WO2015178586A1 - 세포내 에너지 수준이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 l-아미노산을 생산하는 방법 - Google Patents

세포내 에너지 수준이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 l-아미노산을 생산하는 방법 Download PDF

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WO2015178586A1
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tryptophan
coli
fhub
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장준호
박혜민
이광호
이근철
홍형표
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씨제이제일제당 (주)
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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microorganism having an improved intracellular energy level and a method for producing L-amino acid using the microorganism.
  • a target substance specific approach has been mainly used, such as increasing expression of genes encoding enzymes involved in the generation of the target substance or removing unnecessary genes.
  • a number of useful strains have been developed, including Escherichia coli, which can produce L-amino acids in high yield by enhancing the biosynthetic pathway of the desired L-amino acids. Sufficient energy production and maintenance is required for the production of high yields of useful target materials using microorganisms.
  • ATP is an energy carrier that transfers the chemical energy produced during metabolism to the various activities of organisms.
  • ATP is mainly produced during the metabolism of microorganisms.
  • Substrate level phosphorylation that occurs through glycolysis or oxidative phosphorylation that generates ATP through electron transfer system using reducing power accumulated in NADH or the like during glycolysis is the major intracellular ATP.
  • the resulting ATP is consumed in in vivo activities such as biosynthesis, locomotion, signaling and cell division. Therefore, industrial microorganisms used to produce useful target materials tend to have high demands on ATP. Therefore, studies have been conducted to improve productivity by increasing intracellular energy levels during mass production of useful target products (Biotechnol Adv (2009) 27: 94-101).
  • Iron is one of the essential elements for maintaining homeostasis of microorganisms, and E. coli absorbs iron into cells through various pathways (Mol Microbiol (2006) 62: 120-131).
  • One such iron uptake pathway is the introduction of iron through the FhuCDB complex channel formed by the FhuC, FhuD, and FhuB proteins.
  • TrpR protein and L-tryptophan which regulate the expression of L-tryptophan biosynthesis-related genes, form a complex, which in turn binds to the regulatory site of the fhuCDB operon.
  • the possibility of iron influx through protein complexes has been linked to the biosynthesis of L-tryptophan.
  • the function of FhuCDB protein complex and the effect of iron influx on L-tryptophan biosynthesis are not yet known (Nat Chem Biol (2012) 8: 65-71).
  • the present inventors have conducted studies on how to improve ATP levels and increase the productivity of useful target substances such as L-amino acids, thereby enhancing intracellular ATP levels by inactivating the function of the FhuCDB protein complex by deletion of the fhuCDB gene. It has been found that the present invention can be improved, thereby increasing the productivity of the target material, thereby completing the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing a target substance using microorganisms having improved intracellular ATP levels.
  • the invention provides microorganisms with improved intracellular ATP levels.
  • the microorganism is modified to inactivate the activity of one or more of the protein FhuC, protein FhuD, and protein FhuB constituting the iron absorption system, having an increased intracellular ATP concentration compared to the unmodified strain It may be a microorganism.
  • FhuCDB is a component of the fhu system consisting of the expression products of fhuA, fhuC, fhuD and fhuB, arranged in one operon.
  • fhuA encodes a multifunctional OMP FhuA (79 kDa) that acts as a receptor for ferrichrome-iron, phage, bacterial toxins and antibiotics.
  • FhuA is specific for Fe 3+ -ferric and acts as a ligand-specific gated channel (Protein Sci 7, 1636-1638).
  • the remaining proteins of the fhu system, FhuD, FhuC and FhuB are also essential for the function of this iron absorption system.
  • the periplasmic protein FhuD and the cell membrane-binding proteins FhuC and FhuB form a FhuCDB complex, which passes through the cell membrane from the periplasm and into the cytoplasm into the perichrome and other Fe 3+ -hydroxyxamate compounds (Fe 3+ -aerobactin, Fe 3+ -coprogen) (J Bacteriol 169, 3844-3849).
  • the introduction of iron through the FhuCDB complex consumes one molecule of ATP, and the protein complex TonB-ExbB-ExbD provides energy for this iron uptake process (FEBS Lett 274, 85-88).
  • FhuC encodes a 29 kDa cell membrane-binding protein and, together with FhuD and FhuB, forms a channel for the influx of iron.
  • FhuC may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and in particular, may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • FhuD encodes a 31 kDa cell membrane-binding protein and, together with FhuC and FhuB, forms a channel for the influx of iron.
  • FhuD may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and in particular, may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • FhuB encodes a 41 kDa cell membrane-binding protein and, together with FhuC and FhuB, forms a channel for the influx of iron.
  • FhuB may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and in particular, may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • FuhC, FhuD, and FhuB may have the sequence of SEQ ID NO: 5, 6, and 7, respectively, but is not limited thereto. .
  • FuhC, FhuD, and FhuB may be a variant having an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or more amino acids at one or more positions of the amino acid sequence, wherein SEQ ID NO: At least 70%, at least 80%, or at least 90% or at least 95% homology with 5, 6, and 7;
  • the base sequence encoding the amino acid sequence is within the range that does not change the amino acid sequence of the protein expressed from the coding region in consideration of the codon preferred in the organism to express the protein due to the degeneracy of the codon In the coding region, various modifications may be made.
  • the base sequences described above are provided as one example of the base sequences that can be variously implemented by methods well known to those skilled in the art, but are not limited thereto.
  • the term “homology” refers to the same degree of base or amino acid residues between sequences in an amino acid or nucleotide sequence of a gene encoding a protein, after aligning both sequences in a specific comparison region as closely as possible. Means. If the homology is sufficiently high, the expression products of the gene of interest may have the same or similar activity.
  • the percent sequence identity can be determined using known sequence comparison programs, and examples include BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign TM (DNASTAR Inc), and the like.
  • microorganism refers to a prokaryotic or eukaryotic microorganism with the ability to produce useful target substances such as L-amino acids.
  • microorganisms with increased intracellular ATP concentrations include Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., And Providencia sp. ), Corynebacterium sp., Pseudomonas sp., Leptospira, Salmonella sp., Brevibacteria sp., Hypomononas. sp.), Chromobacterium sp., Norcardia or fungi or yeast.
  • the microorganism may be Escherichia microorganism, and more specifically, the microorganism may be Escherichia coli.
  • an "unmodified strain” is inactivated by microorganisms that are not modified by molecular biological techniques such as mutation or recombination methods, specifically one or more of FhuC, FhuD, and FhuB, which make up the iron uptake system, FhuCDB complex.
  • the microorganism may be one in which the activity of one or more of FhuC, FhuD, and FhuB is inactivated, including those in which FhuC, FhuD, and FhuB are inactivated in combination, specifically, FhuC, Both FhuD and FhuB may be inactivated.
  • activation refers to a mutation by deletion, substitution, or insertion of part or all of a gene encoding a protein of interest, modification of an expression control sequence resulting in decreased expression of the gene, activity of the protein.
  • the deletion of part or all of the gene encoding the protein can be performed by replacing the gene encoding the endogenous target protein in the chromosome with a polynucleotide or marker gene whose partial sequence is deleted through a bacterial chromosomal insertion vector. have.
  • a mutant in which the gene is deleted may be obtained by mutagenesis using a chemical or mutagenesis such as ultraviolet light, but is not limited thereto.
  • expression control sequence is a nucleotide sequence that controls the expression of a gene, means a segment that can increase or decrease the expression of a specific gene in the individual, promoter, transcription regulator binding site , Ribosome binding sites, and sequences that control the termination of transcription and translation, and the like.
  • modifications to expression control sequences that result in reduced expression of the gene are altered on the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitutions, or combinations thereof, of the nucleic acid sequence to further attenuate the activity of the expression control sequence. Or by replacing with an expression control sequence having weaker activity.
  • the microorganism may be a microorganism belonging to the genus Escherichia improved improved ability to produce the target substance compared to the unmodified strain.
  • the Escherichia microorganism of the present invention inactivates the iron influx pathway through the inactivation of one or more of the proteins forming the FhuCDB complex, and reduces the ATP consumption due to iron influx through this pathway, Compared with the increased intracellular ATP level, thereby the production capacity of the target material may be increased.
  • the term “improved productivity” microorganism means a microorganism having an increased productivity of a target substance as compared to an unmodified strain or parent cell before mutation.
  • target material includes any material that increases production by increasing ATP levels in microbial cells, specifically, L-amino acid, more specifically L-threonine or L- It may be tryptophan.
  • the microorganism is L- try to increase the intracellular ATP level compared to the unmodified strain, obtained by inactivation of one or more of FhuC, FhuD, and FhuB from E. coli with L- tryptophan production capacity E. coli with tryptophan production capacity.
  • E. coli having L-tryptophan production ability increases the expression of L-tryptophan operon gene, releases feedback inhibition by L-tryptophan, the final product, or inhibits and attenuates the transcription level of L-tryptophan operon gene ( It may be obtained by releasing attenuation), but is not limited thereto.
  • the microorganism is obtained by inactivation of one or more of FhuC, FhuD, and FhuB from E. coli with L-threonine production capacity, the intracellular ATP level is increased compared to the unmodified strain E. coli with L-threonine production capacity.
  • E. coli having L-threonine production capacity increases the expression of L-threonine operon gene, releases feedback inhibition by L-threonine as a final product, or L-threonine operon gene It may be obtained by releasing the inhibition and attenuation of the transcription level of, but is not limited thereto.
  • a method for producing L-amino acid comprising culturing Escherichia microorganism with improved intracellular ATP levels, and separating the L-amino acid from the culture of the obtained microorganism. do.
  • E. coli microorganism with improved intracellular ATP level is as described above.
  • the culturing of microorganisms having L-amino acid producing ability may be made according to suitable medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the microorganism selected. Examples of the culturing methods include, but are not limited to, batch, continuous and fed-batch cultivation.
  • the medium used for cultivation must adequately meet the requirements of the particular microorganism.
  • Various microbial culture media are described, for example, in "Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981. These media include various carbon sources, nitrogen sources and trace element components.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose, lactose, sucrose, fructose, maltose, starch and fiber; Fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil and coconut oil; Fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid; Alcohols such as glycerol and ethanol and organic acids such as acetic acid, and these carbon sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • Nitrogen sources include organic nitrogen sources and urea, such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor (CSL), and bean flour, Inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate, and these nitrogen sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • the medium may further include, but is not limited to, potassium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and corresponding sodium-containing salts as phosphoric acid sources. .
  • the medium may also include metals such as magnesium sulfate or iron sulfate, and amino acids, vitamins and suitable precursors may be added.
  • oxygen or a gas containing oxygen may be injected into the culture solution.
  • the temperature of the culture may generally be 20-45 ° C., specifically 25-40 ° C.
  • the period of incubation may continue until the production of L-amino acids, such as L-threonine or L-tryptophan, reaches a desired level, specifically, the incubation time may be 10-100 hours.
  • the method for producing L-amino acid according to one embodiment of the present invention further comprises the step of separating the L-amino acid from the culture medium of the obtained microorganism. Isolation of L-amino acids is carried out to purify or recover the desired L-amino acids from the culture medium using a suitable method known in the art according to the method of culturing the microorganism of the present invention, for example, batch, continuous or fed-batch culture method. It may be made by, but is not limited to such.
  • Escherichia microorganisms having an increased intracellular ATP concentration and a method for producing a target substance using the same, compared to the unmodified strain according to the present invention high intracellular ATP concentration promotes gene expression, biosynthesis, substance transport, and the like. Therefore, useful target substances including protein, L-amino acid, etc. can be efficiently produced.
  • 1 shows intracellular ATP levels of Escherichia coli according to one embodiment of the present invention compared to an unmodified strain.
  • Figure 2 shows the intracellular ATP level of E. coli with L-tryptophan production ability from wild strains according to an embodiment of the present invention compared to the unmodified strain.
  • Figure 3 shows the intracellular ATP level of E. coli with L-threonine production capacity according to one embodiment of the present invention compared to the unmodified strain.
  • Figure 4 shows the intracellular ATP level of E. coli with L-tryptophan production capacity according to one embodiment of the present invention compared to the unmodified strain.
  • FIG. 5 shows L-threonine production capacity of E. coli having L-threonine production capacity according to one embodiment of the present invention compared to an unmodified strain.
  • Figure 6 shows the L-tryptophan production capacity of E. coli with L-tryptophan production capacity according to an embodiment of the present invention compared to the unmodified strain.
  • the deletion genes fhuC , fhuD , and fhuB genes have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively, and exist in the operon form of SEQ ID NO: 4.
  • fhuC , fhuD , and fhuB For the deletion of fhuC , fhuD , and fhuB , a one-step inactivation method using lambda red recombinase developed by Datsenko KA et al. was used (Proc Natl Acad Sci USA. , (2000) 97: 6640-6645).
  • the rmf promoter was ligated to pUC19 (New England Biolabs (USA)) and the mutant loxP-Cm R -loxP cassette obtained from pACYC184 (New England Biolab) was ligated.
  • the obtained chloramphenicol gene of pUCprmfmloxC was used (Korean Patent Application Publication No. 2009-0075549).
  • 'PCR' primary polymerase chain reaction
  • PCR products ⁇ fhuC1st, ⁇ fhuD1st, ⁇ fhuB1st, and ⁇ fhuCDB1st obtained through PCR were eluted after electrophoresis on 0.8% agarose gel to be used as a template for the secondary PCR.
  • Secondary PCR uses primer combinations of SEQ ID NOs: 14 and 15, 16 and 17, 18 and 19, 14 and 19, which contain 20 bp sequences in the 5 'and 3' regions of the PCR product obtained in the primary PCR.
  • PCR products ⁇ fhuC, ⁇ fhuD, ⁇ fhuB, and ⁇ fhuCDB were obtained.
  • the obtained PCR product was eluted after electrophoresis on 0.8% agarose gel and used for recombination.
  • E. coli W3110 transformed with the pKD46 vector was prepared according to a one-step inactivation method developed by Datsenko KA et al. (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645). Thereafter, 1.3 kb fragments obtained through primary and secondary PCR were introduced and transformed. Transformants with chloramphenicol were selected by culturing in LB medium containing chloramphenicol.
  • a genome obtained from a selected strain as a template, SEQ ID NO: 20 and 21 primers a is about 4.4, each size amplified by PCR using the kb, 4.3 kb, 3.3 kb, 1.6 kb is confirmed by fhuC, fhuD, fhuB gene that Was confirmed to be alone or all deleted.
  • the pJW168 vector (Gene, (2000) 247,255-264) was introduced to remove the chloramphenicol marker gene from the cells (Gene, (2000) 247,255-264).
  • the PCR products of about 3.4 kb, 3.3 kb, 2.2 kb, and 0.6 kb obtained by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 20 and 21 showed that the fhuC , fhuD , and fhuB genes alone or all were deleted. It confirmed and named E. coli W3110_ ⁇ fhuC, W3110_ ⁇ fhuD, W3110_ ⁇ fhuB and W3110_ ⁇ fhuCDB.
  • Example 1 the actual intracellular ATP level was measured using the strain prepared in Example 1.
  • the intracellular ATP levels of E. coli W3110_ ⁇ fhuC, W3110_ ⁇ fhuD, W3110_ ⁇ fhuB, and W3110_ ⁇ fhuCDB which were alone or all of the wild type E. coli-derived fhuC , fhuD , and fhuB genes prepared in Example 1, were compared to E. coli W3110. It was confirmed that the increase.
  • Example 3 fhuC , fhuD , fhuB Preparation of L-Tryptophan Producing Strains from Wild Lines Inactivated by Protein Encoding and Measurement of Intracellular ATP Levels
  • Example 4 fhuC , fhuD , fhuB Activity of L-Tryptophan Producing Strains Derived from Wild Lines Inactivated by Protein Encoding
  • the strains of wild-derived L-tryptophan-producing strains W3110 trp ⁇ 2 / pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, fhuC , fhuD and fhuB genes alone or all were deleted to increase ATP in cells.
  • Activity evaluation was performed using as a carbon source.
  • the strains were inoculated one Platinum in LB solid medium, incubated overnight in a 37 ° C. incubator and one Platinum in 25 mL titer medium containing glucose having the composition of Table 1. Then, it was incubated for 48 hours in an incubator at 37 ° C and 200 rpm. The results are shown in Table 2. All results represent the mean of three replicates.
  • the fhuC, fhuD, fhuB gene of E. coli KCCM10812P (Republic of Korea Registered Patent No. 0792095) and the L- threonine production strain KCCM10541P (Republic of Korea Registered Patent No. 0576342), L- tryptophan-producing strain with the first embodiment
  • Each was deleted by homologous recombination as described.
  • Escherichia coli KCCM10812P an unmodified strain with L-tryptophan production capacity
  • E. coli mutant strain KFCC 10066
  • L-phenylalanine production capacity releasing the requirement for tryptophan on the chromosome and pheA , trpR , mtr and tnaAB genes.
  • E. coli KCCM10541P an unmodified strain having L-threonine production capacity
  • E. coli KFCC10718 Korean Patent Application Laid-Open No. 1992-0008365
  • E. coli which has resistance to L-threonine analogs, isoleucine rikytype requirements, resistance to L-lysine analogs, and ⁇ -aminobutyric acid resistance, and L-threonine production capacity.
  • the deletion genes fhuC , fhuD and fhuB genes were deleted from E. coli KCCM10812P and E. coli KCCM10541P in the same manner as in Example 1, thereby producing L-threonine producing strains KCCM10541_ ⁇ fhuCDB and L-tryptophan producing strain KCCM10812P_ ⁇ fhuCDB.
  • Example 6 fhuC , fhuD , fhuB Determination of ATP Levels of L-Threonine Producing Strains and L-Tryptophan Producing Strains Inactivated by Protein Encoding
  • Example 5 the actual intracellular ATP level was measured using the strains prepared in Example 5.
  • Intracellular ATP levels were measured in the same manner as in Example 2. The results are shown in FIGS. 3 and 4. The results in FIGS. 3 and 4 show the average of the results of three replicates.
  • L-threonine producing strains E. coli KCCM10541P_ ⁇ ysa ⁇ ydaS
  • Tryptophan production strain E. coli KCCM10812P_ ⁇ ysa ⁇ ydaS
  • Example 7 fhuC , fhuD , fhuB Activity of L-Threonine Producing Strains with Inactivated Protein Encoding Function
  • glucose was used as a carbon source for strains that increased the ATP in cells by deleting the fhuC , fhuD , and fhuB genes of E. coli KCCM10541P (Korean Patent No. 076342), an L-threonine producing microorganism. Titer evaluation was performed. L-threonine producing strains (E. coli KCCM10541P_ ⁇ ysa ⁇ ydaS) , which deleted the ysa and ydaS genes, were included as controls to compare the results of titer evaluation.
  • the strains were incubated overnight in an LB solid medium in a 33 ° C. incubator, inoculated with one platinum into 25 mL of a titer medium containing glucose having the composition shown in Table 1, followed by 50 hours in a 33 ° C., 200 rpm incubator. Incubated.
  • the results are shown in Table 4 and FIG. All results represent the mean of three replicates.
  • the recombinant L-threonine-producing E. coli strain produced according to the present invention exhibited similar physiological activity as that of the unmodified strain, and the production of L-threonine increased by about 9% compared to the unmodified strain. I could confirm that. This result can be seen that reflecting the intracellular ATP level confirmed in Figure 2, reflecting that the L- threonine production capacity of the strain was increased by increasing the intracellular ATP level.
  • Example 8 fhuC , fhuD , fhuB Activity Identification of L-Tryptophan Producing Strains with Inactivated Protein-Encoded Function
  • L-tryptophan-producing bacteria KCCM10812P (Korean Patent No. 0792095) deleted the fhuC , fhuD and fhuB genes to increase the ATP in the cells using glucose as a carbon source for the strains Evaluation was performed.
  • the titer evaluation was performed in the same manner as in Example 4, including the L-tryptophan producing strain (E. coli KCCM10812P_ ⁇ ysa ⁇ ydaS) deleted with the ysa and ydaS genes as a control.
  • the recombinant L-tryptophan-producing E. coli strains produced according to the present invention showed similar physiological activity as the unmodified strain, and the production of L-tryptophan was increased by about 30% compared to the unmodified strain. .
  • This result can be seen to reflect the increase in L- tryptophan production capacity of the strain through the increase in intracellular ATP level confirmed in FIG.
  • the strain CA04-2801 (KCCM10812P_ ⁇ fhuCDB) recombined in the present invention was deposited on November 15, 2013 with the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM) and was assigned an accession number to KCCM11474P.

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Abstract

본 발명은 세포내 에너지 수준이 향상된 재조합 미생물 및 이 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

세포내 에너지 수준이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법
본 발명은 세포내 에너지 수준이 향상된 재조합 미생물 및 이 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
미생물을 이용한 목적 물질의 생산을 위해 주로 목적 물질의 생성에 관여된 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근방법이 주로 이용되었다. 예를 들면, 목적 L-아미노산의 생합성 경로의 강화에 의해 L-아미노산을 고수율로 생산할 수 있는 대장균을 포함한 다수의 유용한 균주들이 개발되었다. 미생물을 이용한 유용한 목적 물질의 고수율 생산을 위해서는 충분한 에너지의 생성 및 유지가 필요하다.
생체 내에서 단백질, 핵산 등과 같은 물질을 생합성하기 위해서는 NADH, NADPH 및 ATP(Adenosine-5'-triphosphate)의 형태로 에너지가 보존되어 이용된다. 특히, ATP는 대사과정에서 생성된 화학적 에너지를 생물체의 다양한 활동에 전달하는 에너지 운반자이다.
ATP는 주로 미생물의 대사과정에서 생성된다. 해당 과정(glycolysis)을 통해 일어나는 기질수준 인산화 반응(substrate level phosphorylation)이나 해당과정 중에 NADH 등에 축적된 환원력을 이용하여 전자전달계를 통해 ATP를 생성하는 산화적 인산화반응(oxidative phosphorylation)이 세포내 주요 ATP 생성 경로이다. 생성된 ATP는 생합성, 운동, 신호전달 및 세포 분열과 같은 생체 내의 활동에서 소비된다. 따라서, 유용한 목적 물질을 생산하기 위해 이용되는 산업용 미생물은 ATP 에 대한 요구도가 높은 편이다. 이에, 유용한 목적 산물의 대량생산 시 세포내 에너지 수준을 증가시킴으로써 생산성을 향상시키려는 연구가 진행되기도 하였다(Biotechnol Adv (2009) 27:94-101).
철은 미생물의 항상성 유지에 반드시 필요한 원소 중의 하나이고, 대장균의 경우 다양한 경로를 통해서 세포 내로 철을 흡수한다(Mol Microbiol (2006) 62:120-131). 이러한 철 흡수 경로 중 하나는 FhuC, FhuD, 및 FhuB 단백질이 형성하는 FhuCDB 복합체 채널을 통해 철분을 유입하는 것이다. 최근에는 세포 내에 L-트립토판이 과량 존재할 때 L-트립토판 생합성 관련 유전자들의 발현을 조절하는 TrpR 단백질과 L-트립토판이 복합체를 형성하고, 다시 이 복합체가 fhuCDB 오페론의 조절 부위에 결합한다는 사실이 밝혀져 FhuCDB 단백질 복합체를 통한 철분의 유입이 L-트립토판의 생합성과 관련이 있다는 가능성이 제기되고 있다. 그러나 아직까지 L-트립토판의 생합성에서 FhuCDB 단백질 복합체의 기능 및 이를 통한 철분의 유입이 미치는 영향이 정확히 알려져 있지는 않다(Nat Chem Biol (2012) 8:65-71).
본 발명자들은 ATP 수준을 향상시키고 L-아미노산과 같은 유용한 목적 물질의 생산성을 증가시키는 방법에 대한 연구를 수행하여, fhuCDB 유전자의 결실에 의해 FhuCDB 단백질 복합체의 기능을 불활성화시키는 것에 의해 세포내 ATP 수준을 향상시키고, 이에 의해 목적 물질의 생산성을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포내 ATP 수준이 향상된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포내 ATP 수준이 향상된 미생물을 이용하여 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 세포내 ATP 수준이 향상된 미생물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 철 흡수 시스템을 구성하는 단백질 FhuC, 단백질 FhuD, 및 단백질 FhuB 중 하나 이상의 활성이 불활성화되도록 변형되어, 비변형 균주에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 미생물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "FhuCDB"는 하나의 오페론 내에 배열된, fhuA, fhuC, fhuD 및 fhuB의 발현 산물로 이루어진 철 흡수 시스템(fhu system)의 구성요소이다. fhuA는 페리크롬-철(ferrichrome-iron), 파아지(phage), 박테리아 독소 및 항생제 등의 수용체로 작용하는 다기능성 OMP FhuA (79 kDa)를 코딩한다. FhuA는 Fe3+-페리크롬에 특이적이고, 리간드-특이적 의존성 채널(ligand-specific gated channel)로 작용한다(Protein Sci 7, 1636-1638). fhu 시스템의 나머지 단백질, 즉, FhuD, FhuC 및 FhuB도 이 철 흡수 시스템의 기능에 필수적이다. 주변세포질 단백질인 FhuD와 세포막-결합 단백질인 FhuC 및 FhuB는 FhuCDB 복합체를 형성하여, 주변세포질로부터 세포막을 통과하여 세포질 내로 페리크롬 및 기타 Fe3+-히드록사메이트 화합물 (Fe3+-에어로박틴, Fe3+-코프로겐)을 수송시키는 기능을 한다(J Bacteriol 169, 3844-3849). FhuCDB 복합체를 통한 철분의 유입시 한 분자의 ATP가 소모되며, 이러한 철 흡수 과정을 위해 단백질 복합체 TonB-ExbB-ExbD가 에너지를 제공한다(FEBS Lett 274, 85-88).
FhuC는 29 kDa의 세포막-결합 단백질을 코딩하고, FhuD 및 FhuB와 함께 철분의 유입을 위한 채널을 형성한다. FhuC는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 구체적인 예로 서열번호 1의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있다.
FhuD는 31 kDa의 세포막-결합 단백질을 코딩하고, FhuC 및 FhuB와 함께 철분의 유입을 위한 채널을 형성한다. FhuD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 구체적인 예로 서열번호 2의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있다.
FhuB는 41 kDa의 세포막-결합 단백질을 코딩하고, FhuC 및 FhuB와 함께 철분의 유입을 위한 채널을 형성한다. FhuB는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 구체적인 예로 서열번호 3의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있다.
구체적으로, 동일한 활성을 갖는 단백질이라도 개체에 따라 아미노산 서열에 약간의 차이가 있을 수 있으므로, FuhC, FhuD, 및 FhuB는 각각 서열번호 5, 6, 및 7의 서열을 가질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 즉, 본 명세서에서, FuhC, FhuD, 및 FhuB는 상기 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 변이체일 수 있으며, 상기 서열번호 5, 6, 및 7과 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 또는 95% 이상 상동성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 또한 상기 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 기재된 염기서열은 당업자에게 잘 알려지 방법으로 다양하게 구현될 수 있는 염기서열의 한 일례로 제시될 뿐 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, "상동성"은 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 또는 염기서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬 (align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "미생물"은 L-아미노산과 같은 유용한 목적 물질의 생산능을 갖는 원핵 미생물 또는 진핵 미생물을 의미한다. 예를 들어, 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 미생물은 에스케리시아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.) , 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라 속(Leptospira), 살모넬라 속(Salmonellar sp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.), 하이포모나스 속(Hypomononas sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium sp.), 노카디아 속(Norcardia) 또는 곰팡이(fungi) 또는 효모(yeast)에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물은 에스케리시아속 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 상기 미생물은 대장균일 수 있다.
본 발명에서, "비변형 균주"는 돌연변이 또는 재조합 방법과 같은 분자생물학 기법에 의해 변형되지 않은 미생물, 구체적으로, 철 흡수 시스템, FhuCDB 복합체를 구성하는 FhuC, FhuD, 및 FhuB 중 하나 이상이 불활성화되도록 변형되어, 세포내 ATP 소모의 감소에 의해 세포내 ATP 수준이 증가되기 전의 미생물을 의미한다. 즉, 재조합 미생물이 유래된 기원 미생물을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 FhuC, FhuD, 및 FhuB 중 하나 이상의 활성이 불활성화 된 것일 수 있으며, FhuC, FhuD, 및 FhuB이 조합되어 불활성화 된 것을 포함하며, 구체적으로는 FhuC, FhuD, 및 FhuB가 모두 불활성화된 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "불활성화"는 해당 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 치환, 또는 삽입에 의한 변이, 상기 유전자의 발현 감소를 초래하는 발현 조절 서열의 변형, 상기 단백질의 활성 약화 또는 제거를 초래하는 염색체상의 상기 유전자의 염기 서열의 변형, 또는 이들의 조합에 의해 변형되어, 해당 단백질이 활성을 상실하거나 약화된 것을 의미한다.
구체적으로 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실은 박테리아 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내의 내재적 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 그의 일부 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체하는 것에 의해 수행될 수 있다. 또한, 화학물질이나 자외선과 같은 돌연변이 유발원을 이용한 돌연변이 유발에 의해 해당 유전자가 결실된 돌연변이체를 수득된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어, "발현 조절 서열"은 유전자의 발현을 조절하는 염기 서열로, 개체 내에서 특정 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 세그먼트를 의미하며, 프로모터, 전사조절인자 결합 부위, 리보좀 결합 부위, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 유전자의 발현 감소를 초래하는 발현조절 서열의 변형은 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화시키도록 핵산 서열의 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의해 발현 조절 서열상의 변이를 유도하거나, 더 약한 활성을 갖는 발현 조절 서열로 교체하는 것에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 비변형 균주에 비해 향상된 목적물질 생산능이 향상된 에스케리시아 속 미생물일 수 있다. 본 발명의 에스케리시아속 미생물은 FhuCDB 복합체를 형성하는 단백질 중 하나 이상의 불활성화에 의해 그를 통한 철분 유입 경로를 불활성화시키고, 이 경로를 통한 철분 유입에 따른 ATP 소모를 감소시켜, 비변형 균주에 비해 증가된 세포내 ATP 수준을 가지며, 이에 의해 목적물질의 생산능이 증가된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "생산능이 향상된" 미생물은 변이 전의 비변형 균주 또는 모세포에 비해 목적 물질의 생산성이 증가된 미생물을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "목적 물질"은 미생물 세포내 ATP 수준을 증가 시켜 생산량이 증가된 물질이면 제한없이 포함되며, 구체적으로는 L-아미노산이며, 더욱 구체적으로는 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균으로부터 FhuC, FhuD, 및 FhuB 중 하나 이상의 불활성화에 의해 수득된, 세포내 ATP 수준이 비변형 균주에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균일 수 있다. 상기 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균은 L-트립토판 오페론 유전자의 발현을 증가시키거나, 최종 산물인 L-트립토판에 의한 피드백 저해를 해제시키거나, L-트립토판 오페론 유전자의 전사 수준의 억제 및 감쇠(attenuation)를 해제시키는 것에 의해 수득된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균으로부터 FhuC, FhuD, 및 FhuB 중 하나 이상의 불활성화에 의해 수득된, 세포내 ATP 수준이 비변형 균주에 비해 증가된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균일 수 있다. 상기 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균은 L-쓰레오닌 오페론 유전자의 발현을 증가시키거나, 최종 산물인 L-쓰레오닌에 의한 피드백 저해를 해제시키거나, L-쓰레오닌 오페론 유전자의 전사 수준의 억제 및 감쇠를 해제시키는 것에 의해 수득된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 세포내 ATP 수준이 향상된 에스케리시아속 미생물을 배양하는 단계, 및 수득된 미생물의 배양액으로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어, 상기 "세포내 ATP 수준이 향상된 에스케리시아속 미생물"은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 일 구체예에 따른 L-아미노산을 생산하는 방법에서, L-아미노산 생산능을 갖는 미생물의 배양은 당업계에 공지된 적합한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자가 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법의 예로, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물 배양 배지들은 예를 들어 문헌 ("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.)에 기재되어 있다. 이들 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분들을 포함한다. 탄소원은 포도당, 유당, 자당, 과당, 맥아당, 전분 및 섬유소와 같은 탄수화물; 대두유, 해바라기 오일, 피마자유(castor oil) 및 코코넛 오일(coconut oil)과 같은 지방; 팔미트산, 스테아르산(stearic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)과 같은 지방산; 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올과 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 탄소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 질소원으로는 펩톤(peptone), 효모추출액(yeast extract), 육즙(gravy), 맥아추출액(malt extract), 옥수수침출액(corn steep liquor (CSL)) 및 콩가루(bean flour)와 같은 유기 질소원 및 요소, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카보네이트 및 암모늄 니트레이트와 같은 무기 질소원을 포함할 수 있으며, 이들 질소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 배지에는 인산원으로서 추가적으로 포타슘 디히드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 포타슘 디히드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate) 및 상응하는 소듐 포함 염(sodium-containing salts)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 배지는 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate) 또는 황산철(iron sulfate)와 같은 금속을 포함할 수 있고, 아미노산, 비타민 및 적합한 전구체 등이 첨가될 수 있다.
또한, 배양액의 호기성 조건을 유지하기 위해서, 배양액 내로 산소 또는 산소를 포함한 가스(예, 공기)가 배양액에 주입될 수 있다. 배양물의 온도는 일반적으로 20-45℃일 수 있으며, 구체적으로는 25-40℃일 수 있다. 배양의 기간은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판과 같은 L-아미노산의 생산이 원하는 수준에 도달할 때까지 계속될 수 있고 구체적으로는, 배양시간은 10-100 시간일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 L-아미노산을 생산하는 방법은 수득된 미생물의 배양액으로부터 추가적으로 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함한다. L-아미노산의 분리는 본 발명의 미생물의 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-아미노산을 정제 또는 회수하는 것에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 비변형 균주에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 에스케리시아속 미생물 및 이를 이용한 목적 물질의 생산 방법을 이용하면, 높은 세포내 ATP 농도가 유전자 발현, 생합성, 물질 수송 등을 증진시키므로 단백질, L-아미노산 등을 포함한 유용한 목적 물질을 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 대장균의 세포내 ATP 수준을 보여준다.
도 2는 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 야생주 유래의 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균의 세포내 ATP 수준을 보여준다.
도 3은 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균의 세포내 ATP 수준을 보여준다.
도 4는 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균의 세포내 ATP 수준을 보여준다.
도 5는 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균의 L-쓰레오닌 생산능을 보여준다.
도 6은 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균의 L-트립토판 생산능을 보여준다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: fhuC , fhuD , 및 fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성 화된 야생형 대장균 W3110의 제작
본 실시예에서는 야생형 대장균 W3110 (ATCC® 39936TM)의 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 상동 재조합에 의하여 각각 결실시켰다.
결실대상 유전자인 fhuC, fhuD, 및 fhuB 유전자는 각각 서열번호 1, 2 및 3의 염기 서열을 가지며, 이들은 서열번호 4의 오페론 형태로 존재한다.
fhuC, fhuD, 및 fhuB의 결실을 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소(lambda Red recombinase)를 이용한, 1-단계 불활성화(one step inactivation) 방법을 사용하였다(Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645). 유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커로, pUC19 (New England Biolabs (USA))에 rmf 프로모터를 라이게이션시키고, pACYC184(New England Biolab)로부터 수득된 돌연변이 loxP-CmR-loxP 카세트를 라이게이션시켜 수득된 pUCprmfmloxC의 클로람페니콜 유전자를 사용하였다(대한민국 출원공개 제2009-0075549호).
먼저, fhuC 및 fhuB 유전자의 일부분과 pUCprmfmloxC 유전자의 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 서열번호 8와 9, 10과 11, 12와 13, 및 8과 13의 프라이머 조합을 이용하여 pUCprmfmloxC를 주형으로 하고, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장시키는 것으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 1차 중합효소 연쇄반응(이하 'PCR')에 의해 약 1.2 kb의 PCR 산물 △fhuC1st, △fhuD1st, △fhuB1st, 및 △fhuCDB1st를 수득하였다.
그 후, PCR을 통해 수득된 1.2 kb의 PCR 산물 △fhuC1st, △fhuD1st, △fhuB1st, 및 △fhuCDB1st를 0.8% 아가로스겔에서의 전기영동 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 1차 PCR에서 수득된 PCR 산물의 5' 및 3' 영역의 20 bp의 염기서열을 포함하는 서열번호 14와 15, 16과 17, 18과 19, 14와 19의 프라이머 조합을 이용하여, 용리된 1차 PCR 산물을 주형으로 하여, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장시키는 것으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 것에 의해 수행하여 약 1.3kb의 PCR 산물 △fhuC, △fhuD, △fhuB, △fhuCDB를 수득하였다. 수득된 PCR 산물을 0.8% 아가로스겔에서의 전기영동후 용리하여 재조합에 사용하였다.
Datsenko KA 등이 개발한 1-단계 불활성화 방법 (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645)에 따라 pKD46 벡터로 형질전환된 대장균 W3110을 컴피턴트(competent)한 상태로 제조한 후, 1차 및 2차 PCR을 통해 수득된 1.3 kb의 단편을 유입하여 형질전환시켰다. 클로람페니콜을 포함하는 LB 배지에서 배양하여 클로람페니콜 내성을 갖는 형질전환체를 선별하였다. 선별된 균주로부터 수득된 게놈을 주형으로, 서열번호 20과 21의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 증폭된 크기가 각각 약 4.4 kb, 4.3 kb, 3.3 kb, 1.6 kb인 것을 확인하여 fhuC, fhuD, fhuB 유전자가 단독 또는 모두 결실되었다는 것을 확인하였다.
상기에서 수득된 클로람페니콜 내성을 갖는 1차 재조합 균주로부터 pKD46을 제거한 후, pJW168 벡터(Gene, (2000) 247,255-264)를 도입하여 클로람페니콜 마커 유전자를 균체로부터 제거하였다(Gene, (2000) 247,255-264). 최종적으로 수득된 균체로부터 서열번호 20와 21의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 수득된 약 3.4 kb, 3.3 kb, 2.2 kb, 0.6 kb의 PCR 산물에 의해 fhuC, fhuD, fhuB 유전자가 단독 또는 모두 결실되었다는 것을 확인하고, 대장균 W3110_ΔfhuC, W3110_ΔfhuD, W3110_ΔfhuB 및 W3110_ΔfhuCDB로 명명하였다.
실시예 2: 제작된 야생형 대장균 유래 fhuC , fhuD , fhuB 유전자 결실 대장균 의 세포내 ATP 수준 측정
본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 균주를 이용하여 실제 세포내 ATP 수준을 측정하였다.
이를 위하여 키요타카 Y. 하라 등이 개발한 루시페라제(luciferase)를 이용한 "세포 ATP 합성능의 정량적 측정 방법"(An Efficient Method for Quantitative determination of Cellular ATP Synthetic Activity)을 이용하였다(J Biom Scre, (2006) Vol. 11, No.3, pp310-17). 요약하면, 글루코오스가 포함된 LB 액체 배지에 실시예 1에서 사용된 비변형 균주인 대장균 W3110과 유전자 결실에 의해 수득된 대장균 W3110_ΔfhuCDB를 각각 밤새 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 상측액을 제거하고 100 mM Tris-Cl(pH 7.5)를 이용하여 수득된 균체를 세척하고, PB 완충액(Permeable buffer: 40%[v/v] 글루코오스, 0.8%[v/v] 트리톤 X-100)을 30분간 처리하여 세포 내의 ATP가 세포 외부로 스며 나오게 하였다. 그 후, 다시 원심분리하여 상등액을 분리하고, 루시페라아제의 기질로 이용되는 루시페린(Luciferin)을 첨가하여 10분간 반응시켰다. 루미노미터를 이용하여 루시페라아제에 의한 발색 정도를 측정하여 ATP를 정량하였다. 도 1에 그 결과가 표시된다. 도 1의 결과는 3회의 반복 실험 결과의 평균값을 나타낸다.
도 1에 표시된 바와 같이, 실시예 1에서 제작한 야생형 대장균 유래 fhuC, fhuD, fhuB 유전자가 단독 또는 모두 결실된 대장균 W3110_ΔfhuC, W3110_ΔfhuD, W3110_ΔfhuB 및 W3110_ΔfhuCDB에서 세포내 ATP 수준이 비변형 균주인 대장균 W3110에 비해 증가하였음을 확인하였다.
실시예 3: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주의 제작 및 세포내 ATP 수준 측정
본 실시예에서는 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주인 대장균 W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 균주(대한민국 공개특허 10-2013-0082121호)의 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 실시예 1에 기재된 바와 같이 상동 재조합에 의하여 단독 또는 모두 결실하여 W3110 trpΔ2_ΔfhuC/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, W3110 trpΔ2_ΔfhuD/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, W3110 trpΔ2_ΔfhuB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 및 W3110 trpΔ2_ΔfhuCDB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 균주를 제작하였다. 이렇게 제작한 균주들에 대해서 실시예 2에서와 동일한 방법으로 세포내 ATP 수준을 측정하였으며 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2에 표시된 바와 같이 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주로부터 제작된 fhuC, fhuD, fhuB 유전자가 각각 또는 모두 결실된 균주들은 세포내 ATP 수준이 비변형 균주 및 대조군 균주보다 증가됨을 확인하였다.
실시예 4: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주의 역가확인
실시예 3에서 기술된 바와 같이 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주인 W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA와 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 단독 또는 모두 결실시켜 세포 내의 ATP를 증가시킨 균주들을 대상으로 글루코오스를 탄소원으로 사용하여 역가 평가를 수행하였다.
상기 균주들을 LB 고체 배지에 한 백금이씩 접종하고, 37℃ 배양기에서 밤새 배양하고, 표 1의 조성을 갖는, 글루코오스가 함유된 25 mL의 역가 배지에 한 백금이씩 접종하였다. 그 후, 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 배양하였다. 그 결과가 표 2에 표시된다. 모든 결과는 3회 반복실험 결과의 평균값을 나타낸다.
표 1
조성물 농도 (리터당)
글루코오스 60 g
K2HPO4 1 g
(NH4)2SO4 15 g
NaCl 1 g
MgSO4·H2O 1 g
소디움 시트레이트 5 g
효모 추출물 2 g
CaCO3 40 g
L-페닐알라닌 0.15 g
L-티로신 0.1 g
pH 6.8
표 2
균주 L-트립토판 생산량(mg/L)*
W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 562
W3110 trpΔ2_ΔfhuC/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 781
W3110 trpΔ2_ΔfhuD/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 816
W3110 trpΔ2_ΔfhuB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 779
W3110 trpΔ2_ΔhuCDB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 796
* 48 시간 측정치
표 2에 표시된 바와 같이, 실시예 3에서 제작된 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주인 W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA에서 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 단독 또는 모두 결실시켜 세포 내의 ATP를 증가시킨 균주들은 비변형 균주인 W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA에 비해 L-트립토판의 생산량이 비변형 균주 대비 최대 약 63%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 도 2에서 확인한 세포내 ATP 수준을 고려할 때, 세포내 ATP 수준 증가를 통해 균주의 L-트립토판 생산능력이 증가되었다는 것을 반영하는 것으로 볼 수 있다.
실시예 5: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 L-쓰레오닌 생산균주 및 L-트립토판 생산균주의 제작
본 실시예에서는 L-트립토판 생산균주인 대장균 KCCM10812P(대한민국 등록특허 제0792095호)와 L-쓰레오닌 생산균주인 KCCM10541P (대한민국 등록특허 제0576342호)의 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 실시예 1에 기재된 바와 같이 상동 재조합에 의하여 각각 결실시켰다.
L-트립토판 생산능을 갖는 비변형 균주인 대장균 KCCM10812P는 L-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주(KFCC 10066)로부터 유래된 균주로, 염색체상의 트립토판 요구성이 해제되고, pheA, trpR, mtr 및 tnaAB 유전자가 약화되고, aroG 및 trpE 유전자가 변이된 것을 특징으로 하는 L-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균이다.
또한, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 비변형 균주인 대장균 KCCM10541P는 대장균 KFCC10718(대한민국 출원공개 제1992-0008365호)로부터 유래된 균주로, L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노부티르산 내성을 가지며, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균이다.
결실대상 유전자인 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 대장균 KCCM10812P 및 대장균 KCCM10541P로부터 각각 실시예 1에서와 동일한 방법으로 결실시켰고, 이에 의해 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM10541_ΔfhuCDB와 L-트립토판 생산균주 KCCM10812P_ΔfhuCDB를 제작하였다.
실시예 6: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 L-쓰레오닌 생산균주 및 L-트립토판 생산균주의 ATP 수준 측정
본 실시예에서는 실시예 5에서 제작된 균주들을 이용하여 실제 세포내 ATP 수준을 측정하였다.
실시예 2에서와 동일한 방법으로 세포내 ATP 수준을 측정하였다. 그 결과가 도 3 및 도 4에 표시된다. 도 3 및 도 4의 결과는 결과는 3회 반복 실험 결과의 평균값을 나타낸다. 대조군으로서, 실시예 3에서 비변형 균주로 이용된 대장균 KCCM10812P 및 대장균 KCCM10541P보다 세포내 ATP 수준이 높다고 알려진 ysa와 ydaS 유전자가 결실된 L-쓰레오닌 생산균주(대장균 KCCM10541P_△ysa△ydaS)와 L-트립토판 생산균주(대장균 KCCM10812P_△ysa△ydaS)를 이용하였다.(대한민국 등록특허 제1327093호)
도 3과 4에 표시된 같이, L-쓰레오닌 생산균주 및 L-트립토판 생산균주로부터 실시예 3에 의해 제작된 fhuC, fhuD, fhuB 유전자가 결실된 균주들은 세포내 ATP 수준이 비변형 균주 및 대조군 균주보다 증가되었다.
실시예 7: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 기능이 불활성화된 L-쓰레오닌 생산균주의 역가확인
실시예 5에서 기술된 바와 같이 L-쓰레오닌 생산 미생물인 대장균 KCCM10541P(대한민국 등록특허 제0576342호)에서 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 결실시켜 세포 내의 ATP를 증가시킨 균주들을 대상으로 글루코오스를 탄소원으로 사용하여 역가 평가를 수행하였다. ysa와 ydaS 유전자가 결실된 L-쓰레오닌 생산 균주(대장균 KCCM10541P_△ysa△ydaS)를 대조군으로 포함시켜 역가 평가의 결과를 비교하였다.
상기 균주들을 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지에서 밤새 배양하고, 표 1의 조성을 갖는, 글루코오스가 함유된 25 mL의 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 50시간 배양하였다. 그 결과가 표 4 및 도 5에 표시된다. 모든 결과는 3회 반복실험 결과의 평균값을 나타낸다.
표 3
조성 농도 (리터당)
글루코오스 70 g
KH2PO4 2 g
(NH4)2SO4 25 g
MgSO4·H2O 1 g
FeSO4·H2O 5 mg
MnSO4·H2O 5 mg
효모 추출물 2 g
CaCO3 30 g
표 4
균주 OD562 당소모량(g/L)* L-쓰레오닌 생산량(g/L)**
KCCM10541P 22.8 41.0 28.0 ± 0.5
KCCM10541P_△ysaA△ydaS 23.9 42.1 29.8 ± 0.9
KCCM10541P_△fhuCDB 23.1 41.8 30.5 ± 1.
* 30 시간 측정치
** 50 시간 측정치
표 4에 표시된 바와 같이, 본 발명에 따라 제작된 재조합 L-쓰레오닌 생산 대장균 균주는 비변형 균주와 비슷한 생리활성을 나타내면서 L-쓰레오닌의 생산량이 비변형 균주 대비 약 9%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 도 2에서 확인한 세포내 ATP 수준을 고려할 때, 세포내 ATP 수준 증가를 통해 균주의 L-쓰레오닌 생산능력이 증가되었다는 것을 반영하는 것으로 볼 수 있다.
실시예 8: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 기능이 불활성화된 L-트립토판 생산균주의 역가확인
실시예 5에서 기술된 바와 같이 L-트립토판 생산균인 KCCM10812P(대한민국 등록특허 제0792095호)에서 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 결실시켜 세포 내의 ATP를 증가시킨 균주들을 대상으로 글루코오스를 탄소원으로 사용하여 역가 평가를 수행하였다. ysa와 ydaS 유전자가 결실된 L-트립토판 생산 균주(대장균 KCCM10812P_△ysa△ydaS)를 대조군으로 포함시켜 실시예 4에서와 동일한 방법으로 역가 평가를 수행하였다.
역가 평가 결과는 표 5 및 도 6에 표시되었으며, 모든 결과는 3회 반복실험 결과의 평균값을 나타낸다.
표 5
균주 OD600 당소모량(g/L)* L-트립토판 생산량(g/L)**
KCCM10812P 18.2 45.7 5.5 ± 0.2
KCCM10812P_△ysaA△ydaS 18.3 46.3 6.7 ± 0.1
KCCM10812P_△fhuCDB 17.9 47.4 7.1 ± 0.5
* 33 시간 측정치
** 48 시간 측정치
표 5에 표시된 바와 같이, 본 발명에 따라 제작된 재조합 L-트립토판 생산 대장균 균주는 비변형 균주와 비슷한 생리활성을 나타내면서 L-트립토판의 생산량이 비변형 균주 대비 약 30%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 도 3에서 확인한 세포내 ATP 수준을 고려할 때, 증가된 세포내 ATP 수준을 통해 균주의 L-트립토판 생산능력이 증가되었다는 것을 반영하는 것으로 볼 수 있다.
본 발명에서 재조합된 균주 CA04-2801(KCCM10812P_△fhuCDB)은 2013년 11월 15일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁되어 KCCM11474P로 기탁번호를 부여받았다.
전술된 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 본 명세서에 기재된 실시예는 예시적인 것이며 본 발명을 한정하는 것은 아닌 것으로서 이해해야 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위와 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에 기재된 서열번호 1 내지 서열번호 21의 서열이 첨부된 서열목록에 표시된다.
Figure PCTKR2015003625-appb-I000001

Claims (7)

  1. 철 흡수 시스템을 구성하는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질 중 하나 이상의 활성이 불활성화되도록 변형되어, 비변형 균주에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 에스케리시아속 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 에스케리시아속 미생물은 서열번호 5, 6, 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성이 모두 불활성화된 것인 에스케리시아속 미생물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것인 에스케리시아속 미생물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 에스케리시아속 미생물은 비변형 균주에 비해 향상된 L-아미노산 생산능을 갖는 것인 에스케리시아속 미생물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판인 것인 에스케리시아속 미생물.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 에스케리시아속 미생물을 배양하는 단계, 및 수득된 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판인 것인 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112218881A (zh) * 2018-11-29 2021-01-12 Cj第一制糖株式会社 cAMP受体蛋白变体及使用其制备L-氨基酸的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9430463B2 (en) 2014-05-30 2016-08-30 Apple Inc. Exemplar-based natural language processing
KR102134418B1 (ko) * 2019-06-17 2020-07-16 씨제이제일제당 주식회사 L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-타이로신 생산 방법
KR102269642B1 (ko) * 2019-10-31 2021-06-25 대상 주식회사 피리독살 키나아제 유전자 불활성화에 의해 아미노산 생산능력이 향상된 균주
KR102261851B1 (ko) * 2021-01-15 2021-06-04 씨제이제일제당 (주) 신규한 abc 트랜스포터 atp-결합 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070086634A (ko) * 2004-11-26 2007-08-27 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 공업적으로 유용한 미생물
KR100792095B1 (ko) * 2006-12-29 2008-01-04 씨제이 주식회사 Ｌ-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주로부터유전자조작된 ｌ-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균균주 및 이를 이용한 트립토판 제조방법
KR20130080930A (ko) * 2012-01-06 2013-07-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산을 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002077183A2 (en) * 2001-03-21 2002-10-03 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in microorganisms
RU2244007C2 (ru) * 2002-02-27 2005-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты)
ES2331956T3 (es) * 2004-01-30 2010-01-21 Ajinomoto Co., Inc. Microorganismo que produce l-aminoacidos y procedimiento para producir l-aminoacidos.
US8828355B2 (en) * 2004-09-17 2014-09-09 University Of Utah Research Foundation Imaging reporters of transgene expression
RU2304166C2 (ru) * 2005-01-19 2007-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ltaE
CA2626900C (en) * 2005-08-20 2013-07-23 Scarab Genomics, Llc Reduced genome e. coli
RU2312893C2 (ru) * 2006-01-17 2007-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
WO2009116566A1 (ja) 2008-03-18 2009-09-24 協和発酵キリン株式会社 工業的に有用な微生物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070086634A (ko) * 2004-11-26 2007-08-27 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 공업적으로 유용한 미생물
KR100792095B1 (ko) * 2006-12-29 2008-01-04 씨제이 주식회사 Ｌ-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주로부터유전자조작된 ｌ-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균균주 및 이를 이용한 트립토판 제조방법
KR20130080930A (ko) * 2012-01-06 2013-07-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산을 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE NCBI [O] XP055238010, Database accession no. EFJ66882 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112218881A (zh) * 2018-11-29 2021-01-12 Cj第一制糖株式会社 cAMP受体蛋白变体及使用其制备L-氨基酸的方法
CN112218881B (zh) * 2018-11-29 2023-11-07 Cj第一制糖株式会社 cAMP受体蛋白变体及使用其制备L-氨基酸的方法

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