S-시아닐화를 실시예 5(5)에 기술된 방법에 따라서 하기와 같이 실행한다. 4.76mg 의 [Cys35]hPTH(1-84)를 2.4ml 의 6M Gu-HCl -0.2M 트리스-아세트산(pH 8.4)에 용해시킨다. 이 용액에 동일한 완충액 0.1ml 내의 0.154mg의 디티오트레이톨의 용액을 첨가하고 실온에서 혼합물을 30분간 방치시킨다. 그 후, 동일한 완충액 0.1ml 내의 1.646mg의 2-니트로-5- 티오시아네이토벤조산(NTCB)의 용액을 첨가한 후에 pH를 즉시 8.0으로 조정하고 실온에서 15분간 반응시킨다. 반응을 완결한 후에, 2.5ml의 아세트산을 첨가하고 세파덱스 G-25컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 탈염시킨다. 사용된 겔여과 조건은 하기와 같다 ; 컬럼크기 2.6 ×37cm ; 검출파장, 280nm ; 용출제, 10 % 아세트산 ; 유속, 20ml /hr. [SCN-Cys35]hPTH(1-84)를 함유하는 분획을 수집하고 동결건조시킨후에 이를 분해 반응물로 사용한다.
hPTH(1-34)OH 얻기 이한 분해반응은 하기와 같이 실행한다. 200㎍의 [SCN-Cys35]hPTH(1-84)를 200μl의 6M Cu-HCl-0.1M 보레이트 완충액 내에서 37℃에서 17시간 동안 반응시키고 반응을 동량의 빙초산을 첨가하여 종결 시킨다. 이렇게 수득한 반응액을 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석한다(제30도). 분석조건은 하기와 같다 ; 컬럼, YMC A-303 ODS(4.6×250mm ; 컬럼 온도, 25℃ ; 용매, 0.1 % 트리플루오로아세트산-99.9 % 증류수(용출제 A) 및 0.1 % 트리플루오로아세트산-99.9 % 아세토니트릴(용출제 B); 용출 프로그램, 0분(75 % A + 25 % B), 40분(60 % A+40 % B), 45분(20 % A+80 % B); 용출속도, 0.7ml / 분 ; 검출 파장, 230nm. 도면에서 화살표로 표시된 피이크의 체류시간, 약 35분은 Peptide. Institute, Inc.,(일본국)으로 부터 구입한 참고용 샘플 hPTH(1-34)OH 의 용출시간과 일치한다. 이 피이크 분획을 분리하고 다양한 단백질 화학분석을 실행한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피에서 사용되는 용출 조건하에서, 분해 생성물의 C-말단 단편은 분획을 통하여 흐름내로 용출된다.
hPTH(1-34)OH의 아미노산 조성을 상기 방법에 따라서 분석한다. 수득한 데이타를 표 5에 나타내는데, 이는 hPTH(1-34)OH에 대한 이론치에 잘 일치한다. 또한, 수득된 생성물 hPTH(1-34)OH의 카르복실말단 아미노산 Phe34는 하기와 같이 라세미화되지 않은 것으로 확인된다.
샘플은 아미노산 분석에 사용된 가수분해물이다. 가부분해물 내의 모든 아미노산을 오르토프탈알데히드로 미리 라벨링한다. YMCA-303 ODS 컬럼(4.6×250mm)을 사용하여 역상 고성능 액체크로마토그래피에 의해 분석을 실행한다. 사용된 용출제는 50mM 나트륨 아세테이트-40 % 메탄올이다. 그 결과, 가수분해물 내의 Phe는 L-Phe 로 검출된 반면에, D-Phe 피이크는 검출되지 않는다. 수득된 hPTH(1-34)OH의 분자량 FAB-MS(fast atom bombardment mass spectrometry)에 의해 측정시(m/z):(M+H)+=4116.8 이었으며, 이론치 4118.1과의 차이는 에러 범위내이다.
[표 5]
[실시예 8]
Cys35]hPTh(1-84)로 부터 hPTH(1-3d)-NH2의 제조
[Cys35]hPTH(1-84)의 Cys35의 S-시아닐화를 Wakselman 일행에 의해 Journal of Chemical Society Chemical Communication, 1967, 21~22에 기술되어 있는 방법에 따라서 하기와 같이 실행한다. 8.40mg의 [Cys35]hPTH(1-84)를 3.78ml의 7M 요소-0.1M 암모늄 아세테이트(pH3.5)에 용해시킨다. 이 용액을 25℃에서 15분 동안 방치시킨후에 0.42ml의 동일한 완충액내에 용해된 592㎍의 1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄 플루오로보레이트를 첨가한 후에 실온에서 15분간 반응시킨다. 반응을 완결한 후에, 반응 혼합물을 즉시 Sephadex G-25컬럼을 사용하여 탈염시킨다. 겔 여과의 조건은 하기와 같다 ; 컬럼크기, 2.6×37cm ; 용출제, 10 % 아세트산 ; 유속, 20ml/hr ; 검출파장, 280nm. [SCN-Cys35]hPTH(1-84)을 함유하는 분획을 수집하고 동결건조시킨다. 수득량은 7.5mg이다. 이 생성물을 하기와 같은 분해반응에 사용한다.
200㎍의 [SCN-Cys35]hPTH(1-84)를 200μl의 3M 수성 암모니아에 용해 시킨 후에 37℃에서 10분 동안 반응시킨다. 반응 혼합물을 실시예 7에서 기술된 조건하에서 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 분석한다. 제31도에 보여진 바와같이, [SCN-Cys35]hPTH(1-84)는 완전히 사라진 반면에 32분의 체류시간에서 쇼울더와 함께 단일 피이크가 나타난다. 이 피이크의 주요 피이크 부분은 고체상 펩티드 합성에 의해 제조된 hPTH(1-34)-NH2의 참고용 샘플의 용출위치와 일치한다. 사용된 분석조건하에서, 분해 생성물의 C-말단 단편이 분획을 통하여 흐름내로 용출된다.
[실시예 9]
[Cy35]hPTH(1-84)로 부터의 hPTH(1-34)NHC2H5의 제조
[Cys35]hPTH(1-84)의 시스테인 잔기의 S-시아닐화 및 [SCN-Cys35]hPTH(1-84)의 분리를 실시예 8과 같이 실행한다.
20㎍의 [SCN-Cys35]hPTH(1-84)를 500μl의 3.1M 에틸아민에 용해시킨후에 37℃에서 20분간 반응시킨다. 그후에 동량의 빙초산을 첨가하여 반응을 종결시킨다. 이렇게 수득된 반응 혼합물을 실시예 7과 동일한 조건하에서 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석한다. 제32도에서 볼 수 있듯이, [SCN-Cys35]hPTH(1-84)는 완전히 없어졌으나 두개의 주 피이크가 나타난다. 이들 피이크는 체류시간 31분 및 36분에서 각각 용출되며, 피이크 7 및 피이크 8로 지정되고 분리시킨다음 단백질 화학분석을 한다.
피이크 8 분획의 아미노산 조성을 실시예 7과 같이 측정한다. 얻은 데이타를 표 6 에 나타낸다. 이들 값은 hPTH(1-34)NHC2H5의 이론치와 일치한다. 피이크 8의 카르복실 말단 아미노산 Phe34가 라세미화 되었는지 아닌지를 결정하기 위하여 아미노산 분석에 사용되는 가수분해물을 분석한다. 모든 아미노산을 오르토-프탈알데히드로 미리 라벨링시키고, YMCA-303 ODS 컬럼(4.6 ×250mm)을 사용하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피시킨다. 사용된 용출제는 50mM 나트륨 아세테이트 -40% 메탄올이다. 그 결과, 가수분해물 내의 모든 Phe는 L-Phe로 검출된 반면에, D-Phe의 피이크는 검출되지 않는다. 수득된 hPTH(1-34)NH2C2H5의 분자량을 FAB-MS로 측정했을때(m/z):(M+H)+=4144.9였으며, 이론치 4143.2와의 차이는 에러범위내이다.
피이크 7의 분획을 아미노산 분석한다. 값의 대부분은 [SCN-Cys35]hPTH(1-84)의 이론 조성과 일치한다. 출발물질 [SCN-Cys35]hPTH(1-84)가 약 35분의 체류시간에서 용출된다는 사실로 판단해볼때, 피이크 7은 [SCN-Cys35]hPTH(1-84)의 S-시아노기의 β-제거로 생성된 [디히드로알라닌35]hPTH(1-84)일 것이다. β-제거반응은 분해반응에 대응하여 보고되어 있다. [Y. Degami, A. Patchornik 일행 ; Biochemisty, 13, 1~11(1974)]
분해 생성물의 C-말단 단편이 분획을 통하여 흐름내로 용출된다.
[표 6]
[실시예 10]
(1) H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH2(펩티드 A)의 합성
H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Thr-NH2(펩티드 A)를 Merrifield, R.B. [Advance of Enzymology, 32, 221~296(1969)]의 방법에 따라서 자동 펩티드 합성기 403A(Applied Biosystems)를 사용하여 고체상 방법에 의해 합성한다. 사용된 담체는 p-메틸-BHA 수지이다. 합성은 카르복실 말단으로 부터 순서대로 실행한다. 사용된 Boc-아미노산은 Boc-Pro, Boc-Thr(Br-Z), Boc-Gly, Boc-Cys(4 -CH3BZI), Boc-Glu(OBZl), Boc-Asn, Boc-Leu 및 Boc-Val 이다. 아미노말단 Pro 까지 합성한 후에, 펩티드 수지를 합성기로 부터 취한다.
450mg의 펩티드 수지에 0.45ml의 p-크레졸, 0.45ml의 에탄디티올, 50mg의 2-메르캅토피리딘 및 약 3.5ml의 액체 수소 플루오라이드를 첨가한 후에 0℃에서 1.5 시간 동안 반응시킨다. 반응을 완결시킨후에, 히드로겐 플루오라이드를 감압하에서 증발시키고 대부분의 잔류시약을 0.1% 2-메르캅토 에탄올을 함유하는 디에틸에테르로 세척한다. 펩티드를 10ml 3% 아세트산으로 추출하고 원심분리시킨다. 수지를 제거한 후에 상청액을 Sephadex G-25 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 정제한다. 겔 여과 조건은 하기와 같다 ; 컬럼크기, 2.8×60cm : 검출파장, 280nm ; 용출제, 3 % 아세트산 ; 유속, 30ml/hr. 펩티드를 함유하는 분획을 수집하고 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제한다. 분석조건은 하기와 같다 ; 컬럼, YMC A-303 ODS(4.6×250mm); 컬럼 온도, 25℃ ; 용출제, 0.1% 트리플루오로아세트산-99.9% 증류수(용출제 A)및 0.1% 트리플루오로아세트산-99.9 % 아세토니트릴(용출제 B); 용출 프로그램, 0 분(95 % A+15 % B), 30분(55 % A+45 % B ), 35분(20 % A+80 % B); 유속, 0.7ml / 분 ; 검출파장, 280nm. 약 27분의 체류시간에서 용출된 주 피이크를 수집하고 동결건조시킨다. 아미노산 분석 Asp(1), 1.03 ; Glu(2), 2.15 ; Gly(2), 1.89 ; Val(1), 0.89, Leu(1), 1.00, Tyr(2), 1.96 ; Pro(1), 1.00
(2)H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH2로부터의 H-Pro- Tyr-Gly-OH의 합성
H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH2(펩티드 A)의 Cys4를 Mefhods in Enzymology, 47, 129~132(1977)에 기술된 방법에 따라서 하기와 같이 시아닐화한다. 677㎍(0.546㎛ol)의 펩티드 A를 2.4ml의 6M 구아니딘- 염산(Gu-HCl)-0.2M 트리스- 아세테이트 완충액(pH 8.0)에 용해시킨다. 이 용액에 0.1ml의 동일한 완충액에 용해시킨 디티오트레이톨 154㎍(1μ몰)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분간 방치시킨다. 이 혼합물에 0.1ml의 동일한 완충액내의 1.65mg(7.5㎛ol)의 2-니트로-5-티오시아노벤조산(NTCB)의 용액을 첨가한다. pH를 8.0으로 재조정한 후에, 반응을 실온에서 15분간 실행한 후에 1ml의 빙초산을 첨가하여 반응을 종결시킨다. 이렇게 수득한 반응 혼합물을 탈염시키고 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하여 [S-시아노- Cys4]-펩티드 A([SCN-Cys4] 펩티드 A)를 수득한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피의 조건은 하기와 같다 ; 컬럼, YMC A-303 ODS(4.6×250mm); 컬럼 온도, 25℃ ; 용출제, 0.1 % 트리플루오로아세트산-99.9 % 증류수(용출제 A) 및 0.1 % 트리플루오로 아세트산-99.9 % 아세토니트릴(용출제 B); 용출 프로그램, 0 분(95 % A+5 % A), 37분(55 % A+45 % B)및 35분(20 % A+80 % B); 유속, 0.7ml / 분 ; 검출 파장, 280nm. 이들 조건하에서, [SCN -Cys4] 펩티드 A 가 28분의 체류시간에서 주요 피이크로 용출된다(제33-A도). 이 분획을 분리하고 하기 분해 반응에 사용한다.
H-Pro-Tyr-Gly-OH를 수득하기 위한 분해반응을 6M Gu-HCl-0.1M 보레이트 완충액(pH 9.2)내에서 Methods in Enzymology, 47, 129~132(1977)에 기술된 방법에 따라서 실행한다. 62㎍의 [SCN -Cys4] 펩티드 A를 2ml의 6M Gu-HCl-0.1M 보레이트 완충액(pH 9.2)에 용해시킨 후에 37℃에서 20시간 동안 반응시키고, 반응을 0.2ml의 빙초산을 첨가하여 종결시킨다. 수득된 반응액을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(제33 - B도)에 의해 분석한다. 동일한 역상 고성능 액체 크로마토그래피 조건을 사용하여 [SCN -Cys4] 펩티드 A를 수득한다.
28분의 체류시간에서 용출된 [SCN -Cys4] 펩티드 A는 분해반응후에 완전히 사라진 반면에, 두개의 주 피이크가 나타난다. 17분 및 25분의 체류시간에서 용출된 이들 피이크 각각을 피이크 1 및 피이크 2로 각각 지정하고, 분리하고 분석한다.
110℃, 감압하에서, 24시간동안 밀봉 시험관의 5.7N 염산내에서 가수분해 시킨후에 Hitachi 835 모델 아미노산 분석기를 사용하여 아미노산 조성을 측정한다. 피이크 1의 아미노산 조성은 Pro 0.88(1), Gly 1.00(1) 및 Tyr 0.88로 측정되었으며, 이는 목적 생성물 Pro-Tyr-Gly-OH의 아미노산 조성 이론치와 잘 일치한다. 피이크 2의 아미노산 조성은 Asp 1.00(1), Glu 1.86(2), Gly 0.84(1), Val 1.00(1), Leu 1.03(1)및 Tyr 0.97(1)이었으며, 이는 분해 생성물의 C-말단 단편의 아미노산 조성 이론치와 일치한다. 피이크 1의 분자량은 이차 이온 질량 분석기(SIMS)에 의해(m/z):(M+H)+=336으로 측정되었으며, 이는 H-Pro-Tyr-Gly-OH에 대한 이론치 335.14와 일치한다.
[실시예 11]
H-Pro_Tyr-Gly-Cys-Gly-Glv-Glv-Asn-Lev-Val-Tyr-NH2로 부터의 H-Pro-Tyr-Gly-NH2의 제조
H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH2(펩티드 A)의 Cys의 S-시아닐화 및 [SCN -Cys4] 펩티드 A의 분리를 실시예 10과 같이 실행한다.
H-Pro-Tyr-Gly- NH2를 수득하기 위하여, 가아민 분해를 희석 수성 암모니아 내에서 실행한다. 62㎍의 펩티드 A를 0.5ml의 3M 수성 암모니아 내에서 37℃에서 10 분간 반응시킨다. 동량의 빙초산을 첨가하여 반응을 종결시킨다. 이렇게 수득된 반응혼합물을 실시예 10과 같은 조건하에서 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석한다(제 33-C도). 반응을 완결한 후에, 출발물질 [SCN -Cys4] 펩티드 A의 피이크는 완전히 사라진 반면에, 두개의 주 피이크가 나타난다. 14.8분 및 25분의 체류시간에서 용출된 이들 피이크를 각각 피이크 3 및 피이크 4로 지정하고 분리시킨다. 이들 피이크의 아미노산 조성을 실시예 10의 방법에 따라서 측정한다. 피이크 3의 아미노산 조성은 Gly 1.00(1), Tyr 0.98(1)및 Pro 0.96으로 측정되었으며, 이는 목적 생성물 H-Pro-Tyr- Gly-NH2의 아미노산 조성 이론치와 매우 일치한다. 피이크 4의 아미노산 조성은 Asp 1.00(1), Gly 1.92(2), Gly 0.99(1), Val 0.84(1), Leu 0.95(1) 및 Tyr 0.99(1) 측정되었으며, 이는 분해 생성물의 C-말단 단편의 아미노산 이론치와 일치한다. 피이크 3의 분자량은 SIMS에 의해(m+z):(M+H)+=335로 측정되었으며 이는 H-Pro-Tyr-Gly- NH2의 이론치 334.16과 일치한다.
[실시예 12]
H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH2로 부터의 H- Pro-Tyr-Gly-NHC2H5의 제조
H-Pro-Tyr-Gly-Cys-Gly-Glu-Glu-Asn-Leu-Val-Tyr-NH2(펩티드 A)의 Cys의 S-시아닐화 및 [SCN -Cys4] 펩티드 A의 분리를 실시예 10과 같이 실행한다. H-Pro-Tyr-Gly-NHC2H5를 수득하기 위하여 분해 반응을 하기와 같이 실행한다. 62㎍의 [SCN -Cys4] 펩티드 A를 500μl의 3.1M 에틸아민에서 37℃에서 10분간 반응시킨다. 이렇게 수득된 반응 혼합물을 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석한다(제33-D도).
컬럼의 조건은 실시예 10과 동일하다. 분해반응을 완결한 후에, 출발물질 [SCN -Cys4] 펩티드 A의 피이크는 완전히 사라진 반면에 두개의 주 피이크가 나타난다. 18.6분 및 25분의 체류시간에서 용출된 이들 피이크를 각각 피이크 5 및 피이크 6으로 지정하고, 각각 분리한다.
이들 피이크의 아미노산 조성을 실시예 10의 방법에 따라서 측정한다. 피이크 5 의 아미노산 조성은 Gly 1.00(1), Tyr 0.95(1), Pro 1.02(1) 및 에틸아민 0.95(1)닌히드린 착색속도가 Gly와 동일하다는 가정하에서 계산) 인 것으로 측정되었으며, 이는 목적 생성물 H-Pro-Tyr-Gly-NHC2H5의 아미노산 조성 이론치와 일치한다. 피이크 5 및 6 의 아미노산 조성은 Asp 1.00(1), Glu 1.89(2), Gly 0.99(1), Val 0.84(1), Leu 0.94(1) 및 Tyr 1.00(1) 인 것으로 측정되었으며, 이는 분해 생성물의 C-말단 단편의 아미노산 조성의 이론치와 일치한다. 피이크 5의 분자량은 SIMS에 의해(m/z):(M+H)+=363인 것으로 측정되었으며 이는 H-Pro-Tyr-Gly-NHC2H5의 이론치 362.20과 일치한다.

Claims (10)

  1. N-말단에 시스테인을 갖는 단백질 및 N-말단에 연결된 시스테인이 없는 펩티드로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 운반하는 벡터를 갖는 형질 전환체를 배양하여 상기 융합 단백질을 발현하고, 발현된 단백질을 시스테인 잔기의 아미노기 부분상에서 펩티드 결합을 분해하는 반응을 시키는 것으로 이루어지며, 여기서 펩티드 결합을 분해하는 반응이 S-시아닐화제의 사용에 의한 시아닐화 반응에 이어서 i ) 가수분해에 의해 수행되어 카르복시펩티드를 생성하거나, 혹은 i i ) 가아민분해에 의해 수행되어 각 C-말단에 아미드 또는 치환 아미드 유도체를 생성하는 것을 특징으로 하는 시스테인이 없는 펩티드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 아미노 화합물 또는 치환 아미노 화합물을 펩티드 결합을 분해하는 반응에 사용하여 시스테인이 없는 펩티드의 아미드 또는 치환 아미드 유도체를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 시스테인이 없는 펩티드는 인간 상피소체 호르몬 (1-34) (hPTH(1-34))이고 시스테인이 없는 펩티드가 N-말단에 시스테인을 갖는 펩티드의 N-말단에 연결된 구조를 갖는 단백질은 [Cys35] 인간 PTH(1-84)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 시스테인이 없는 펩티드가 N-말단에 시스테인을 갖는 펩티드의 N-말단에 연결된 구조를 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 조립하고, 상기 유전자를 운반하는 벡터를 갖는 형질 전환체를 배양하여 단백질을 발현시키고, 이렇게 발현된 단백질을 시스테인 잔기의 아미노기 상에서 펩티드 결합을 분해하는 반응을 시키는 것으로 이루어지며, 여기서 펩티드 결합을 분해하는 반응이 S-시아닐화제의 사용에 의한 시아닐화 반응에 있어서 i ) 가수분해에 의해 수행되어 카르복시펩티드를 생성하거나, 혹은 i i) 가아민분해에 의해 수행되어 각 C-말단에 아미드 또는 치환 아미드 유도체를 생성하는 것을 특징으로 하는 시스테인이 없는 펩티드의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 아미노 화합물 또는 치환 아미노 화합물을 펩티드 결합을 분해하는 반응에 사용하여 시스테인이 없는 펩티드의 아미드 또는 치환 아미드 유도체를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 시스테인이 없는 펩티드는 인간 상피소체 호르몬 (1-34) (hPTH(1-34)) 이고 시스테인이 없는 펩티드가 N - 말단에 시스테인을 갖는 펩티드의 N-말단에 연결된 구조를 갖는 단백질은 [Cys35] 인간 PTH (1-84) 인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 시스테인이 없는 펩티드가 N-말단에 시스테인을 갖는 펩티드의 N- 말단에 연결된 구조를 갖는 폴리펩티드를 화학적으로 합성하고 이렇게 수득된 펩티드를 시스테인 잔기의 아미노기 상에서 펩티드 결합을 분해하는 반응을 시키는 것으로 이루어지며, 여기서 펩티드 결합을 분해하는 반응이 S-시아닐화제의 사용에 의한 시아닐화 반응에 이어서 i) 가수분해에 의해 수행되어 카르복시펩티드를 생성하거나, 혹은 i i) 가 아민분해에 의해 수행되어 각 C-말단에 아미드 또는 치환 아미드 유도체를 생성하는 것을 특징으로 하는 시스테인이 없는 펩티드의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 아미노 화합물 또는 치환 아미노 화합물을 펩티드 결합을 분해하는 반응에 사용하여 시스테인이 없는 펩티드의 아미드 또는 치환 아미드 유도체를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. (2회 정정)제1항에 있어서, 시스테인이 없는 펩티드는 하기 구조식의 펩티드인 것을 특징으로 하는 제조방법 :
    R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-R3-R4-R5-His-Leu-Asn-Ser- R6-R7-Arg-R8-Glu-R9-Leu-R10-R11-R12-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-R13
    [상기 식에서, R1은 Ser 또는 Aib를 나타내고 ; R2는 Met 또는 천연 소수성 아미노산을 나타내고 ; R3는 Leu, Ser, Lys 또는 방향족 아미노산을 나타내고 ; R4는 Gly 또는 D--아미노산을 나타내고 ; R5는 Lys 또는 Leu를 나타내고 ; R6은 Met 또는 천연 소수성 아미노산을 나타내고 ; R7은 Glu 또는 염기성 아미노산을 나타내고 ; R8은 Val 또는 염기성 아미노산을 나타내고 ; R9는 Trp 또는 2-(1,3-디티올란-2-일 ) Trp를 나타내고 ; R10은 Arg 또는 His를 나타내고 ; R11은 Lys 또는 His를 나타내고 ; R12는 Lys, Gln 또는 Leu를 나타내고 ; R13은 페닐알라닌 치환 아미드를 나타낸다]
  10. (정정)제9항에 있어서, R1은 Ser이고, R2는 Met이고, R3는 Leu이고, R4는 Gly 이고, R5는 Lys이고, R6은 Met이고, R7은 Glu이고, R8은 Val이고, R9는 Trp이고, R10은 Arg이고, R11은 Lys이고 R12는 Lys인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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KR100407792B1 (ko) * 2000-08-02 2003-12-01 한국생명공학연구원 인간 글루카곤 유사펩타이드를 융합파트너로 이용한재조합 단백질의 제조방법

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