CN112218881B

CN112218881B - cAMP受体蛋白变体及使用其制备L-氨基酸的方法

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Publication number: CN112218881B
Application number: CN201980013827.7A
Authority: CN
Inventors: 李锡明; 丁起龙; 徐昌一; 李知宣
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2023-11-07
Anticipated expiration: 2039-07-25
Also published as: US11697673B2; EP3725800A1; BR112020012963A2; EP3725800A4; US20210363197A1; CA3087627C; CN112218881A; CA3087627A1; RU2760536C1; PH12020550976A1; KR101991207B1; ZA202003830B; JP2021511025A; WO2020111437A1; JP6997327B2; MX2021005180A

Abstract

本申请涉及cAMP受体蛋白变体、包括其的微生物、以及通过使用其制备L‑氨基酸的方法。

Description

cAMP受体蛋白变体及使用其制备L-氨基酸的方法

技术领域

本公开涉及cAMP受体蛋白变体、包含其的微生物、以及使用其生产L-氨基酸的方法。

背景技术

CRP(环AMP受体蛋白)，又称CAP(分解代谢物激活物蛋白)，是大肠杆菌(E.coli.)中最众所周知的转录调节物。CRP的特点在于具有碳源依赖性的调节机制，其以“分解代谢物阻遏”为代表。这种作用是由细胞内环AMP(下文称为“cAMP”)的浓度触发的。当优选碳源(如葡萄糖)存在时，腺苷酸环化酶的活性被抑制以降低cAMP，且这一信号抑制了分解代谢基因的表达。在相反的情况下，腺苷酸环化酶的活性增加，且结果抑制了阻遏物并启动了分解代谢基因的表达。此外，已知CRP发挥多种作用，如通过cAMP的细胞内信号转导、渗透压调节、对细胞紧急情况的应答、生物膜生成、固氮、铁转运等。

据报道，已知有418个大肠杆菌的基因受CRP调节，但对应的调节机制尚未被明确揭示(J Biol Eng.(2009)24；3:13)。对于如此大范围的调节能力，CRP具有通过突变显示出多种表型的潜能。由于CRP的优点，其已被作为适合于对菌株(可适用于各种环境)在细胞水平上进行重新设计的对象进行研究。最近，已经进行了各种实验，如通过改变通过生物信息学选择的CRP的氨基酸变异来改变DNA结合程度而改变待调节基因表达的方法(NucleicAcids Research,(2009)37:2493-2503)，使用通过锌指DNA结合位点和CRP的融合制备的人工转录因子(ATF)来选择耐热、耐渗透、和耐低温的大肠杆菌的方法((Nucleic AcidsResearch,(2008)36:e102)等。换句话说，由于CRP表达的改变促进下游基因表达中的大范围变化，CRP可能是用于制备具有有用性状的微生物的良好工具。

发明内容

[技术问题]

本发明人已经开发了在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸取代的新型蛋白质变体，并且他们发现该蛋白质变体可以增加L-氨基酸生产能力，从而完成了本公开。

[技术方案]

本公开的目的是提供cAMP受体蛋白变体。

本公开的另一目的是提供编码cAMP受体蛋白变体的多核苷酸。

本公开的又一目的是提供包括多核苷酸的载体。

本公开的又一目的是提供包括变体的埃希氏菌属(genus Escherichia)的微生物。

本公开的又一目的是提供生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养埃希氏菌属的微生物。

本发明的又一目的是提供变体或包括变体的埃希氏菌属的微生物在L-氨基酸的生产中的用途。

[有益效果]

当培养产生L-氨基酸的埃希氏菌属的微生物(微生物包括本公开的cAMP受体蛋白变体)时，以高产率产生L-氨基酸是可能的。因此，在工业方面，可以期望生产成本的降低以及生产的便利性。

具体实施方式

下面将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每个描述和实施方式也可应用于其它描述和实施方式。即，在本公开中公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。进一步，本公开的范围不应受下文描述的具体描述的限制。

为了实现上述目的，本公开的一方面提供了在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸取代的cAMP受体蛋白变体。具体地，本公开提供了在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸取代的cAMP受体蛋白变体，其中氨基酸取代包括从N-端的第35位的氨基酸被丙氨酸取代。更具体地，本公开提供了cAMP受体蛋白变体，其包括在SEQID NO:1的氨基酸序列中第35位的氨基酸被丙氨酸取代。

如本文所用，术语“cAMP受体蛋白(CRP)”是大肠杆菌中最众所周知的转录调节物，且因为CRP本身具有激活因子和抑制因子的两种功能，因此CRP也被称为“双重调节因子(dual regulator)”。CRP通常与结构基因上游具有22个碱基的对称DNA序列结合以诱导DNA弯曲，并且CRP通过允许在C-端的第一活性位点和在N-端的第二活性位点与负责转录的RNA聚合酶相互作用而起激活因子作用，并且其通过预占据位置以阻止活性蛋白与活性位点结合或者通过与活性蛋白结合以将结构转化成不与该活性位点结合的结构而起抑制因子作用。cAMP受体蛋白是由crp基因编码的cAMP受体蛋白。

本公开的“cAMP受体蛋白(环AMP受体蛋白，CRP)”可与分解代谢物激活物蛋白(CAP)、CRP蛋白、CAP蛋白等互换使用。

在本公开中，CRP的序列可以从NCBI的已知数据库GenBank获得。例如，CRP可以是来源于埃希氏菌属(Escherichia sp.)的CRP，且更具体地，可以是包括SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列的多肽/蛋白质，但不限于此。进一步，可以不受限制地包括与上述氨基酸序列具有相同活性的序列。进一步，可以包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与之具有80％或更多同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，氨基酸可以包括SEQ ID NO:1的氨基酸和与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多同源性或同一性的氨基酸。进一步，明显的是，只要氨基酸序列具有上述同源性或同一性并且表现出对应于上述蛋白质的功效，具有部分氨基酸序列被缺失、修饰、取代、或添加的氨基酸序列的蛋白质也可以在本公开的范围内。

如本文所用，术语“变体”是指多肽，其一个或多个氨基酸在保守取代和/或修饰中与所列举序列不同，但其保留蛋白质的功能或性质。变体多肽通过几个氨基酸的取代、缺失或添加而与已鉴定的序列不同。通常可以通过修饰上述多肽序列中的一个并评估修饰的多肽的性质来鉴定这些变体。换句话说，与天然蛋白质的能力相比，变体的能力可以被增加、不变、或降低。通常可以通过修饰上述多肽序列之一并评估修饰多肽的反应性来鉴定这些变体。进一步，一些变体可包括其中一个或多个部分(如N-端前导序列或跨膜结构域)已被移除的那些变体。其它变体可包括其中一部分已从成熟蛋白质的N-和/或C-端移除的变体。

如本文所用，术语“保守取代”是指一个氨基酸被具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代。例如，变体可具有一个或多个保守取代，同时保留一种或多种生物活性。这种氨基酸取代通常可基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性性质中的相似性而发生。例如，带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；和疏水氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和色氨酸。

进一步，变体可包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以与在蛋白质N端处的信号(或前导)序列缀合，信号(或前导)序列在翻译同时(co-translationally)或翻译后指导蛋白质的转移。为了多肽的鉴定、纯化或合成，多肽也可以与另一序列或连接子缀合。

如本文所用，术语“cAMP受体蛋白变体”是在具有cAMP受体蛋白活性的多肽的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸取代的cAMP受体蛋白变体，其中氨基酸取代包括N-端的第35位氨基酸被另一种氨基酸的取代。具体地，变体可以包括蛋白质变体，其中具有AMP受体蛋白活性的多肽的氨基酸序列中的第35位氨基酸被另一种氨基酸取代。例如，蛋白质变体可以包括其中变异发生在从SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N-端第35位的蛋白质变体。更具体地，蛋白质变体可以是其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第35位的氨基酸被另一种氨基酸取代的蛋白质。“另一种氨基酸”不受限制，只要它是L-谷氨酸——其是第35位的氨基酸——以外的氨基酸。具体地，变体可以是其中疏水性氨基酸取代SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第35位的氨基酸的蛋白质。疏水氨基酸可以是L-丙氨酸、L-甘氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸中的一种。更具体地，变体可以是其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第35位的氨基酸的蛋白质，但不限于此。

进一步，变体是指在上面描述的SEQ ID NO:1的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多同源性或同一性的氨基酸序列中具有从N-端第35位的氨基酸的变异的变体。

如本文所用，术语“cAMP受体蛋白变体”可与变异CRP蛋白、CRP变体、变异cAMP受体蛋白、变异CAP蛋白、CAP变体、变异分解代谢物激活物蛋白、分解代谢物激活物蛋白变体等互换使用。

关于本公开的目的，与不包括cAMP受体蛋白变体的微生物相比，包括cAMP受体蛋白变体的微生物的特征在于具有高的L-氨基酸生产能力。与天然野生型或非变异cAMP受体蛋白相比，CRP变体的特征在于具有增加L-氨基酸生产能力的基因调节活性。这是有意义的，因为可通过引入有本公开的CRP变体的微生物增加L-氨基酸生产能力。具体地，L-氨基酸可以是L-苏氨酸或L-色氨酸。然而，只要它可以通过引入或包括变异cAMP受体蛋白而产生，任何L-氨基酸都可以不受限制地被包括。

cAMP受体蛋白变体可以是例如包括其中由SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中第35位的氨基酸被另一种氨基酸取代的氨基酸序列的变体，该变体由SEQ ID NO:3组成。其中由SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中第35位的氨基酸被取代为丙氨酸的变体可以由SEQ IDNO:3组成，但不限于此。进一步，CRP变体可以包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有80％或更多同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，本公开的CRP变体可包括具有SEQ ID NO:3的蛋白质和与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多同源性或同一性的蛋白质。进一步，明显的是，只要氨基酸序列具有上述同源性或同一性并且表现出对应于上述蛋白质的功效，具有除了第35位的氨基酸序列之外的部分被缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质可以包括在本公开的范围内。

换句话说，尽管本文描述了“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质”，但明显的是，只要其具有与由相应的SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白质相同或对应的活性，具有部分被缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的蛋白质可以用于本公开。例如，只要蛋白质具有与变异蛋白质相同或对应的活性，不排除在氨基酸序列前后添加不改变蛋白质功能的序列、自然发生的突变、其沉默突变或保守取代。明显的是，即使蛋白质具有这样的序列添加或突变，它也落入本公开的范围内。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以以百分比表示。

术语“同源性”和“同一性”经常可以互换使用。

保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可以与由使用的程序建立的默认空位罚值(default gap penalty)一起使用。实质上，同源或相同的序列可以在中等或高严格的条件下杂交，使得序列的全长或全长的至少约50％、约60％、约70％、约80％、或约90％或更多可以杂交。此外，在杂交中考虑含有代替密码子的简并密码子的多核苷酸。

任意两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性、或同一性，可以使用例如，Pearson等人，(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444的默认参数，使用已知计算机算法(如“FASTA”程序)来确定，或可以使用如在EMBOSS包的Needleman程序(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(版本5.0.0或其后版本)中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。(包括GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research 12:38 7(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994、和[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J AppliedMath48:1073)。例如，可以使用美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性、或同一性。

例如多核苷酸或多肽的同源性、相似性、或同一性可通过使用GAP计算机程序(如Smith and Waterman，Adv.Appl.Math(1981)2:482中公开的，Needleman等人,(1970),JMol Biol.48:443)比较序列信息来确定。简言之，GAP程序将相似性定义为将相似的对比符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两序列中较短者的符号总数获得的数值。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(含有同一性值为1和非同一性值为0)和如Schwartz andDayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National BiomedicalResearch Foundation,pp.353-358(1979)中公开的Gribskov等人,(1986),Nucl.AcidsRes.14:6745的加权比较矩阵(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵)；(2)每个空位的罚值为3.0，且每个空位中每个符号为附加的0.10罚值(或空位开放罚值(gapopen penalty)为10和空位延伸罚值(gap extension penalty)为0.5)；和(3)末端空位无罚值。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”代表序列之间的关联性。

本公开的另一方面提供了编码CRP变体的多核苷酸、或包括该多核苷酸的载体。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指具有预定长度或更长的DNA或RAN链，其是经由共价键连接核苷酸单体而形成的核苷酸的长链聚合物。更具体地，多核苷酸是指编码变异蛋白的多核苷酸片段。

只要多核苷酸序列是编码本公开的cAMP受体蛋白变体的多核苷酸序列，编码本公开的CRP变体的多核苷酸可以不受限制地包括任何多核苷酸序列。只要序列是编码变体蛋白(其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第35位的氨基酸被另一种氨基酸取代)的序列，编码CRP变体的多核苷酸可以不受限制地包括任何序列。具体地，多核苷酸可以是编码其中SEQID NO:1的氨基酸序列中第35位的氨基酸被丙氨酸取代的变体的多核苷酸序列。例如，编码本公开的CRP变体的多核苷酸可以是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸序列，但不限于此。更具体地，多核苷酸可以由SEQ ID NO:4的多核苷酸序列组成，但不限于此。在多核苷酸中，由于密码子简并性或考虑到在其中待表达蛋白质的生物体偏好的密码子，只要它们不改变蛋白质的氨基酸序列，可以在编码区进行各种修饰。因此，明显的是，由于密码子简并性，也可以包括可翻译成由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的多肽或与其具有同源性或同一性的多肽的多核苷酸。

进一步，也可以不受限制地包括可由已知的核苷酸序列生产的探针，例如，在严格条件下与核苷酸序列的全部或部分互补序列杂交以编码其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第35位的氨基酸被另一种氨基酸取代的CRP变体的序列。

术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件被详细地描述于文献(例如J.Sambrook等人，同上)中。例如，严格条件可以包括以下条件，例如，在具有高同源性或同一性(80％或更高、85％或更高、具体地是90％或更高、更具体地是95％或更高、更加具体地97％或更高、特别具体地是99％或更高的同源性或同一性)的基因彼此进行杂交，而在具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因彼此不进行杂交的条件、或在Southern杂交的常规洗涤条件(即，在对应于60℃，1×SSC，0.1％SDS，具体地60℃，0.1×SSC，0.1％SDS，和更具体地68℃，0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度和温度下，进行洗涤一次、具体地洗涤两次或三次)。

尽管由于杂交的严格程度，可能发生碱基之间的错配，但杂交要求两个核苷酸具有互补序列。术语“互补”用于描述可彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，以及胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开不仅可包括实质上相似的核酸序列而且可包括与整个序列互补的分离的核酸片段。

具体地，可以使用杂交条件(包括在55℃的Tm值下的杂交)和上述条件来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。而且，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据目的适当地控制。

多核苷酸杂交的适当严格程度取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且其变量在本领域是公知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。

如本文所用，术语“载体”是指为能够在合适的宿主细胞中表达目标变异蛋白，可操作地被连接至合适的调节序列的DNA构建体(construct)(包括编码目标变体蛋白的多核苷酸的核苷酸序列)。调节序列可以包括能够起始转录的启动子、用于调节这种转录的任何操纵基因序列、编码适合的mRNA核糖体结合结构域的序列、和调节转录和翻译的终止的序列。在转化到合适的宿主细胞中后，载体可以独立于宿主基因组复制或起作用，或可以被整合到其基因组本身中。

只要其能在宿主细胞中复制，本公开中使用的载体没有特别的限制，并且可以使用本领域中已知的任何载体。常用载体的实例可包括自然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等。作为质粒载体，可以使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、和pET型等。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、和pCC1BAC载体等。

例如，可以使用用于细胞内染色体插入的载体，将染色体中编码目标变异蛋白的多核苷酸置换为突变的多核苷酸。多核苷酸的染色体插入可以通过本领域已知的任何方法进行，例如同源重组，但不限于此。可进一步包括用于确认染色体插入的选择标记。选择标记用于选择被载体转化的细胞，即确认期望的多核苷酸的插入，且选择标记可包括提供可选择表型(如耐药性、辅源营养、对细胞毒剂的耐性、或表面修饰蛋白的表达)的标记。由于只有表达选择标记的细胞能够在用选择剂处理的环境下存活或表现不同的表型，所以转化的细胞可以被选择。作为本公开的又一方面，本公开提供了生产L-氨基酸的微生物，微生物包括变异蛋白或编码变异蛋白的多核苷酸。具体地，包括变异蛋白和/或编码变异蛋白的多核苷酸的微生物可以是通过用包括编码变异蛋白的多核苷酸的载体转化而制备的微生物，但不限于此。

如本文所用，术语“转化”意指将包括编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，以这种方式使由多核苷酸编码的蛋白在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，其就可以被整合到宿主细胞的染色体中并置于宿主细胞的染色体中、或其可存在于染色体外、或与此无关地包含以上两者。进一步，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。只要多核苷酸能够被引入到宿主细胞中并在其中表达，其可以以任何形式被引入。例如，可以以表达盒的形式将多核苷酸引入到宿主细胞中，表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。通常，表达盒可包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点、和翻译终止信号。表达盒可以是可自复制表达载体的形式。而且，多核苷酸可以原样被引入宿主细胞中并可操作地被连接到在宿主细胞中表达所需的序列，但不限于此。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指编码本公开期望的变异蛋白的多核苷酸序列与启动和介导多核苷酸序列的转录的启动子序列之间的功能连接。

本公开的又一方面提供了包括cAMP受体蛋白变体的埃希氏菌属(Escherichiasp.)的微生物。

如本文所用，术语“包括CRP变体的微生物”可指表达本公开的CRP变体的重组微生物。例如，微生物是指能够通过包括编码CRP变体的多核苷酸或通过用包括编码CRP变体的多核苷酸的载体转化来表达变体的宿主细胞或微生物。关于本公开的目的，微生物是表达cAMP受体蛋白变体(在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中包括一个或多个氨基酸取代)的微生物，并且微生物可以是表达具有cAMP受体蛋白活性的变异蛋白的微生物，其中氨基酸取代是从N-端第35位的氨基酸被丙氨酸取代，但不限于此。

只要它包括表达L-氨基酸(例如L-苏氨酸或L-色氨酸)的CRP变体，包括CRP变体的微生物可以是任何微生物，但不限于此。例如，包括CRP变体的微生物可以是具有增加的L-氨基酸生产能力的重组微生物，包括CRP变体的微生物通过在天然野生型微生物中或在生产L-氨基酸的微生物中表达CRP变体来制备。具有增加的L-氨基酸生产能力的重组微生物可以是与天然野生型微生物或未修饰微生物相比具有增加的L-氨基酸生产能力的微生物，其中L-氨基酸可以是L-苏氨酸或L-色氨酸，但不限于此。

如本文所用，术语“生产L-氨基酸的微生物”包括野生型微生物或其中发生天然或人工遗传修饰的微生物，并且它可以是由于外源基因的插入或由于内源性基因活性的增强或失活而具有特定的减弱或增强机制的微生物，是其中为生产期望的L-氨基酸发生遗传变异或增强活性的微生物。关于本公开的目的，生产L-氨基酸的微生物可以包括变异蛋白质以具有增加期望的L-氨基酸的的生产能力。具体地，本公开中生产L-氨基酸的微生物或具有L-氨基酸生产能力的微生物可以是其中涉及L-氨基酸生物合成途径的部分基因被增强或减弱，或者涉及L-氨基酸降解途径的部分基因被增强或减弱的微生物。

“非修饰微生物”是指原样的自然菌株、或不包括CRP变体的微生物、或未用包括编码CRP变体的多核苷酸的载体转化的微生物。“微生物”可以包括原核微生物和真核微生物中的任何一种，只要其能够产生L-氨基酸。例如，微生物可以包括埃希氏菌属、欧文氏菌属(genus Erwinia)、沙雷氏菌属(genus Serratia)、普罗威登斯菌属(genus Providencia)、棒杆菌属(genus Corynebacterium)、和短杆菌属(genus Brevibacterium)的微生物。具体地，微生物可以是埃希氏菌属的微生物，且更具体地是大肠杆菌，但不限于此。

本公开的又一方面提供了生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养埃希氏菌属的微生物，微生物通过包括cAMP受体蛋白变体来生产L-氨基酸。

术语“cAMP受体蛋白变体”和“L-氨基酸”与上面描述的相同。

在本方法中，培养微生物可以通过已知的分批培养法、连续培养法、和补料分批培养法等来进行，但不特别限于此。关于这一点，培养条件没有特别限制，但是可以通过使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)来调节最佳pH(例如，pH 5至pH 9，具体地pH 6至pH 8，和最具体地pH 6.8)。另外，可通过向细胞培养物中引入氧气或含氧气体混合物来维持好氧条件。培养温度可维持在20℃至45℃，且具体地在25℃至40℃。培养可进行约10小时至约160小时，但不限于此。通过上述培养生产的L-氨基酸可以被分泌到培养基或可保留在细胞内部。

此外，待使用的培养基可以包括作为碳源的糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、和有机酸(例如，乙酸)，其可以单独使用或组合使用，但不限于此。作为氮源的含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)、或无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、和硝酸铵)可以单独使用或组合使用，但不限于此。作为磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、和与其对应的含钠盐可以被单独使用或组合使用，但不限于此。进一步，培养基可以包括必需的生长刺激物，包括其它金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、和维生素。

方法可进一步包括从微生物或培养基收集L-氨基酸。

收集在本公开的培养中生产的L-氨基酸的方法可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法从液体培养基收集期望的L-氨基酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换层析、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物收集期望的L-氨基酸。

进一步，收集可以包括纯化过程，并且可以使用本领域已知的适当方法进行。因此，待收集的L-氨基酸可以是纯化形式或包括L-氨基酸的微生物的发酵培养液(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering,A.J.Nair.,2008)。

本公开的又一方面提供了cAMP受体蛋白变体在L-氨基酸生产中的用途，cAMP受体蛋白变体包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列中一个或多个氨基酸取代。

本公开的又一方面提供了埃希氏菌属的微生物在L-氨基酸生产中的用途，该埃希氏菌属的微生物包含cAMP受体蛋白变体。

术语“c-AMP受体蛋白变体”和“L-氨基酸”与上面描述的相同。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，对于本领域的技术人员来说明显的是，这些实施例仅用于说明性目的，并且本公开的范围不意图受这些实施例限制。

实施例1.重组载体pCC1BAC-crp的制备

1-1.crp基因片段的制备

为了获得包括crp基因和表达调节区的约0.96kb的SEQ ID NO:5的DNA片段，使用Qiagen(公司)的Genomic-tip系统提取了野生型大肠杆菌W3110的基因组DNA(gDNA)，并使用gDNA作为模板和PCR HL预混试剂盒(由BIONEER Co.制造，下文同样适用)进行了PCR(聚合酶链反应)。使用SEQ ID NO:6和7的引物进行了27个循环(由在95℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，和在72℃下延伸2分钟组成)的PCR用于crp基因片段的扩增。

PCR产物用EcoR I消化，并在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，然后洗脱，以获得0.96Kb的DNA片段(以下称为“crp片段”)。

[表1]

SEQ ID NO.	引物的名称	序列(5’-3’)
			6	crp-F	CACGAATTCTTTGCTACTCCACTGCGTCA
7	crp-R	ACACGAATTCTTAACGAGTGCCGTAAACG

1-2.重组载体pCC1BAC-crp的制备

用EcoR I处理拷贝控制型(Copycontrol)pCC1BAC载体(EPICENTRE，美国)，并在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，然后洗脱以获得产物，然后将其与实施例1-1中获得的crp片段连接，从而制备pCC1BAC-crp质粒。

实施例2.重组载体pCC1BAC-crp变体文库的制备

2-1.通过易错PCR的突变crp片段的制备

使用野生型大肠杆菌W3110的基因组DNA作为模板并使用clonetech的多样化PCR随机诱变试剂盒(diversify PCR random mutagenesis kit)(目录#：K1830-1，表III，诱变反应4)进行了PCR。详细地，使用如实施例1-1中使用的SEQ ID NO:6和7的引物进行了27个循环(其由在94℃下变性30秒和在68℃下延伸1分钟组成)的PCR。

用EcoR I消化了PCR产物，并在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，然后洗脱，以获得0.96Kb的突变crp片段(以下称为“crp^m片段”)。

2-2.重组载体pCC1BAC-crp变体文库的制备

将载体pCC1BAC用限制性内切酶EcoR I处理，以及然后用碱性磷酸酶(NEB)处理。将制备的载体与实施例2-1中获得的crp^m片段连接，并通过电泳将连接产物转化到了TransforMax EPI300电感受态(Electrocompetent)大肠杆菌(EPICENTRE，美国)中。转化菌株在含氯霉素的LB固体培养基(15ug/ml)上培养以选择菌落。收集由此获得的菌落并进行质粒制备(plasmid prep)，从而制备pCC1BAC-crp^m文库。

实施例3.crp变体文库向苏氨酸生产菌株中的引入和生长改善菌株的选择

3-1.pCC1BAC-crp^m文库向苏氨酸生产菌株中的引入

通过电穿孔将实施例2中获得的pCC1BAC-crp^m文库转化到KCCM10541的电感受态(electro-competent)细胞中，KCCM10541是苏氨酸生产微生物。本实施例中使用的大肠杆菌KCCM10541(韩国专利号10-0576342)是通过使L-苏氨酸生产大肠杆菌KFCC10718(韩国专利号10-0058286)中的galR基因失活而制备的大肠杆菌。

作为pCC1BAC-crp^m文库引入的微生物的对照组，以与上述相同的方式将pCC1BAC-crp转化了到KCCM10541中，以制备KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT)。

3-2.重组微生物的生长速率的比较

将含有1％葡萄糖和0.2g/L酵母提取物的M9基本培养基分配在深孔微量培养板中，以及然后将实施例3-1中制备的转化体和对照菌株分别接种到其中。使用微型恒温培养箱摇床(TAITEC，日本)在37℃和200rpm的条件下通过HTS(高通量筛选)方法培养20h，并选择生长改善的菌株。其中，最终选择了1种菌株(表2)。

由于crp的附加引入，引入有野生型crp基因的KCCM10541菌株显示OD值略增加，然而在相同培养时间后，与野生型crp引入的菌株相比，生长改善的转化体显示高OD值。进一步，对选择的crp变体进行质粒微量制备(plasmid mini-prep)，随后进行测序分析。结果总结于表2中。

[表2]

将crp^m文库引入到苏氨酸生产菌株后生长改善的转化体的信息

菌株	OD600	变异
			KCCM10541/pCC1BAC	2.3	-
KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT)	2.8	-
			KCCM10541/pCC1BAC-crpTM4	3.5	E35A

3-3.重组微生物的苏氨酸效价的比较

为了测量实施例3-2中选择的重组微生物的苏氨酸效价，将重组微生物培养在按下表3的组成制备的苏氨酸效价培养基中，以检查L-苏氨酸生产能力的改善。

[表3]

苏氨酸效价培养基的组成

组成	浓度(每升)
		葡萄糖	70g
KH₂PO₄	2g
		(NH₄)₂SO₄	25g
MgSO₄·7H₂O	1g
		FeSO₄·7H₂O	5mg
MnSO₄·4H₂O	5mg
		酵母提取物	2g
碳酸钙	30g
		pH	6.8

详细地，将在33℃培养箱中的LB固体培养基上培养过夜的每一个铂环的大肠杆菌KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT)和大肠杆菌KCCM10541/pCC1BAC-crpTM4分别接种在25mL表3的效价培养基中，以及然后在33℃下和以200rpm在培养箱中培养48小时，以比较糖消耗速率和苏氨酸浓度。

结果，如下表4中描述的，作为对照组的KCCM10541/pCC1BAC-crp(WT)菌株在24小时时显示糖消耗为26.1g/L，然而突变crpTM4引入菌株与母株和野生型crp引入菌株相比，分别显示改善约16％和约11％的糖消耗速率。

进一步，当培养48小时时，野生型crp引入菌株显示29.0g/L的L-苏氨酸产量，然而尽管培养速度增加，上面获得的突变菌株的L-苏氨酸产量增加高达31.0g/L，与母株和野生型crp引入菌株相比，分别显示提高约8％和约7％的浓度。

由于crp变体的引入增加了菌株的产率和糖消耗，因此其看来是良好的变体性状，其可能会大大有助于发酵期间生产效率的提高。

[表4]

包括crp变体的苏氨酸菌株的效价的比较

*24-hr测量值

**48-hr测量值

实施例4.pCC1BAC-crpTM4变体向色氨酸生产菌株中的引入

4-1.pCC1BAC-crpTM4向筛选菌株中的引入

通过电穿孔将实施例3中获得的pCC1BAC-crpTM4转化到色氨酸生产菌株KCCM11166P的电感受态细胞中。本实施例中使用的KCCM11166P是L-色氨酸生产大肠杆菌，其中缺失了tehB基因并且增强了NAD激酶活性(韩国专利号10-1261147)。

作为pCC1BAC-crpTM4引入的微生物的对照组，将pCC1BAC-crp(WT)以与上面相同的方式转化到了KCCM11166P中，以制备KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT)。

4-2.重组微生物生长速率的比较

将含有1％葡萄糖和0.2g/L酵母提取物的M9基本培养基分配在深孔微量培养板中，以及然后将如实施例4-1中制备的转化体和对照菌株分别接种到其中。使用微型恒温培养箱摇床(TAITEC，日本)在37℃和200rpm的条件下通过HTS(高通量筛选)方法培养菌株16小时，以确认KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM4转化体的生长改善(表5)。

由于crp的附加引入，引入有野生型crp基因的KCCM11166P菌株，在相同的培养时间后，显示相等水平的OD，然而与野生型crp相比，生长改善的转化体显示高OD值。

[表5]

crpTM4引入色氨酸生产菌株后生长改善的转化体的信息

菌株	OD600	变异
			KCCM11166P/pCC1BAC	3.4	-
KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT)	3.5	-
			KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM4	4.0	E35A

4-3.重组微生物的色氨酸效价的比较

为了测量实施例4-2中制备的重组微生物的色氨酸效价，将重组微生物培养在按下表6的组成制备的色氨酸效价培养基中，以检查L-色氨酸产率的提高。

[表6]

色氨酸效价培养基的组成

详细地，将在37℃培养箱中的LB固体培养基上培养过夜的每一个铂环的大肠杆菌KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT)和大肠杆菌KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM4分别接种在25mL表6的效价培养基中，以及然后在37℃下以200rpm在培养箱中培养48小时，以比较糖消耗速率和苏氨酸浓度。

结果，如下表7中描述的，作为对照组的KCCM11166P/pCC1BAC-crp(WT)菌株在22小时时显示出30.2g/L的糖消耗，然而突变crpTM4引入菌株与母株和野生型crp引入菌株相比，分别显示改善约146％和约9％的糖消耗速率。

当培养48h时时，野生型crp引入菌株显示8.4g/L的L-色氨酸产量，然而尽管培养速度增加了，上面获得的突变菌株的L-色氨酸产量增加高达9.7g/L，与母株和野生型crp引入菌株相比，分别显示出提高约18％和约15％的浓度。

由于crp变体的引入增加了菌株的糖消耗和产率，因此其看来是良好的变体性状，其可能会大大有助于发酵期间的生产效率的提高。

[表7]

包括crp变体的色氨酸菌株的效价的比较

*22-hr测量值

**48-hr测量值

实施例5.有效crp变体内源性载体向野生型大肠杆菌中的引入

5-1.有效pCC1BAC-crp变体向野生型来源的苏氨酸生产菌株中的引入

为了检查包括实施例3中筛选的crp变体的载体在野生型菌株中是否也显示出相同的效果，分别通过电穿孔将pCC1BAC-crp(WT)或pCC1BAC-crpTM4载体转化到能够生产苏氨酸的野生型来源的菌株中。进一步，制备了pCC1BAC-crp(WT)引入的菌株作为对照组。

本实施例中使用的能够生产苏氨酸的野生型来源菌株是W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC。W3110::PcysK-ppc/pACYC184-thrABC是其中在染色体上编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因的天然启动子被cysK基因的启动子取代，并且以载体的形式引入了苏氨酸生物合成操纵子基因以增加拷贝数，从而增加了苏氨酸产量的菌株。详细地，以与韩国专利号10-0966324中描述的相同的方式使用pUCpcycKmloxP制备了W3110::PcycK-ppc菌株，并且通过电穿孔将pACYC184-thrABC(韩国专利号10-1865998)转化到菌株中。

将制备的菌株在按下表8的组成制备的苏氨酸测试培养基中培养，并比较了其生长速率和L-苏氨酸生产能力。

[表8]

苏氨酸测试培养基的组成

组成	浓度(每升)
		葡萄糖	70g
KH₂PO₄	2g
		(NH₄)₂SO₄	25g
MgSO₄·7H₂O	1g
		FeSO₄·7H₂O	5mg
MnSO₄·7H₂O	5mg
		DL-甲硫氨酸	0.15g
酵母提取物	2g
		碳酸钙	30g
pH	6.8

详细地，将在33℃培养箱中的LB固体培养基上培养过夜的每一个铂环W3110及各自的菌株分别接种在25mL表8的效价培养基中，以及然后在33℃下以200rpm在培养箱中培养48小时。其结果示于下表9中。如以下结果所示，在本公开中选择的变异蛋白也能够在野生型菌株中有效地以高产率生产苏氨酸。

[表9]

野生型来源的菌株的生长和苏氨酸产能力的测试结果

5-2.有效pCC1BAC-crp变体向野生型来源的色氨酸生产菌株中的引入

为了检查包括实施例4中筛选的crp变体的载体在野生型菌株中是否也显示出相同的效果，将pCC1BAC-crp(WT)或pCC1BAC-crpTM4载体分别转化到能够生产色氨酸的野生型来源的菌株中。

本实施例中使用的能够生产色氨酸的野生型来源的菌株是W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA。W3110 trp△2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA是引入有载体以过表达色氨酸的菌株，其中释放了色氨酸操纵子调节区的调节机制并且增强了色氨酸操纵子表达(韩国专利号10-1532129)。将载体引入的菌株培养在按下表10的组成制备的色氨酸测试培养基中，并比较了其L-色氨酸产能力。

[表10]

色氨酸测试培养基的组成

组成	浓度(每升)
		葡萄糖	2g
K₂HPO₄	1g
		(NH₄)₂SO₄	12g
NaCl	1g
		Na₂HPO₄·H₂O	5g
MgSO₄·H₂O	1g
		MnSO₄·H₂O	15mg
CuSO₄·H₂O	3mg
		ZnSO₄·H₂O	30mg
柠檬酸钠	1g
		酵母提取物	1g
苯丙氨酸	0.15g
		pH	6.8

详细地，将在37℃培养箱中的LB固体培养基上培养过夜的每一个铂环的菌株分别接种在25mL的表9的测试培养基中，以及然后在37℃下以200rpm在培养箱中培养48小时。比较了OD值和色氨酸浓度，并显示在表11中。如以下结果所示，本公开中选择的变异蛋白也能够在野生型菌株中有效地以高产率生产色氨酸。

[表11]

野生型来源的菌株的生长和色氨酸生产能力的测试结果

本发明人将基于KCCM11166P的，pCC1BAC-crpTM4引入的具有改善色氨酸生产能力和糖消耗速率的菌株(KCCM11166P/pCC1BAC-crpTM4)指定为“CA04-2809”，然后根据布达佩斯条约于2018年11月7日将该菌株保藏到国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM12375P。

这些结果表明，与未修饰的菌株相比，在本公开的埃希氏菌属的crp变体引入的微生物中，糖消耗速率改善了且L-氨基酸生产能力增加了，且结果，L-氨基酸生产能力增加了。

基于以上描述，本领域技术人员将理解，可以在不改变其技术精神或必要特征的情况下，以不同的具体形式实现本公开。因此，应当理解，上述实施方式不是限制性的，而是在所有方面是说明性的。本发明的范围由所附权利要求限定，而不是由在它们之前的描述限定，且因此落入权利要求的范围和界限内的所有改变和修改，或者这些范围和界限的等同物，因此都意图被涵盖在权利要求中。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> cAMP受体蛋白变体及使用其制备L-氨基酸的方法

<130> OPA19120-PCT

<150> KR 10-2018-0151043

<151> 2018-11-29

<160> 7

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 210

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> CRP

<400> 1

Met Val Leu Gly Lys Pro Gln Thr Asp Pro Thr Leu Glu Trp Phe Leu

1 5 10 15

Ser His Cys His Ile His Lys Tyr Pro Ser Lys Ser Lys Leu Ile His

20 25 30

Gln Gly Glu Lys Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ile Val Lys Gly Ser Val

35 40 45

Ala Val Leu Ile Lys Asp Glu Glu Gly Lys Glu Met Ile Leu Ser Tyr

50 55 60

Leu Asn Gln Gly Asp Phe Ile Gly Glu Leu Gly Leu Phe Glu Glu Gly

65 70 75 80

Gln Glu Arg Ser Ala Trp Val Arg Ala Lys Thr Ala Cys Glu Val Ala

85 90 95

Glu Ile Ser Tyr Lys Lys Phe Arg Gln Leu Ile Gln Val Asn Pro Asp

100 105 110

Ile Leu Met Arg Leu Ser Ala Gln Met Ala Arg Arg Leu Gln Val Thr

115 120 125

Ser Glu Lys Val Gly Asn Leu Ala Phe Leu Asp Val Thr Gly Arg Ile

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Lys Gln Pro Asp Ala Met Thr His

145 150 155 160

Pro Asp Gly Met Gln Ile Lys Ile Thr Arg Gln Glu Ile Gly Gln Ile

165 170 175

Val Gly Cys Ser Arg Glu Thr Val Gly Arg Ile Leu Lys Met Leu Glu

180 185 190

Asp Gln Asn Leu Ile Ser Ala His Gly Lys Thr Ile Val Val Tyr Gly

195 200 205

Thr Arg

210

<210> 2

<211> 633

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> crp

<400> 2

atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 60

attcataagt acccatccaa gagcaagctt attcaccagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 120

tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 180

atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 240

caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 300

aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 360

atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 420

acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 480

ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 540

cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 600

ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 633

<210> 3

<211> 210

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 修饰的CRP

<400> 3

Met Val Leu Gly Lys Pro Gln Thr Asp Pro Thr Leu Glu Trp Phe Leu

1 5 10 15

Ser His Cys His Ile His Lys Tyr Pro Ser Lys Ser Lys Leu Ile His

20 25 30

Gln Gly Ala Lys Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ile Val Lys Gly Ser Val

35 40 45

Ala Val Leu Ile Lys Asp Glu Glu Gly Lys Glu Met Ile Leu Ser Tyr

50 55 60

Leu Asn Gln Gly Asp Phe Ile Gly Glu Leu Gly Leu Phe Glu Glu Gly

65 70 75 80

Gln Glu Arg Ser Ala Trp Val Arg Ala Lys Thr Ala Cys Glu Val Ala

85 90 95

Glu Ile Ser Tyr Lys Lys Phe Arg Gln Leu Ile Gln Val Asn Pro Asp

100 105 110

Ile Leu Met Arg Leu Ser Ala Gln Met Ala Arg Arg Leu Gln Val Thr

115 120 125

Ser Glu Lys Val Gly Asn Leu Ala Phe Leu Asp Val Thr Gly Arg Ile

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Lys Gln Pro Asp Ala Met Thr His

145 150 155 160

Pro Asp Gly Met Gln Ile Lys Ile Thr Arg Gln Glu Ile Gly Gln Ile

165 170 175

Val Gly Cys Ser Arg Glu Thr Val Gly Arg Ile Leu Lys Met Leu Glu

180 185 190

Asp Gln Asn Leu Ile Ser Ala His Gly Lys Thr Ile Val Val Tyr Gly

195 200 205

Thr Arg

210

<210> 4

<211> 633

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 修饰的crp

<400> 4

atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 60

attcataagt acccatccaa gagcaagctt attcaccagg gtgcaaaagc ggaaacgctg 120

tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 180

atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 240

caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 300

aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 360

atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 420

acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 480

ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 540

cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 600

ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 633

<210> 5

<211> 933

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> crp和表达控制区域

<400> 5

tttgctactc cactgcgtca attttcctga cagagtacgc gtactaacca aatcgcgcaa 60

cggaaggcga cctgggtcat gctgaagcga gacaccagga gacacaaagc gaaagctatg 120

ctaaaacagt caggatgcta cagtaataca ttgatgtact gcatgtatgc aaaggacgtc 180

acattaccgt gcagtacagt tgatagcccc ttcccaggta gcgggaagca tatttcggca 240

atccagagac agcggcgtta tctggctctg gagaaagctt ataacagagg ataaccgcgc 300

atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 360

attcataagt acccatccaa gagcaagctt attcaccagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 420

tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 480

atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 540

caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 600

aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 660

atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 720

acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 780

ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 840

cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 900

ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 933

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crp-F

<400> 6

cacgaattct ttgctactcc actgcgtca 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crp-R

<400> 7

acacgaattc ttaacgagtg ccgtaaacg 29

Claims

1.cAMP受体蛋白变体，其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第35位的氨基酸被丙氨酸取代。

2.多核苷酸，其编码权利要求1所述的cAMP受体蛋白变体。

3.载体，其包含编码权利要求1所述的cAMP受体蛋白变体的多核苷酸。

4.埃希氏菌属(genus Escherichia)的微生物，其包括cAMP受体蛋白变体，其中在SEQID NO:1的氨基酸序列中第35位氨基酸被丙氨酸取代。

5.权利要求4所述的埃希氏菌属的微生物，其中所述埃希氏菌属的微生物是大肠杆菌(E.coli)。

6.权利要求4所述的埃希氏菌属的微生物，其中所述埃希氏菌属的微生物生产L-氨基酸。

7.权利要求6所述的埃希氏菌属的微生物，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸或L-色氨酸。

8.生产L-氨基酸的方法，所述方法包括：

在培养基中培养埃希氏菌属的微生物，所述微生物包含cAMP受体蛋白变体，其中在SEQID NO:1的氨基酸序列中第35位的氨基酸被丙氨酸取代。

9.权利要求8所述的方法，其进一步包括从所述微生物或所述培养基收集所述L-氨基酸。

10.权利要求8所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸或L-色氨酸。

11.cAMP受体蛋白变体或包括所述变体的埃希氏菌属的微生物在L-氨基酸生产中的用途，其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第35位氨基酸被丙氨酸取代。