WO2020138815A1 - L-아미노산을 생산하는 대장균 변이주 또는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산 방법 - Google Patents

L-아미노산을 생산하는 대장균 변이주 또는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an E. coli mutant or Corynebacterium glutamicum mutant having improved L-amino acid production capacity and a method for producing L-amino acid using the same.
  • L-tryptophan is one of essential amino acids, which is required to polymerize proteins in vivo or to synthesize vitamins such as amides of nicotinic acid. It is widely used.
  • L-phenylalanine is one of the essential amino acids, tyrosine, a non-essential amino acid in vivo; Neurotransmitters such as dopamine, norepinephrine and adrenaline; It is used as a precursor for skin pigments such as melanin, and is widely used as food, cosmetics, and pharmaceutical raw materials.
  • L-tyrosine L-glutamine, L-lysine, L-arginine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-threonine, L-histidine, L-serine, L-citrulline, etc.
  • Amino acids are widely used in various fields such as food, cosmetics, and pharmaceuticals.
  • the L-amino acid was industrially produced through a fermentation method using a microorganism strain obtained in a natural state or a mutant strain modified to improve the L-amino acid production capacity of the strain.
  • a mutant strain an auxotroph or a regulatory mutant strain for microorganisms such as Escherichia coli and Corynebacterium was used, and a genetic recombination technology was rapidly developed in the 1980s, and metabolic processes and its regulation mechanisms were elaborated. Accordingly, many researchers have achieved great results by developing excellent recombinant strains using genetic engineering techniques.
  • Patent Document 1 U.S. Patent No. 5,972,663
  • Patent Document 2 European Registered Patent No. 1016710
  • Patent Document 3 Korean Registered Patent No. 10-1023925
  • the present invention aims to provide an E. coli ( Escherichia coli ) mutant with improved L-amino acid production capacity by overexpressing one or more genes selected from the group consisting of yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC and emrD .
  • the present invention provides a variant of Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ) with improved L-amino acid production capacity by overexpressing one or more genes selected from the group consisting of yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC and emrD . It is aimed at.
  • the present invention is the step of culturing the mutant strain in the medium; And recovering L-amino acid from the mutant or medium.
  • an E. coli variant strain having improved L-amino acid production capacity by overexpressing one or more genes selected from the group consisting of yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC and emrD , or Corynebacterium glutamicum may be a mutant strain.
  • genes other than the gene yddG are involved in the production of amino acids, and by selecting new amino acid-emitting genes, excellent L-tryptophan, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-glutamine, L-lysine, L -An L-amino acid production variant having improved production capacity of L-amino acids such as arginine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-threonine, L-histidine, L-serine, and L-citrulline was prepared.
  • L-amino acids such as arginine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-threonine, L-histidine, L-serine, and L-citrulline was prepared.
  • the gene related to amino acid excretion may be one of the genes represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • the base sequence of the gene ydhK, SEQ ID NO: 4, represented by the gene yicL, the base sequence of the gene ydiN, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 37 represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 represented by the base sequence of SEQ ID NO: 1 gene may be aaeB, yeeA gene, emrD gene represented by the base sequence of the rhtC gene, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 39 represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is represented by the base sequence of SEQ ID NO: 5 represented by the following.
  • the gene related to amino acid excretion may be one of genes encoding proteins represented by amino acid sequences of SEQ ID NOs: 8 to 14.
  • ydhK protein amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 represented by the ydiN protein
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 which may be a protein aaeB
  • yeeA protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • rhtC protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13
  • SEQ ID NO: emrD protein represented by the amino acid sequence of represented by 14.
  • the mutant strain may be selected from Escherichia sp. or Corynebacterium sp. as a parent strain.
  • the genus Escherichia is widely used for the production of various L-amino acids such as L-glutamic acid, L-lysine, L-threonine, and L-cysteine, and is known to have high L-tryptophan productivity.
  • the parent strain is preferably Escherichia coli , which is easy to obtain and has good convenience.
  • the strain of genus Corynebacterium has the advantage of high productivity of L-amino acids such as L-glutamic acid and L-lysine, but it has the advantage of low production of by-products, and it is possible to stably produce amino acids even in limited environments such as lack of oxygen or depletion of sugar. Do.
  • the parent strain is preferably Corynebacterium glutamicum , which is mainly used to produce amino acids.
  • the parent strain may be a wild type strain obtained in a natural state, or a strain in which a gene of a wild type strain has been artificially manipulated.
  • L-amino acid-producing E. coli mutant and “L-amino acid-producing Corynebacterium glutamicum mutant” mean microorganisms mutated to produce L-amino acid at a higher concentration than the parent strain.
  • mutagenesis of microorganisms may be performed by various means well known in the art, and one of physical or chemical mutagenesis methods may be used.
  • N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine diepoxybutane, ethylmethane sulfone Eight (ethylmethane sulfonate), mustard (mustard) compound, hydrazine (hydrazine) and nitrous acid (nitrous acid)
  • NTG N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • diepoxybutane diepoxybutane
  • ethylmethane sulfone Eight ethylmethane sulfonate
  • mustard mustard
  • hydrazine hydrazine
  • nitrous acid nitrous acid
  • the physical mutagenesis factor may use ultraviolet and gamma radiation, but is not limited thereto.
  • the parent strain is affected by the mutagenic factor at a concentration sufficient to leave a living population of a certain size.
  • the size may vary depending on the type of mutagenesis factors, and the mutant factor is dependent on the amount of mutations induced in the surviving population with a constant killing rate.
  • the killing rate is 10% to 50% of the starting population, and the occurrence of mutation by nitrite may be 0.01% to 0.1% of the starting population.
  • the L-amino acid is L-tryptophan, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-glutamine, L-lysine, L-arginine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine , L-threonine, L-histidine, L-serine, and L-citrulline, but is not limited thereto.
  • L-amino acid-producing E. coli mutants and Corynebacterium glutamicum mutants are transformed by the amino acid-releasing gene, or control of a strong promoter on the chromosome of the strain
  • the number of copies of the amino acid-releasing gene may be amplified to overexpress the gene.
  • by inserting one or more genes among the seven genes related to the amino acid excretion into a plasmid of a bacterium containing a promoter into the parent strain the amino acid-releasing gene is over-expressed compared to the parent strain, L- A mutant strain with improved production capacity of amino acids can be obtained.
  • the method for producing L-amino acid includes culturing the mutant in a medium; And recovering L-amino acids from the mutant strain or medium.
  • “medium” is used for the culture of E. coli mutants and Corynebacterium glutamicum mutants of the present invention, wherein the mutant strain has a high yield of L-amino acids, for example, L-tryptophan, L-phenylalanine Carbon source to produce L-tyrosine, L-glutamine, L-lysine, L-arginine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-threonine, L-histidine, L-serine or L-citrulline , Means a medium containing a nitrogen source and inorganic salts.
  • L-amino acids for example, L-tryptophan, L-phenylalanine Carbon source to produce L-tyrosine, L-glutamine, L-lysine, L-arginine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-threonine, L-histidine, L-serine or L-c
  • Carbon sources in the medium include, for example, sugars and carbohydrates such as glucose, sugar, citrate, fructose, lactose, maltose or molasses; Oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil and the like; Fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid; Glycerol; Alcohol such as ethanol; Organic acids such as acetic acid may be included, but are not limited thereto, and these materials may be used individually or as a mixture.
  • the culture medium of the E. coli strain may include glucose.
  • the medium of the Corynebacterium glutamicum mutant may include glucose, molasses or glucose and molasses, most preferably, the medium is a carbon source, based on 100 parts by weight of glucose, 5 to 60 parts by weight of molasses.
  • the nitrogen source in the medium for example, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn steep liquor, soybean cake, urea, thiourea, ammonium salt, nitrate and other compounds containing organic or inorganic nitrogen may be used.
  • the inorganic salts in the medium may be a compound containing magnesium, manganese, potassium, calcium, iron, zinc, cobalt, etc., but is not limited thereto.
  • the personnel that can be used in the medium may include, but are not limited to, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or a corresponding sodium-containing salt.
  • the culture medium may include a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth.
  • the compounds may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • amino acids, vitamins, nucleic acids and related compounds in addition to the components of the carbon source, nitrogen source and inorganic salts may be additionally added to the medium of the present invention.
  • the raw materials may be added batchwise or continuously in an appropriate manner to the medium during the culture process.
  • the pH of the medium can be adjusted by using a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia or an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid in an appropriate manner.
  • a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid
  • anti-foaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress the formation of bubbles.
  • Oxygen or an oxygen-containing gas eg, air may be injected into the medium to maintain aerobic conditions.
  • cultivation means growing microorganisms under environmental conditions that are artificially controlled.
  • Method for culturing a microorganism of the invention can be carried out using a culture method known in E. coli (Escherichia coli), Corynebacterium Com (Corynebacterium glutamicum), which in the art.
  • examples of the culture method include, but are not limited to, batch culture, continuous culture, and fed-batch culture.
  • the temperature may be usually 20°C to 45°C, but is not limited thereto.
  • Cultures are desired L-tryptophan, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-glutamine, L-lysine, L-arginine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-threonine, L-histidine, L- This is continued until the maximum amount of L-amino acids such as serine and L-citrulline is obtained.
  • the culture may be performed for 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the produced L-amino acid may be discharged into the culture medium or contained in the mutant.
  • the step of recovering the L-amino acid from the mutant or the culture medium in which the mutant is cultured may be various methods well known in the art, for example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC, etc., but is not limited thereto. It does not work.
  • An E. coli mutant or Corynebacterium glutamicum mutant producing L-amino acid according to the present invention can exhibit improved L-amino acid production capacity compared to a parent strain, and can produce high concentrations of L-amino acid with high yield. .
  • E. coli W0G strain (Accession No.: KFCC11660P) producing L-tryptophan
  • E. coli MWTR42 strain (Accession No.: KFCC10780) producing L-phenylalanine
  • chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5] gene yddG deletion mutants were prepared.
  • PCR polymerase chain reaction
  • yddG H1F (SEQ ID NO: 15) CAATGCCGCTACTGTTGTTCCAGCC yddG H1R (SEQ ID NO: 16) CAGTGGTGCGTTTTTCTACCGCTAT yddG H2F (SEQ ID NO: 17) AATAACTGCCGGGTCTACGGCC yddG H2R (SEQ ID NO: 18) AACGTATTTTCTAAACGAATTTTAAACGGCGTC yddG CF (SEQ ID NO: 19) CGGAACAGTATGTGCAGGTGTTACGG yddG CR (SEQ ID NO: 20) AACAAACCAGTTACAACCACCGCAAC
  • mutant with a deletion yddG gene from E. coli strains with W0G W1G strain was named the mutant with a deletion yddG gene from E. coli strains with W0G W1G strain, and named the yddG gene deletion mutants in E. coli strains as MWTR42 MWTR5 strain.
  • Each strain was inoculated by 1% into a flask containing 10 mL of each medium having the composition shown in Table 2 below, followed by shaking culture at 37°C at 200 rpm for 70 hours.
  • the absorbance of each culture was measured at OD 610 nm and the production of L-tryptophan or L-phenylalanine was compared, and the results are shown in Table 3 below.
  • mutant strains (W1G strain, MWTR5 strain) in which the gene yddG was deleted were still confirmed to produce L-tryptophan and L-phenylalanine, respectively. That is, even if yddG, which is known as an emission gene for aromatic amino acids, is removed, L-amino acid production capacity of each mutant is maintained, and it can be seen that there are genes involved in the emission of amino acids in addition to yddG .
  • E. coli mutants were inserted with genes yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, and emrD , respectively.
  • E. coli W0G strain (Accession No.: KFCC11660P) producing L-tryptophan was used.
  • each gene yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD was amplified by PCR, and then prepared by treating restriction enzymes SacI and XbaI .
  • the base sequence of the yicL gene is the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • the base sequence of the ydiN gene is the base sequence of SEQ ID NO: 2
  • the base sequence of the ydhK gene is SEQ ID NO: 3 or the base sequence of SEQ ID NO: 37
  • aaeB gene The base sequence of SEQ ID NO: 4, the yeeA gene base sequence of SEQ ID NO: 5, the rhtC gene base sequence of SEQ ID NO: 6, emrD gene base sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 39 It was confirmed by the base sequence of.
  • restriction enzymes SacI and XbaI were cut into the vector pTrc99A, and each gene prepared therein was inserted to express the expression vectors pTrc99A::yicL, pTrc99A::ydiN, pTrc99A::ydhK, pTrc99A::aaeB, pTrc99A::yeeA, pTrc99A::rhtC and pTrc99A::emrD were prepared.
  • Each expression vector was transformed into a W0G strain, and the mutant strains W0G/pTrc99A::yicL, W0G/pTrc99A::ydiN, W0G/pTrc99A::ydhK, W0G/pTrc99A::aaeB, W0G/pTrc99A::yeeA , W0G/pTrc99A::rhtC and W0G/pTrc99A::emrD were prepared.
  • Each strain was inoculated into a flask containing 10 mL of each medium of the composition shown in Table 2, and cultured with shaking at 34° C. at 200 rpm for 72 hours.
  • the absorbance of each culture was measured at OD 610 nm and the production of L-tryptophan was compared, and the results are shown in Table 5 below.
  • each gene yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD amplified E. coli strain increased L-tryptophan production capacity compared to the control group.
  • E. coli mutants were inserted with genes yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, and emrD , respectively.
  • An expression vector was prepared in the same manner as in Experimental Example 2-1, except that the E. coli MWTR42 strain (Accession No.: KFCC10780) producing L-phenylalanine was used instead of the W0G strain. Mutation strains MWTR42/pTrc99A::yicL, MWTR42/pTrc99A::ydiN, MWTR42/pTrc99A::ydhK, MWTR42/pTrc99A::aaeB, MWTR42/pTrc99A:yee , MWTR42/pTrc99A::rhtC and MWTR42/pTrc99A::emrD were prepared.
  • each gene yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, and emrD amplified E. coli strain increased L-phenylalanine production capacity compared to the control group.
  • Corynebacterium glutamicum DW28G (Accession No.: KTCT13769BP), which produces L-tryptophan, was used.
  • the expression vectors pTrc99A::yicL, pTrc99A::ydiN, pTrc99A::ydhK, pTrc99A::aaeB, pTrc99A::yeeA, pTrc99A::rhtC, pTrc99A::emrD prepared in Experimental Example 2-1 as a template
  • Each of the genes yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, and emrD was amplified by PCR using the primers in Table 7 and prepared by phosphorylation (5'-phosphorylation).
  • Expression pEKO::yicL, pEKO::ydiN, pEKO::ydhK, pEKO::aaeB, pEKO::yeeA, pEKO: are cut by treating the vector pEKO with the restriction enzyme Eco53KI and inserting each gene prepared therebetween. :rhtC, pEKO::emrD was prepared.
  • Each expression vector is transformed into a strain of DW28G, and each gene is amplified strain DW28G/pEKO::yicL, DW28G/pEKO::ydiN, DW28G/pEKO::ydhK, DW28G/pEKO::aaeB, DW28G/pEKO::yeeA , DW28G/pEKO::rhtC, DW28G/pEKO::emrD was prepared.
  • primer_F (SEQ ID NO: 35)
  • gcgccgacatcataacggttctgg primer_R (SEQ ID NO: 36)
  • the production capacity of L-tryptophan of ::rhtC, DW28G/pEKO::emrD was confirmed.
  • each gene yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD amplified Corynebacterium glutamicum mutant strain was confirmed to have increased L-tryptophan production compared to the control group.

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Abstract

본 발명은 L-아미노산 생산능이 향상된 L-아미노산 생산 대장균 변이주 또는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 L-아미노산 생산 대장균 변이주 및 코리네박테리움 글루타미컴 변이주는 모균주에 비해 향상된 L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신, L-글루타민, L-라이신, L-아르기닌, L-발린, L-루신, L-이소루신, L-트레오닌, L-히스티딘, L-세린, L-시트룰린과 같은 L-아미노산의 생산능을 발휘하며, 고농도의 L-아미노산을 높은 수율로 생산할 수 있다.

Description

L-아미노산을 생산하는 대장균 변이주 또는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산 방법
본 발명은 L-아미노산 생산능이 향상된 대장균 변이주 또는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
L-트립토판(L-tryptophan)은 필수아미노산 중 하나로서 생체 내에서 단백질을 중합하거나 니코틴산아마이드 등의 비타민을 합성하는데 요구되며, 아미노산류 강화제, 사료첨가제, 수액제 등의 의약 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되고 있다. L-페닐알라닌(L-phenylalanine)은 필수아미노산 중 하나로서 생체 내에서 비필수아미노산인 티로신; 도파민, 노르에피네프린, 아드레날린 등의 신경전달물질; 피부 색소인 멜라닌 등의 전구체로 이용되며, 식품, 화장품, 의약 원료 등으로 널리 사용되고 있다. 이외에, L-티로신, L-글루타민, L-라이신, L-아르기닌, L-발린, L-루신, L-이소루신, L-트레오닌, L-히스티딘, L-세린, L-시트룰린 등 여러 L-아미노산은 식품, 화장품, 의약품 등의 다양한 분야에서 널리 사용되고 있다,
이러한 L-아미노산은 자연상태에서 수득된 미생물 균주 또는 그 균주의 L-아미노산 생산능이 향상되도록 변형된 변이주를 이용하여 발효법을 통해 공업적으로 생산되었다. 변이주로는 대장균, 코리네박테리움 등의 미생물에 대한 영양 요구 균주(auxotroph)나 조절부위 변이주를 이용하였으며, 1980년대에 들어서면서 유전자 재조합 기술이 급격히 발달하여 대사과정과 그 조절 기작들이 자세히 규명됨에 따라 많은 연구자들이 유전자 조작 기법을 이용하여 우수한 재조합 균주들을 개발하여 큰 성과를 거두었다.
유전자 재조합 기술을 이용시 아미노산 생합성에 관여하는 효소의 활성을 증가하거나, 또는 생산된 L-아미노산에 의한 피드백을 억제함으로써 아미노산 생성능을 향상시킬 수 있다. 또한, 아미노산 배출 유전자의 발현을 조절하여 아미노산 생산능을 개선시킬 수 있다. 미국등록특허 제5,972,663호에는 대장균 등 여러 균주의 유전자 mex, bmr, qacA 등을 인위적으로 과발현시켜 L-시스테인, L-시스틴, N-아세틸세린, 티아졸리딘 유도체의 생산능을 향상시킨 것이 기재되어 있고, 유럽등록특허 제1016710호에는 에세리키아속 균주의 유전자 yahN, yeaS, yfiK, yggA를 인위적으로 과발현시켜 L-글루탐산, L-라이신, L-트레오닌, L-알라닌, L-히스티딘, L-프롤린, L-아르기닌, L-발린, L-이소루신의 생산능을 향상시킨 것이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1023925호에는 에세리키아속 균주의 유전자 yddG를 인위적으로 과발현시켜 L-트립토판, L-페닐알라닌의 생산능을 향상시킨 것이 기재되어 있다.
이러한 종래 연구를 바탕으로, 본 발명자들은 에세리키아속 균주 및 코리네박테리움속 균주 내 L-아미노산 배출 유전자의 발현을 조절함으로써 다양한 L-아미노산의 생산능이 향상된 L-아미노산 생산 변이주를 제조하여 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 미국등록특허 제5,972,663호
(특허문헌 2) 유럽등록특허 제1016710호
(특허문헌 3) 한국등록특허 제10-1023925호
상기한 문제점을 해결하기 위해,
본 발명은 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC 및 emrD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현하여 L-아미노산 생산능이 향상된 대장균( Escherichia coli) 변이주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC 및 emrD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현하여 L-아미노산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미컴( Corynebacterium glutamicum) 변이주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 변이주 또는 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 L-아미노산의 생산 방법을 제공하는 것을 목적을 한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 L-아미노산을 생산하는 변이주로는 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC 및 emrD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현하여 L-아미노산 생산능이 향상된 대장균 변이주 또는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주일 수 있다.
종래 기술로, 에세리키아속 변이주의 아미노산 배출 유전자 yddG를 과발현하도록 조절함으로써 방향족 아미노산인 L-트립토판 및 L-페닐알라닌의 생산을 향상시킨 바가 있었다. 그러나, 본 발명자들이 상기 유전자 yddG가 L-아미노산의 생산능에 미치는 영향을 확인해 본 결과, 유전자 yddG가 제거된 균주에서 여전히 L-트립토판 및 L-페닐알라닌이 발현하는 것을 확인하였다(실험예 1 참조). 이로부터, 본 발명자들은 아미노산 생산에 유전자 yddG 이외에 다른 유전자가 관여한다는 것을 인지하였고, 새로운 아미노산 배출 유전자를 선별하여 우수한 L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신, L-글루타민, L-라이신, L-아르기닌, L-발린, L-루신, L-이소루신, L-트레오닌, L-히스티딘, L-세린, L-시트룰린 등의 L-아미노산의 생산능이 향상된 L-아미노산 생산 변이주를 제조하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 아미노산 배출 관련 유전자로는 서열번호 1 내지 7의 염기서열로 표시되는 유전자들 중 하나의 유전자일 수 있다. 구체적으로는, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자 yicL, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자 ydiN, 서열번호 3 또는 서열번호 37의 염기서열로 표시되는 유전자 ydhK, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 유전자 aaeB, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 유전자 yeeA, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 유전자 rhtC, 서열번호 7 또는 서열번호 39의 염기서열로 표시되는 유전자 emrD일 수 있다.
또한, 상기 아미노산 배출 관련 유전자로는 서열번호 8 내지 14의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 암호화하는 유전자들 중 하나의 유전자일 수 있다. 구체적으로는, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 yicL 단백질, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 ydiN 단백질, 서열번호 10 또는 서열번호 38의 아미노산 서열로 표시되는 ydhK 단백질, 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 aaeB 단백질, 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 yeeA 단백질, 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 rhtC 단백질, 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 emrD 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 변이주는 모균주(parent strain)로 에세리키아속 균주( Escherichia sp.) 또는 코리네박테리움속 균주( Corynebacterium sp.)에서 선택될 수 있다.
에세리키아속 균주는 L-글루탐산, L-라이신, L-트레오닌, L-시스테인 등 여러 L-아미노산의 생산에 널리 사용되며, 특히 L-트립토판 생산성이 높은 것으로 알려져 있다. 상기 모균주로는 입수가 용이하고 편의성이 좋은 대장균( Escherichia coli)인 것이 바람직하다.
코리네박테리움속 균주는 L-글루탐산, L-라이신 등의 L-아미노산 생산성이 높은 반면 부산물의 생성이 적다는 장점이 있으며, 산소 부족이나 당 고갈과 같은 제한된 환경에서도 안정적으로 아미노산의 생산이 가능하다. 상기 모균주로는 아미노산을 생산하는데 주로 사용되는 코리네박테리움 글루타미컴( Corynebacterium glutamicum)인 것이 바람직하다.
이러한 모균주는 자연상태에서 수득된 야생형(wild type) 균주이거나, 또는 야생형 균주의 유전자가 이미 인위적으로 조작된 균주일 수 있다.
본 명세서에서, "L-아미노산 생산 대장균 변이주" 및 "L-아미노산 생산 코리네박테리움 글루타미컴 변이주"는 모균주에 비해 L-아미노산을 고농도로 생산할 수 있도록 돌연변이 시킨 미생물을 의미한다. 이때, 미생물의 돌연변이 유발은 해당 분야에서 널리 알려진 다양한 수단에 의해 수행될 수 있으며, 물리적 혹은 화학적 돌연변이 유발 방법 중 하나의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 화학적 돌연변이 유발 요인으로 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine; NTG), 디에폭시부탄(diepoxybutane), 에틸메탄 설폰에이트(ethylmethane sulfonate), 머스타드(mustard) 화합물, 히드라진(hydrazine) 및 아질산(nitrous acid)을 사용할 수 있으나, 이러한 화합물들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 물리적 돌연변이 유발 요인은 자외선 및 감마 방사선을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 돌연변이 유발 시에 모균주는 특정 크기의 생존 개체군을 남겨둘 정도의 농도에서 돌연변이 유발 인자에 의해 영향을 받는다. 상기 크기는 돌연변이 유발 인자들 종류에 따라 다를 수 있으며, 돌연변이 인자가 일정한 살생율로 생존 개체군내에 유발하는 돌연변이의 양에 의존한다. 예를 들어, NTG의 경우 살생율은 출발 개체군의 10% 내지 50%이고, 아질산에 의한 돌연변이 발생은 출발 개체군의 0.01% 내지 0.1%일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-아미노산은 L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신, L-글루타민, L-라이신, L-아르기닌, L-발린, L-루신, L-이소루신, L-트레오닌, L-히스티딘, L-세린 및 L-시트룰린으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, L-아미노산 생산 대장균 변이주 및 코리네박테리움 글루타미컴 변이주는 상기 아미노산 배출 유전자에 의해 형질전환(transformation)되거나, 상기 균주의 염색체 상에서 강력한 프로모터(promoter)의 제어 하에 상기 아미노산 배출 유전자의 복사체(copy) 수가 증폭되어 상기 유전자를 과발현(overexpression) 하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 아미노산 배출 관련 7개 유전자들 중 하나 이상의 유전자를 프로모터를 포함하는 세균의 플라스미드에 삽입하여 모균주에 도입함으로써 모균주에 비해 상기 아미노산 배출 유전자가 과발현되어 L-아미노산의 생산능이 향상된 돌연변이 균주를 얻을 수 있다.
이러한 변이주를 이용하여 고농도의 L-아미노산을 높은 수율로 생산할 수 있다. 구체적으로, L-아미노산의 생산 방법은 상기 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 변이주 또는 배지로부터 L- 아미노산을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "배지"는 본 발명의 대장균 변이주 및 코리네박테리움 글루타미컴 변이주의 배양에 사용되는 것으로서, 상기 변이주가 높은 수율의 L-아미노산, 예를 들어, L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신, L-글루타민, L-라이신, L-아르기닌, L-발린, L-루신, L-이소루신, L-트레오닌, L-히스티딘, L-세린 또는 L-시트룰린을 생산할 수 있도록 탄소원, 질소원 및 무기염류를 포함하는 배지를 의미한다.
상기 배지에서 탄소원으로는 예를 들어, 포도당, 설탕, 구연산염, 과당, 젖당, 엿당 또는 당밀과 같은 당 및 탄수화물; 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방; 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산; 글리세롤; 에탄올과 같은 알코올; 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 대장균 변이주의 배지는 포도당을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 바람직하게는, 상기 코리네박테리움 글루타미컴 변이주의 배지는 포도당, 당밀 또는 포도당 및 당밀을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는, 상기 배지는 탄소원으로 포도당 100 중량부에 대하여, 5 내지 60 중량부의 당밀을 포함할 수 있다.
상기 배지에서 질소원으로는 예를 들어, 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 옥수수 침지액, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 질산염 및 기타 유기 또는 무기 질소를 포함하는 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 배지에서 무기염류는 마그네슘, 망간, 칼륨, 칼슘, 철, 아연, 코발트 등을 포함하는 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
한편, 상기 배지에 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 상기 화합물들은 개별적으로 또는 혼합물로써 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 탄소원, 질소원 및 무기염류의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 본 발명의 배지에 추가적으로 첨가될 수 있다. 상기 원료들은 배양과정에서 배지에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
한편, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배지의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배지 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다.
본 명세서에서, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 대장균( Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미컴( Corynebacterium glutamicum)의 배양 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양 방법의 예에는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batchculture)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양시 온도는 보통 20℃ 내지 45℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양은 원하는 L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신, L-글루타민, L-라이신, L-아르기닌, L-발린, L-루신, L-이소루신, L-트레오닌, L-히스티딘, L-세린, L-시트룰린과 같은 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생성된 L-아미노산은 배양 배지 중으로 배출되거나, 상기 변이주 내에 포함되어 있을 수 있다.
상기 변이주 또는 변이주를 배양한 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법, 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 L-아미노산을 생산하는 대장균 변이주 또는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주는 모균주에 비해 향상된 L-아미노산의 생산능을 발휘할 수 있으며, 고농도의 L-아미노산을 높은 수율로 생산할 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명에 따른 L-아미노산 생산 대장균 변이주 또는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주, 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산 방법을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실험예 1-1. 유전자 yddG 결실 변이주의 제조
L-아미노산 생산에서 유전자 yddG가 미치는 영향을 확인하기 위해, 균주의 유전자 yddG을 결실시킨 변이주를 제조하였다.
모균주로는 L-트립토판을 생산하는 대장균 W0G 균주(수탁번호: KFCC11660P), L-페닐알라닌을 생산하는 대장균 MWTR42 균주(수탁번호: KFCC10780)를 사용하였고, 실험방법으로는 문헌[One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5]을 참고하여 유전자 yddG 결실 변이주를 제조하였다.
먼저, 유전자 yddG 파쇄를 위한 DNA 단편을 제조하기 위해, 각 모균주의 염색체와 pKD13 플라스미드를 주형으로 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응법(PCR)을 수행하였다. 이때, PCR 조건은 (i) 변성(denaturation)단계: 95℃에서 30초, (ii) 결합(annealing)단계: 58℃에서 30초 및 (iii) 확장(extension)단계: 72℃에서 2분을 총 30회로 수행하였다. 상기 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동 후 원하는 크기의 밴드를 얻었고, 이 밴드의 단편을 이용하여 다시 상기 PCR 조건과 같이 overlap PCR을 수행함으로써 유전자 yddG 파쇄를 위한 하나의 DNA 단편을 제조하였다. 상기 DNA 단편을 각 모균주에 형질전환하였고, 카나마이신이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 여기서 얻어진 콜로니(colony)는 다시 상기 PCR 조건과 같이 PCR을 수행하였다.
프라이머(primer) 염기서열 (5' > 3')
yddG H1F(서열번호 15) CAATGCCGCTACTGTTGTTCCAGCC
yddG H1R(서열번호 16) CAGTGGTGCGTTTTTCTACCGCTAT
yddG H2F(서열번호 17) AATAACTGCCGGGTCTACGGCC
yddG H2R(서열번호 18) AACGTATTTTCTAAACGAATTTTAAACGGCGTC
yddG CF(서열번호 19) CGGAACAGTATGTGCAGGTGTTACGG
yddG CR(서열번호 20) AACAAACCAGTTACAACCACCGCAAC
결과, 각 콜로니에서 유전자 yddG가 결실된 것을 확인하였다.
그리고 대장균 W0G 균주에서 유전자 yddG가 결실된 변이주를 W1G 균주로 명명하고, 대장균 MWTR42 균주에서 유전자 yddG가 결실된 변이주를 MWTR5 균주로 명명하였다.
실험예 1-2. 유전자 yddG 결실 변이주의 L-트립토판, L-페닐알라닌 생산능 확인
W0G 및 W1G 균주의 L-트립토판 생산능, MWTR42 및 MWTR5 균주의 L-페닐알라닌 생산능을 확인하였다.
하기 표 2와 같은 조성의 각각의 배지 10 mL이 담긴 플라스크에 각 균주를 1%씩 접종하여 37℃에서 200 rpm으로 70시간 동안 진탕 배양하였다. 각 배양액을 OD 610nm에서 흡광도를 측정하고 L-트립토판 또는 L-페닐알라닌의 생산량을 비교하였고, 그 결과는 하기 표 3과 같다.
트립토판 생산용 배지 페닐알라닌 생산용 배지
조성 함량 조성 함량
Glucose 80.0 g/L Glucose 80.0 g/L
(NH 4) 2SO 4 20.0 g/L (NH 4) 2SO 4 20.0 g/L
K 2HPO 4 0.8 g/L K 2HPO 4 1.0 g/L
K 2SO 4 0.4 g/L KH 2PO 4 1.0 g/L
MgCl 2 0.8 g/L K 2SO 4 0.4 g/L
Fumaric acid 1.0 g/L MgCl 2 1.0 g/L
Yeast extract 1.0 g/L Fumaric acid 0.5 g/L
(NH 4) 6Mo 7O 24 0.12 ppm Yeast extract 1.0 g/L
H 3BO 3 0.01 ppm Glutamic acid 0.5 g/L
CuSO 4 0.01 ppm CaCl 2 5.00 ppm
MnCl 2 2.00 ppm MnCl 2 2.00 ppm
ZnSO 4 0.01 ppm ZnSO 4 1.00 ppm
CoCl 2 0.10 ppm CoCl 2 0.10 ppm
FeCl 2 10.00 ppm FeCl 2 10.00 ppm
Thiamine_HCl 20.00 ppm Thiamine_HCl 20.00 ppm
L-Tyrosine 200.00 ppm L-Tyrosine 200.00 ppm
L-phenylalanine 300.00 ppm CaCO 3 3 %
CaCO 3 3 % - -
균주 L-트립토판 (g/L) 균주 L-페닐알라닌 (g/L)
W0G 4.21±0.113 MWTR42 21.3±0.115
W1G 2.53±0.132 MWTR5 11.7±0.141
상기 표 3과 같이, 유전자 yddG가 결실된 변이주 (W1G 균주, MWTR5 균주)는 여전히 각각 L-트립토판, L-페닐알라닌을 생산하는 것으로 확인되었다. 즉, 방향족 아미노산의 배출 유전자로 알려진 yddG를 제거하더라도 각 변이주의 L-아미노산 생산능이 유지되는 것으로, yddG 이외에도 아미노산의 배출에 관여하는 유전자가 존재함을 알 수 있었다.
실험예 2-1. 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD 증폭 변이주의 제조
유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD가 각각 삽입된 대장균 변이주를 제조하였다.
모균주로는 L-트립토판을 생산하는 대장균 W0G 균주(수탁번호: KFCC11660P)를 사용하였다.
먼저, W0G 균주를 주형으로 하기 표 4의 프라이머를 사용하여 각 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD를 PCR을 통해 증폭시킨 후 제한효소 SacI, XbaI를 처리하여 준비하였다.
염기서열 분석 결과, yicL 유전자의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열, ydiN 유전자 의 염기서열은 서열번호 2 의 염기서열, ydhK 유전자의 염기서열은 서열번호 3 또는 서열번호 37 의 염기서열, aaeB 유전자의 염기서열은 서열번호 4 의 염기서열, yeeA 유전자의 염기서열은 서열번호 5 의 염기서열, rhtC 유전자의 염기서열은 서열번호 6 의 염기서열, emrD 유전자의 염기서열은 서열번호 7 또는 서열번호 39 의 염기서열로 확인되었다.
벡터 pTrc99A에 제한효소 SacI, XbaI를 처리하여 절단하고, 그 사이에 준비된 각 유전자를 삽입하여 발현 벡터 pTrc99A::yicL, pTrc99A::ydiN, pTrc99A::ydhK, pTrc99A::aaeB, pTrc99A::yeeA, pTrc99A::rhtC, pTrc99A::emrD를 제조하였다. 각 발현 벡터를 W0G 균주에 형질전환시켜 각 유전자가 증폭된 변이주 W0G/pTrc99A::yicL, W0G/pTrc99A::ydiN, W0G/pTrc99A::ydhK, W0G/pTrc99A::aaeB, W0G/pTrc99A::yeeA, W0G/pTrc99A::rhtC, W0G/pTrc99A::emrD를 제조하였다.
프라이머(primer) 염기서열 (5' > 3')
yicL_F(서열번호 21) GCGAGCTCATGGGTTCCACCAGAAAGGG
yicL_R(서열번호 22) GCTCTAGATCACTTATGCCGCGCCGGA
ydiN_F(서열번호 23) GCGAGCTCATGTCTCAAAATAAGGCTTTCAGCA
ydiN_R(서열번호 24) GCTCTAGAGGCCATCAACCCAATCAATT
ydhK_F(서열번호 25) GCGAGCTCATGAACGCATCGTCATGGTCCTTGC
ydhK_R(서열번호 26) GCTCTAGATCACTTATGCCGCGCCGGA
aaeB_F(서열번호 27) GCGAGCTCATGGGTATTTTCTCCATTGCT
aaeB_R(서열번호 28) GCTCTAGATTTTGACTTAACTATCGGTca
yeeA_F(서열번호 29) GCGAGCTCGTGCGTGCCGATAAGTC
yeeA_R(서열번호 30) GCTCTAGATTATTTGCGCAAGGCCCG
rhtC_F(서열번호 31) GCGAGCTCATGTTGATGTTATTTCTCACCGT
rhtC_R(서열번호 32) gctctagaCTGGCATCACCGCGAAATAA
emrD_F(서열번호 33) GCGAGCTCATGAAAAGGCAAAGAAACG
emrD_R(서열번호 34) GCTCTAGACGGTGACGTGCGCTTAAAC
실험예 2-2. 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD 증폭 변이주의 L-트립토판 생산능 확인
W0G에 벡터 pTrc99A만이 삽입된 W0G/pTrc99A 및 변이주 W0G/pTrc99A::yicL, W0G/pTrc99A::ydiN, W0G/pTrc99A::ydhK, W0G/pTrc99A::aaeB, W0G/pTrc99A::yeeA, W0G/pTrc99A::rhtC, W0G/pTrc99A::emrD의 L-트립토판 생산능을 확인하였다.
상기 표 2와 같은 조성의 각각의 배지 10 mL이 담긴 플라스크에 각 균주를 1%씩 접종하여 34℃에서 200 rpm으로 72시간 동안 진탕 배양하였다. 각 배양액을 OD 610nm에서 흡광도를 측정하고 L-트립토판의 생산량을 비교하였고, 그 결과는 하기 표 5와 같다.
균주 L-트립토판 (g/L)
W0G/pTrc99A (대조군) 4.21±0.113
W0G/pTrc99A::yicL 4.83±0.102
W0G/pTrc99A::ydiN 4.86±0.169
W0G/pTrc99A::ydhK 4.88±0.133
W0G/pTrc99A::aaeB 4.91±0.101
W0G/pTrc99A::yeeA 4.95±0.123
W0G/pTrc99A::rhtC 5.02±0.131
W0G/pTrc99A::emrD 5.26±0.156
상기 표 5와 같이, 각 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD가 증폭된 대장균 변이주는 대조군에 비해 L-트립토판 생산능이 증가한 것으로 확인되었다.
실험예 3-1. 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD 증폭 변이주의 제조
유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD가 각각 삽입된 대장균 변이주를 제조하였다.
W0G 균주 대신 L-페닐알라닌을 생산하는 대장균 MWTR42 균주(수탁번호: KFCC10780)를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 발현 벡터를 제조하였다. 각 발현 벡터를 MWTR42 균주에 형질전환시켜 각 유전자가 증폭된 변이주 MWTR42/pTrc99A::yicL, MWTR42/pTrc99A::ydiN, MWTR42/pTrc99A::ydhK, MWTR42/pTrc99A::aaeB, MWTR42/pTrc99A::yeeA, MWTR42/pTrc99A::rhtC, MWTR42/pTrc99A::emrD를 제조하였다.
실험예 3-2. 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD 증폭 변이주의 L-페닐알라닌 생산능 확인
MWTR42에 벡터 pTrc99A만이 삽입된 MWTR42/pTrc99A 및 변이주 MWTR42/pTrc99A::yicL, MWTR42/pTrc99A::ydiN, MWTR42/pTrc99A::ydhK, MWTR42/pTrc99A::aaeB, MWTR42/pTrc99A::yeeA, MWTR42/pTrc99A::rhtC, MWTR42/pTrc99A::emrD의 L-페닐알라닌 생산능을 확인하였다.
상기 실험예 2-2와 동일한 방법으로 L-페닐알라닌의 생산량을 비교하였고, 그 결과는 하기 표 6과 같다.
균주 L-페닐알라닌 (g/L)
MWTR42/pTrc99A (대조군) 21.3±0.115
MWTR42/pTrc99A::yicL 27.1±0.081
MWTR42/pTrc99A::ydiN 27.2±0.165
MWTR42/pTrc99A::ydhK 27.3±0.105
MWTR42/pTrc99A::aaeB 27.0±0.111
MWTR42/pTrc99A::yeeA 27.3±0.103
MWTR42/pTrc99A::rhtC 26.7±0.122
MWTR42/pTrc99A::emrD 27.1±0.085
상기 표 6과 같이, 각 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD가 증폭된 대장균 변이주는 대조군에 비해 L-페닐알라닌 생산능이 증가한 것으로 확인되었다.
실험예 4-1. 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD 증폭 변이주의 제조
유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD가 각각 삽입된 코리네박테리움 글루타미컴 변이주를 제조하였다.
모균주로는 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 DW28G(수탁번호: KTCT13769BP)를 이용하였다.
먼저, 상기 실험예 2-1에서 제조된 발현 벡터 pTrc99A::yicL, pTrc99A::ydiN, pTrc99A::ydhK, pTrc99A::aaeB, pTrc99A::yeeA, pTrc99A::rhtC, pTrc99A::emrD를 주형으로 하기 표 7의 프라이머를 사용하여 각 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD를 PCR을 통해 증폭시킨 후 인산화(5'-phosphorylation) 처리하여 준비하였다. 벡터 pEKO에 제한효소 Eco53KI를 처리하여 절단하고, 그 사이에 준비된 각 유전자를 삽입하여 발현 벡터 pEKO::yicL, pEKO::ydiN, pEKO::ydhK, pEKO::aaeB, pEKO::yeeA, pEKO::rhtC, pEKO::emrD를 제조하였다. 각 발현 벡터를 DW28G 균주에 형질전환시켜 각 유전자가 증폭된 변이주 DW28G/pEKO::yicL, DW28G/pEKO::ydiN, DW28G/pEKO::ydhK, DW28G/pEKO::aaeB, DW28G/pEKO::yeeA, DW28G/pEKO::rhtC, DW28G/pEKO::emrD를 제조하였다.
프라이머(primer) 염기서열 (5' > 3')
primer_F(서열번호 35) gcgccgacatcataacggttctgg
primer_R(서열번호 36) cgcaacgttcaaatccgctcccg
실험예 4-2. 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD 증폭 변이주의 L-트립토판 생산능 확인
DW28G에 벡터 pEKO만이 삽입된 DW28G/pEKO 및 변이주 DW28G/pEKO::yicL, DW28G/pEKO::ydiN, DW28G/pEKO::ydhK, DW28G/pEKO::aaeB, DW28G/pEKO::yeeA, DW28G/pEKO::rhtC, DW28G/pEKO::emrD의 L-트립토판 생산능을 확인하였다.
배지로 하기 표 8의 조성을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실험예 2-2와 동일한 방법으로 L-트립토판의 생산량을 비교하였다. 그 결과는 하기 표 9와 같다.
조성 함량
Cane molasses (glucose) 100.00 g/L
KH 2PO 4 5.00 g/L
K 2HPO 4 5.00 g/L
K 2SO 4 0.40 g/L
MgSO 4 0.25 g/L
(NH 4) 2SO 4 20 g/L
Corn steep liquor 10 g/L
CaCO 3 3 %
균주 L-트립토판 (g/L)
DW28G/pEKO (대조군) 2.64±0.107
DW28G/pEKO::yicL 3.57±0.115
DW28G/pEKO::ydiN 3.05±0.089
DW28G/pEKO::ydhK 3.11±0.095
DW28G/pEKO::aaeB 2.95±0.102
DW28G/pEKO::yeeA 3.21±0.113
DW28G/pEKO::rhtC 3.31±0.091
DW28G/pEKO::emrD 3.45±0.115
상기 표 9와 같이, 각 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD가 증폭된 코리네박테리움 글루타미컴 변이주는 대조군에 비해 L-트립토판 생산능이 증가한 것으로 확인되었다.
결과적으로, 본 발명에서는 아미노산 배출 유전자 yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC, emrD의 과발현을 유도함으로써 모균주에 비해 L-트립토판 또는 L-페닐알라닌의 생산능이 향상된 대장균 변이주 및 코리네박테리움 글루타미컴 변이주를 얻었고, 이러한 변이주를 이용하여 고농도의 L-트립토판 또는 L-페닐알라닌을 높은 수율로 얻을 수 있다는 것을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

  1. yicL, ydiN, ydhK, aaeB, yeeA, rhtC 및 emrD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현하여 L-아미노산 생산능이 향상된 변이주로서, 상기 변이주는 대장균(Escherichia coli) 또는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)인, 변이주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 yicL는 서열번호 1의 염기서열, ydiN는 서열번호 2의 염기서열, ydhK는 서열번호 3 또는 서열번호 37의 염기서열, aaeB는 서열번호 4의 염기서열, yeeA는 서열번호 5의 염기서열, rhtC는 서열번호 6의 염기서열, emrD는 서열번호 7 또는 서열번호 39의 염기서열로 이루어진 것인 변이주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신, L-글루타민, L-라이신, L-아르기닌, L-발린, L-루신, L-이소루신, L-트레오닌, L-히스티딘, L-세린 및 L-시트룰린으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 변이주.
  4. (a) 제1항의 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 변이주 또는 배지로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 L-아미노산의 생산 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신, L-글루타민, L-라이신, L-아르기닌, L-발린, L-루신, L-이소루신, L-트레오닌, L-히스티딘, L-세린 및 L-시트룰린으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 L-아미노산의 생산 방법.
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