KR101023925B1

KR101023925B1 - 에세리키아속 세균을 사용한 ｌ-아미노산의 제조방법

Info

Publication number: KR101023925B1
Application number: KR1020047007796A
Authority: KR
Inventors: 리브시츠비타리아르카디에비쉬; 비투슈키나마리아비아체슬라보브나; 마슈코세르게이블라디미로비쉬; 도로센코베라게오르기에브나; 비르유코바아이리나블라디미로브나; 카타흐키나자나이소시포브나; 스코르크호도바알렉산드라유리에브나; 벨라레바알라발렌티노브나
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2001-11-23
Filing date: 2002-11-21
Publication date: 2011-03-22
Also published as: JP4305184B2; DE60236684D1; WO2003044192A1; CN101838628A; AU2002355022A1; MXPA04004874A; EP1449918B1; PL369471A1; AU2002355022B2; CA2468179C; EP1449918A4; BRPI0214330B1; CA2468179A1; JPWO2003044192A1; KR20050044860A; BR0214330A; EP1449918A1; US7935506B2; US20030157667A1; CN101838628B

Abstract

yddG 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성을 증강시킴으로써 L-아미노산 생산성이 증가된 에세리키아속 세균을 배지중에 배양하고, 생성 및 축적된 L-아미노산을 당해 배지로부터 수거함으로써, L-아미노산, 예를 들어, L-페닐알라닌 또는 L-트립토판을 제조한다.

L-아미노산, L-페닐알라닌, L-트립토판, 에세리키아 콜라이, 형질전환

Description

에세리키아속 세균을 사용한 Ｌ-아미노산의 제조방법{Process for producing L-amino acid using Escherichia}

본 발명은 생명공학에 관한 것으로, 특히 발효에 의한 아미노산, 특히 방향족 아미노산, 예를 들면, L-페닐알라닌 및 L-트립토판의 제조방법, 보다 구체적으로는 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 유래의 유전자에 관한 것이다. 당해 유전자는 L-페닐알라닌 및 L-트립토판 생산성을 개선시키는 데 유용하다.

종래, L-아미노산은 자연계에서 수득된 미생물 균주 또는 이들 균주의 L-아미노산 생산성을 증강시키도록 변형된 변이주를 이용한 발효방법에 의해 공업적으로 생산되어 왔다.

L-아미노산 생산능을 증강시키기 위한 많은 기술이 기재되어 있으며, 예를 들면, 재조합 DNA에 의한 미생물의 형질전환에 의한 것이 있다(예: 미국 특허 제4,278,765호 참조). 이들 기술은 아미노산 생합성에 관여하는 효소의 활성 증가 및/또는 생산되는 L-아미노산에 의한 피드백 억제로부터 목적하는 효소의 탈감작(脫感作)에 근거하고 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-18596호(1981), WO 제95/l6042호 또는 미국 특허 제5,66l,012호 및 제6,040,160호].

한편, L-아미노산 생산주의 생산능은 아미노산 배출 활성의 증강에 의해 개량할 수 있다. L-라이신 배출 유전자(lysE 유전자)의 발현을 증강시킨 코리네박테리움속 세균의 라이신 생산주가 기재되어 있다(WO 제9723597A2호). 또한, L-시스테인, L-시스틴, N-아세틸세린 또는 티아졸리딘 유도체의 분비에 적합한 유출 단백질을 암호화하는 유전자도 개시되어 있다(미국 특허 제5,972,663호).

현재 시점에서, L-아미노산 생산성을 증강시키는, 추정상의 막 단백질을 암호화하는 수개의 에세리키아 콜라이 유전자가 개시되어 있다. rhtB 유전자의 복제수를 증가시킴으로써, 세균은 L-호모세린에 대해 보다 내성으로 되며 L-호모세린, L-트레오닌, L-알라닌, L-발린 및 L-이소류신의 생산성이 증강된다(유럽 공개특허 제994190A2호). rhtC 유전자의 복제수를 증가시킴으로써, 세균은 L-호모세린 및 L-트레오닌에 대해 보다 내성으로 되며, L-호모세린, L-트레오닌 및 L-류신의 생산성이 증강된다(유럽 특허원 제1013765A1호). yahN, yeaS, yfiK 및 yggA 유전자는 복제를 증가시킴으로써, L-글루탐산, L-라이신, L-트레오닌, L-알라닌, L-히스티딘, L-프롤린, L-아르기닌, L-발린 및 L-이소류신의 생산성을 증강시킨다(유럽 공개특허 제1016710A2호).

본 발명자들은 이전에 에세리키아 콜라이 K-12주에 관해서, 최소 배지중의 고농도의 트레오닌 또는 호모세린에 대한 내성과 관련있는 변이 thrR(본 명세서 속에서는 rhtA23이라고 칭한다)을 갖는 돌연변이주를 수득하였다(참조: Astaurova, 0.B. et al., Appl. Biochem. Microbiol., 2l, 611-616, 1985). 이러한 변이는 L-트레오닌(SU 특허 제974817호), 호모세린 및 글루탐산(참조: Astaurova, 0.B. et al., Appl. Biochem. Microbiol., 27, 556-56l, 1991)을 생산하는 에세리키아 콜라이의 각각의 아미노산 생산성을 개선한다.

또한, 본 발명자들은 rhtA 유전자가 글루타민 수송계의 구성 성분을 암호화하는 glnHPQ 오페론에 근접한 에세리키아 콜라이 염색체 위의 18min에 존재하며, rhtA 유전자가 pexB와 ompX 유전자 사이에 있는 ybiF ORF와 동일하다는 것을 밝혔다. 이러한 ORF에 의해 암호화되는 단백질을 발현하는 단위는 rhtA(rht: Resistant to Homoserine and Threonine: 호모세린 및 트레오닌에 대한 내성) 유전자로 명명되었다.

또한, rhtA 유전자의 증폭이 호모세린 및 트레오닌에 대한 내성을 부여한다는 것을 본 발명자들은 발견하였다. rhtA23 돌연변이는 ATG 개시 코돈에 대하여 -1의 위치에서 G에서 A로의 치환이다(참조: ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology 및 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457). SD 서열과 개시 코돈 사이의 스페이서의 뉴클레오타이드 조성, 특히 개시 코돈의 바로 상류의 서열은 mRNA 번역능력에 막대한 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 개시 코돈 전의 3개의 뉴클레오타이드의 성질에 따라 발현 수준의 20배의 변화가 발견되었다(참조: Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMB0 J., 3, 623-629, 1984). 따라서, rhtA23 돌연변이는 rhtA 유전자 발현을 증가시키는 것으로 예측할 수 있다.

rhtA 유전자는 295개 아미노산 잔기로 이루어지고, 분자량 계산치가 31.3kDa인 단백질을 암호화한다. RhtA 서열의 분석으로, 상기 단백질이 10개의 추정상의 막관통(transmembrane) 절편을 함유하는 고소수성 단백질인 것으로 나타난다. 에세리키아속에 속하는 에세리키아 콜라이 K-12주의 뉴클레오타이드 서열의 PSI-BLAST 검색[참조: Science, 277, 1453-1474(1997)]에 의해 RhtA와 상동인 10개 이상의 단백질이 명백해졌다. 이들 중에는 ydeD 및 yddG 유전자에 의해 암호화되는 단백질이 포함된다. 이전에 ydeD 유전자가 시스테인 경로 대사물질의 유출에 관여하는 것으로 나타났다(참조: Dassler et al., Mol. Microbiol., 36, 1101-1112, 2000; 미국 특허 제5,972,663호). yddG 유전자는 추정상의 CDS로서 공지되어 있고, 기능적으로 공지되지 않은 단백질을 암호화하고 있을 가능성이 있다(참조: GenBank accession AE000244 UO0O96의 염기서열내 염기번호 3687 내지 4568).

본 발명의 목적은 L-페닐알라닌 생산주의 생산성을 증강시키고, 이들 균주를 사용한 L-페닐알라닌의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 L-트립토판 생산주의 생산성을 증강시키고, 이들 균주를 사용한 L-트립토판의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적은 RhtA와 상동이고, 막 단백질을 암호화하여 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로에 관여하지는 않지만, 이의 야생형 대립 유전자를 미생물내에서 다중 복제 벡터로 증폭하는 경우 페닐알라닌 및 수개의 아미노산 유사체에 대한 내성이 미생물에 부여되는 yddG 유전자를 동정함으로써 달성되었다. 또한, yddG 유전자의 부가적 복제물을 L-페닐알라닌 생산주의 세포내에 도입하는 경우, L-페닐알라닌 생산성을 증강시킬 수 있다. 또한, yddG 유전자는 L-트립토판산 생산주의 세포내에서 이의 발현을 증강시키는 경우, L-트립토판 생산성을 증강시킬 수 있다. 이와 같이 본 발명은 완성되었다.

본 발명은 하기와 같다:

1) L-아미노산 생산능을 갖는 에세리키아속 세균으로서, 상기 세균의 세포내에서 하기 (A) 또는 (B)에 기재된 단백질의 활성을 증강시킴으로써 상기 세균에 의한 L-아미노산 생산성이 증강된 상기 세균:

(A) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는

(B) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중에서 한개 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 단백질로서, 세균의 L-페닐알라닌 및/또는 아미노산 유사체(예: p-플루오로-페닐알라닌 및 5-플루오로-DL-트립토판 등)에 대한 내성을 증강시키는 활성을 갖는 단백질(이하, 상기 (A) 또는 (B)에 기재된 단백질을 "본 발명의 단백질"이라고 칭하는 경우가 있다).

2) 상기 (A) 또는 (B)에 기재된 단백질의 활성이 당해 단백질을 암호화하는 DNA에 의한 상기 세균의 형질전환에 의해, 또는 상기 세균의 염색체 위의 DNA의 발현 제어 서열의 변화에 의해 증강된 상기 세균.

3) 상기 형질전환이 상기 DNA를 함유하는 다중 복제 벡터에 의해 수행되는 상기 세균.

4) 상기 DNA의 고유의 프로모터가 보다 강력한 프로모터로 치환된 상기 세균.

5) 상기 세균을 배지중에서 배양하여, 생성 및 축적된 L-아미노산을 배지로부터 수거하는 것을 특징으로 하는, L-아미노산의 제조방법.

6) L-아미노산이 L-페닐알라닌인 상기 방법.

7) 상기 세균의 페닐알라닌 생합성에 관여하는 유전자의 발현이 증강된 상기 방법.

8) L-아미노산이 L-트립토판인 상기 방법.

9) 상기 세균의 트립토판 생합성에 관여하는 유전자의 발현이 증강된 상기 방법.

10) 상기한 세균중 하나로서, L-페닐알라닌 생산능을 갖는 세균을 배지에서 배양하는 단계 및 당해 배지에서 L-페닐알라닌을 생성 및 축적시켜 수득된 L-페닐알라닌과 아스파라긴산 또는 이의 유도체로부터 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 합성하는 단계를 포함하는, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르의 제조방법.

11) L-페닐알라닌을 L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르로 에스테르화하는 단계, 당해 L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 아스파라긴산의 유도체로서 N-아실-L-아스파라긴산 무수물과 축합시키는 단계, 이러한 반응 혼합물로부터 N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 분리하는 단계 및 N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 수소화하여 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 상기 방법.

본 발명에서 달리 언급되지 않는 한, 아미노산은 L-배위이다.

L-아미노산의 제조방법은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 등과 같은 본 발명의 단백질의 활성이 증강된 L-페닐알라닌 생산균을 사용한 L-페닐알라닌의 제조를 포함한다. 또한, L-아미노산의 제조방법은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 단백질 등과 같은 본 발명의 단백질의 활성이 증강된 L-트립토판 생산균을 사용한 L-트립토판의 제조를 포함한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 세균은 L-아미노산 생산능을 갖는 에세리키아속 세균으로서, 세균의 세포내에서 본 발명의 단백질의 활성을 증강시킴으로써, 상기 세균에 의한 L-아미노산 생산성이 증강된 세균이다.

본 발명에서 "L-아미노산 생산균"이란 세균을 배지에서 배양하는 경우 상기 L-아미노산을 생성하여 배지에 축적하는 능력을 갖는 세균을 의미한다. L-아미노산 생산능은 상기 세균이 야생주가 갖는 성질로서 유지되거나, 육종에 의해 부여될 수 있다.

본 발명의 세균의 바람직한 양태는 본 발명의 단백질의 활성이 증강된 에세리키아속에 속하는 L-페닐알라닌 생산균이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 세균은 세균의 염색체상 또는 플라스미드 중에서 과잉 발현된 yddG 유전자를 갖는 DNA를 포함하고, L-아미노산, 예를 들면, L-페닐알라닌을 생산하는 증강된 능력을 갖는다.

본 발명의 세균의 또다른 바람직한 양태는 세균의 염색체상 또는 플라스미드 중에서 과잉 발현되는 yddG 유전자를 갖는 DNA를 포함하고, 이들 주를 사용하여 L-아미노산, 예를 들면, L-트립토판을 생산하는 증강된 능력을 갖는다.

본 발명의 단백질로서는 하기의 (A) 또는 (B)에 기재된 것을 포함한다:

(B) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에서 한개 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 단백질로서, 세균의 L-아미노산, 예를 들면, 페닐알라닌, 및/또는 아미노산 유사체, 예를 들면, p-플루오로-페닐알라닌 및 5-플루오로-DL-트립토판 등에 대한 내성을 증강시키는 활성을 갖는 단백질.

"수개의" 아미노산의 수는 단백질의 삼차원 구조중의 아미노산 잔기의 위치 또는 종류에 따라서 상이하다. 이의 수는 단백질 (A)에 대해 2 내지 30개, 바람직하게는 2 내지 15개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개일 수 있다.

"L-페닐알라닌 및/또는 아미노산 유사체에 대한 내성"이란 비변형주 또는 야생형의 세균, 또는 세균의 친주가 증식할 수 없는 농도하에서 L-페닐알라닌 또는 아미노산 유사체를 함유하는 최소 배지상에서 세균이 생육하는 능력, 또는 비변형주 또는 야생형의 세균 또는 세균의 친주보다 L-페닐알라닌 또는 아미노산 유사체를 함유하는 배지상에서 세균이 더 빠르게 생육하는 능력을 의미한다. L-아미노산 유사체는 p-플루오로-페닐알라닌, 5-플루오로-DL-트립토판 등에 의해 예시된다. L-아미노산 또는 아미노산 유사체의 상기 농도는 L-페닐알라닌의 경우에는 일반적으로 10 내지 25mg/ml, 바람직하게는 15 내지 20mg/ml이다. 아미노산 유사체의 상기 농도는 p-플루오로-페닐알라닌의 경우에는 일반적으로 0.1 내지 5.0mg/ml, 바람직하게는 0.5 내지 2.0mg/ml, 5-플루오로-DL-트립토판의 경우에는 일반적으로 0.2 내지 20μg/ml, 바람직하게는 2 내지 5μg/ml이다.

본 발명의 세균은 또한 본 발명의 단백질의 활성이 (A) 또는 (B)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA를 사용한 상기 세균의 형질전환에 의해, 또는 세균의 염색체상의 상기 DNA의 발현 제어 서열의 변형에 의해 증강된 것을 포함한다.

본 발명의 세균의 변형을 위해 사용되는 DNA는 L-아미노산 배출 활성을 갖는 단백질을 암호화할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 DNA는 yddG 유전자에 의해 대표된다. yddG 유전자는, 예를 들면, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 근거한 프라이머를 사용한 PCR에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 DNA는 단백질의 활성을 잃지 않는 한, 단백질 (A)상의 하나 이상의 위치에서 한개 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA를 포함한다. "수개의" 아미노산의 수는 단백질의 삼차원 구조중의 아미노산 잔기의 위치 또는 종류에 따라 상이하지만, 이의 수는 단백질 (A)에 대해 2 내지 30개, 바람직하게는 2 내지 15개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개일 수 있다. (A)에 기재된 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되도록 부위특이적 돌연변이법을 사용하여 (A)에 기재된 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 변형시켜 수득될 수 있다. 이러한 변형된 DNA는 돌연변이를 발생시키는 시약 및 조건에 따른 처리를 사용하는 종래의 방법에 따라 수득될 수 있다. 이러한 처리로는 하이드록실아민을 사용하는 단백질을 암호화하는 DNA의 처리 또는 당해 DNA를 함유하는 세균의 UV 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 아질산과 같은 시약을 사용하는 처리를 들 수 있다.

본 발명의 DNA는 자연계의 다양성에 따라 에세리키아속 세균의 상이한 균주 및 변이주에서 발견될 수 있는 변이체를 포함한다. 이러한 변이체를 암호화하는 DNA는 yddG 유전자 또는 그 유전자의 일부와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하여 L-페닐알라닌 생산성을 증강시키는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 수득될 수 있다. "엄격한 조건"이라는 용어는 본원에서 소위 특이적 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건으로서 언급된다. 예를 들면, 엄격한 조건으로는 높은 상동성을 갖는 DNA, 예를 들면, 서로 70% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 하이브리드화하는 조건을 들 수 있다. 대안으로, 엄격한 조건으로는 서던 하이브리드화에서 세정의 통상적인 조건, 예를 들면, 60℃, 1 ×SSC 및 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1 ×SSC 및 0.1% SDS를 포함하는 조건으로 예시된다. 변이체를 암호화하고, yddG 유전자와 하이브리드화하는 DNA에 대한 프로브로서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 부분 서열이 또한 사용될 수 있다. 이러한 프로브는 프라이머로서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 근거로 하여 제작된 올리고뉴클레오타이드, 및 주형으로서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 단편을 사용하는 PCR에 의해 제작될 수 있다. 약 300bp 길이의 DNA 단편을 프로브로서 사용하는 경우, 하이브리드화의 세정 조건은, 예를 들면, 50℃, 2 ×SSC 및 0.1% SDS를 들 수 있다.

단백질을 암호화하는 DNA에 의한 세균의 형질전환은, 예를 들면, 통상적인 방법에 의해 세균 세포내로 DNA를 도입하여, 본 발명의 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시켜 세균 세포에서의 단백질 활성을 증강시키는 것을 의미한다.

유전자 발현의 증강방법으로서는 유전자 복제수의 증가를 포함한다. 에세리키아속 세균에서 기능할 수 있는 벡터내로의 유전자 도입이 상기 유전자의 복제수를 증가시킨다. 이러한 목적을 위해, 다중 복제 벡터가 바람직하게 사용될 수 있다. 다중 복제 벡터의 예로는 pBR322, pUC19, pBluescriptKS+, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b 등을 들 수 있다.

또한, 유전자 발현의 증강은, 예를 들면, 상동 재조합법 등에 의한 세균 염색체내로 유전자의 다중 복제물을 도입함으로써 달성될 수 있다.

2개 이상의 유전자의 발현이 증강되는 경우, 각 유전자는 동일 플라스미드상에 함께 함유되거나, 상이한 플라스미드상에 따로따로 함유될 수 있다. 또한, 각 유전자중 한개가 염색체상에 함유되고, 다른 유전자가 플라스미드상에 함유될 수 있다.

한편, 유전자 발현의 증강은 고유의 프로모터 대신에 보다 강력한 프로모터의 제어하에 본 발명의 DNA를 위치시킴으로써 달성될 수 있다. 프로모터의 강도는 RNA 합성 개시의 작용 빈도에 의해 정의된다. 프로모터의 강도의 평가법 및 강력한 프로모터의 예는 문헌(참조: Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. Promotors in Esherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994) 등에 기재되어 있다. 예를 들면, λ파지의 P_L 프로모터가 강력한 구성적(constitutive) 프로모터로서 공지되어 있다. 기타 lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터 등이 강력한 프로모터로서 공지되어 있다. 강력한 프로모터의 사용은 유전자 복제의 증폭과 조합될 수 있다.

염색체 DNA의 제작, 하이브리드화, PCR, 플라스미드 DNA의 제작, DNA의 분해 및 연결, 형질전환, 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드의 선택 등의 방법은 당해 기술분야의 숙련가에게 익히 공지된 일반적 방법일 수 있다. 이들 방법은 문헌(참조: Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)) 등에 기재되어 있다.

본 발명의 세균은 L-아미노산을 생산하는 능력을 본래부터 갖는 에세리키아속 세균내로 상기한 DNA를 도입함으로써 수득된다. 대안으로, 본 발명의 세균은 상기한 DNA를 함유하는 에세리키아속 세균에 L-아미노산을 생산하는 능력을 부여함으로써 수득된다.

에세리키아속 세균은 L-아미노산 생산능을 갖거나 부여될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 에세리키아속 세균으로는 에세리키아 콜라이를 들 수 있다.

본 발명의 단백질의 활성을 증강시키는 친주로서, 에세리키아속에 속하는 페닐알라닌 생산균, 예를 들면, 에세리키아 콜라이 AJ12739(tyrA::Tn10, tyrR)(VKPM B-8197), pheA34 유전자를 함유하는 HW1089(ATCC 수탁번호 55371)(미국 특허 제5,354,672호), 변이주 MWEC101-b(KR8903681), NRRL B-1214l, NRRL B-12145, NRRL B-12146 및 NRRL B-12147(미국 특허 제4,407,952호) 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질의 활성을 증강시키는 친주로서, 에세리키아속에 속하는 페닐알라닌 생산균, 예를 들면, 에세리키아 콜라이 K-12[W3110 (tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566), 에세리키아 콜라이 K-12[W3110 (tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659), 에세리키아 콜라이 K-12[W3110 (tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662) 및 AJ 12604로서 명명된 에세리키아 콜라이 K-12[W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB](FERM BP-3579) 등도 사용될 수 있다(유럽 특허 제488424B1호).

본 발명의 단백질의 활성을 증강시키는 친주로서, 에세리키아속에 속하는 트립토판 생산균, 예를 들면, 변이형 trpS 유전자에 의해 암호화되고, 트립토파닐-tRNA 합성효소가 결손된 에세리키아 콜라이 JP4735/pMU3028(DSMl0122) 및 JP6015/pMU91(DSM10123)(미국 특허 제5,756,345호); 세린에 의한 피드백 억제가 해제된 serA 대립유전자를 갖는 에세리키아 콜라이 SV164(pGH5)(미국 특허 제6,180,373호); 트립토파나제 효소가 결손된 에세리키아 콜라이 AGX17(pGX44)(NRRL B-12263) 및 AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(미국 특허 제4,37l,614호); 포스포에놀피루브산 생산능이 증강된 에세리키아 콜라이 AGX17/pGX50, pACKG4-pps(유럽 특허 제97/08333호, 미국 특허 제6,319,696호) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배지에서 배양하여 배지중에 L-아미노산을 생성 및 축적시키는 단계 및 배지로부터 L-아미노산을 수거하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 제조방법을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배지에서 배양하여 배지중에 L-페닐알라닌을 생성 및 축적시키는 단계 및 배지로부터 L-페닐알라닌을 수거하는 단계를 포함하는, L-페닐알라닌의 제조방법을 포함한다. 또한, 본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배지에서 배양하여, 배지중에 L-트립토판을 생성 및 축적시키는 단계 및 배지로부터 L-트립토판을 수거하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 제조방법을 포함한다.

본 발명에서, L-아미노산, 예를 들면, L-페닐알라닌 및 L-트립토판의 배지로부터의 배양, 수거 및 정제 등은 미생물을 사용하여 아미노산을 생산하는 통상적인 발효법과 유사한 방법으로 실시될 수 있다. 배양용으로 사용되는 배지는 배지가 탄소원, 질소원, 무기질 및 필요한 경우 미생물 생육에 요구되는 적량의 영양소를 함유하는 한, 합성배지 또는 천연배지일 수 있다. 탄소원으로는 각종 탄수화물, 예를 들면, 글루코스 및 슈크로스, 및 각종 유기산을 들 수 있다. 사용되는 미생물의 동화 방식에 의해 알코올, 예를 들면, 에탄올 및 글리세롤이 사용될 수 있다. 질소원으로는 각종 암모늄염(예: 암모니아 및 황산암모늄), 기타 질소 화합물(예: 아민), 천연 질소원(예: 펩톤), 대두 가수분해물 및 분해된 발효 미생물이 사용된다. 무기질로는 인산1칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간 및 염화칼슘 등이 사용된다. 몇가지 부가적 영양소가 필요한 경우에는 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 미생물이 생육을 위해 티로신을 필요로 하는 경우(티로신 영양요구주), 충분량의 티로신이 배양용 배지에 첨가될 수 있다.

바람직하게는 호기성 조건하에서, 예를 들면, 진탕배양 및 통기 교반배양으로 20 내지 40℃, 바람직하게는 37 내지 40℃의 온도에서 배양된다. 배양의 pH는 통상적으로는 5 내지 9, 바람직하게는 6.5 내지 7.2이다. 배양의 pH는 암모니아, 탄산칼슘, 각종 산, 각종 염기 및 완충액을 사용하여 조절될 수 있다. 통상적으로 1 내지 5일의 배양에 의해 액체 배지중에 목적하는 L-아미노산이 축적된다.

배양후, 고체, 예를 들면, 세포를 원심분리 또는 막 여과법에 의해 액체 배지로부터 제거한 다음, 목적하는 L-아미노산을 이온교환, 농축 및 결정화법 등의 통상적인 방법에 의해 수거 및 정제할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 페닐알라닌은, 예를 들면, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르("아스파르탐"으로도 나타냄)의 제조에 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 L-페닐알라닌을 원료로서 사용하는 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르의 제조방법을 포함한다. 본 방법은 상기한 본 발명의 방법에 따라 제조된 L-페닐알라닌 및 아스파라긴산 또는 이의 유도체로부터 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 합성하는 단계를 포함한다. 저급 알킬에스테르로는 메틸에스테르, 에틸에스테르 및 프로필에스테르 등을 들 수 있다.

본 발명의 방법에서, L-페닐알라닌 및 아스파라긴산 또는 이의 유도체로부터 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 합성하는 방법은 특별히 제한되지 않고, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르의 합성에 L-페닐알라닌 또는 이의 유도체가 사용되는 한 임의의 통상적인 방법이 적용될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르는 하기의 방법에 의해 제조될 수 있다(미국 특허 제3,786,039호). L-페닐알라닌을 L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르로 에스테르화한다. 이러한 L-페닐알라닌 알킬에스테르를, β-카복실 그룹이 보호되고 α-카복실 그룹이 에스테르화되어 활성화된 L-아스파라긴산의 유도체와 반응시킨다. 상기 유도체로는 N-포르밀-, N-카보벤족시- 또는 N-p-메톡시카보벤족시-L-아스파라긴산 무수물과 같은 N-아실-L-아스파라긴산 무수물을 포함한다. 이러한 축합반응에 의해, N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌과 N-아실-β-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 혼합물이 수득된다. 이러한 축합반응을 37℃에서의 산해리 상수가 10^-4이하인 유기산의 존재하에 실시하면 β-형에 대한 α-형의 비율이 상승한다(참조: 일본 공개특허공보 제(소)51-113841호). 이어서, N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌을 혼합물로부터 분리한 후, 수소화하여 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌을 수득한다.

도 1은 제작된 yddG 유전자의 염색체 상류영역의 구조를 도시한 것이다.

본 발명을 실시예를 참조로 보다 구체적으로 설명한다.

실시예 1: 에세리키아 콜라이 유래의 yddG 유전자의 클로닝

에세리키아 콜라이 K-12주의 전체 뉴클레오타이드 서열은 이미 결정되어 있다(참조: Science, 277, 1453-1474, 1997). PSI-BLAST 검색에 의해 10개 이상의 rhtA 파라로그(paralogue)(예: yddG 유전자)가 에세리키아 콜라이 K-12의 게놈에 존재하는 것으로 나타났다. yddG 유전자는 공지되지 않은 기능의 막관통 단백질을 암호화한다.

보고되어 있는 뉴클레오타이드 서열을 근거로 하여, 서열번호 3(프라이머 1) 및 4(프라이머 2)에 기재된 프라이머를 합성하였다. 프라이머 1은 yddG 유전자의 종결 코돈의 하류 91 내지 114bp의 서열과 상보적인 서열이며, 이의 5'-말단에는 제한효소 BamHI 인식부위가 도입되어 있다. 프라이머 2는 yddG 유전자의 개시 코돈의 상류 224 내지 200bp의 서열과 상보적인 서열이며, 이의 5'-말단에는 제한효소 SalI 인식부위가 도입되어 있다.

통상적인 방법에 의해 에세리키아 콜라이 TG1주의 염색체 DNA를 제작하였다. 하기 조건하에서 "퍼킨엘머(Perkin Elmer) GeneAmp PCR 시스템 2400"으로 PCR을 실행하였다. Taq 폴리머라제(Fermentas사)에 의해 95℃에서 40초, 47℃에서 40초, 72℃에서 40초를 30회 반복하였다.

그 자체의 프로모터를 갖는 yddG 유전자를 함유하는 수득된 PCR 단편을 BamHI 및 SalI 제한효소로 처리하고, 동일 효소로 미리 처리한 다중 복제 벡터 pUC19 또는 pAYCTER3에 삽입하였다. 따라서, 각각 플라스미드 pYDDG1 및 pYDDG2를 수득하였다. pAYCTER3 벡터는 플라스미드 RSF1010을 기본으로 하여 제작된 적절한 복제수로서 대단히 안정적인 벡터인 pAYC32(참조: Christoserdov A.Y., Tsygankov Y.D, Broad-host range vectors derived from a RSF 101O Tnl plasmid, Plasmid, 1986, v.16, pp. 161-167)의 유도체이다.

아래와 같이 pUC19 플라스미드 유래의 폴리링커 및 강력한 터미네이터 rrnB를 pAYC32 플라스미드내로 그 자신의 프로모터 대신에 도입함으로써 pAYCTER3 벡터를 수득하였다. 먼저, 서열번호 5 및 6에 기재된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 pUCl9 플라스미드 유래의 폴리링커를 수득하였다. 수득된 PCR 생성물을 EcoRI 및 BglII 제한효소로 처리하였다. 서열번호 7 및 8에 기재된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 터미네이터 rrnB도 수득하였다. 수득된 PCR 생성물을 BglII 및 BclI 제한효소로 처리하였다. 이어서, 이들 2개의 DNA 단편을 EcoRI 및 BclI 제한효소로 미리 처리한 pAYC32 플라스미드내로 연결하였다. 이와 같이 pAYCTER3 플라스미드를 수득하였다.

실시예 2: 아미노산 및 아미노산 유사체에 대한 에세리키아 콜라이 TG1주의 내성에 미치는 yddG 유전자 증폭의 효과

pYDDG1 및 pYDDG2 플라스미드 및 pUC19 및 pAYCTER3 벡터를 에세리키아 콜라이 TG1주에 도입하였다. 이와 같이 TGl(pYDDG1)주, TG1(pYDDG2)주, TG1(pUC19)주 및 TGl(pAYCTER3)주를 수득하였다.

이어서, 이들 균주에 관해서 이들 균주의 아미노산 및 아미노산 유사체의 존재하에 생육하는 능력을, 농도 구배의 억제제를 함유하는 M9 글루코스 최소 한천 플레이트상에서 측정하였다. 최소 배지(플라스미드를 갖는 균주에 대하여 10Oμg/ml의 암피실린을 첨가)에서 밤새 생육시켜 배양된 10⁶ 내지 10⁷개의 세포를 플레이트에 도말하였다. 37℃에서 44시간 동안 항온처리한 다음, 생육을 평가하였다. 결과를 표 1에 기재한다.

기질	농도 mg/ml	44시간후의 증식*
기질	농도 mg/ml	TG1 (pUC19)**	TG1 (pYDDG1)	TG1 (pYDDG2)
-	-	+	+	+
L-페닐알라닌	20.0	-	+	±
p-플루오로-DL-페닐알라닌	1.0	-	+	+
p-플루오로-DL-페닐알라닌	2.0	-	+	-
5-플루오로-DL-트립토판	0.0005	-	+	n.d.

* +: 양호한 생육, ±: 불충분한 생육, -: 생육되지 않음, n.d.: 측정되지 않음

** pAYCTER3 벡터를 함유하는 TG1주에 있어서, 동일 결과가 수득되었다.

실시예 3: 페닐알라닌 생성에 미치는 yddG 유전자 증폭의 효과

yddG 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용하는 형질전환을 위한 친주로서, 페닐알라닌 생산 에세리키아 콜라이 AJ12739주를 사용하였다. AJ12739주는 2001년 11월 6일부로 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리알 마이크로오가니즘즈(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia, 113545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)에 수탁번호 VKPM B-8197로 기탁되어 있다.

페닐알라닌 생산균 AJ12739주를 pYDDG2 플라스미드 또는 pAYCTER3 벡터로 형질전환시켜, AJ12739/pYDDG2 및 AJ12739/pAYCTER3주를 수득하였다. 이들 균주를 각각, 100mg/l 암피실린을 함유하는 영양 브로스(broth) 속에서 37℃에서 18시간 동안 배양하여 수득된 배양액 0.3ml를, 20 ×200mm의 시험관내에 100mg/l의 암피실린을 함유하는 발효 배지 3ml에 접종하여, 회전 진탕기를 사용하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양후, 배지내 페닐알라닌의 축적량을 TLC에 의해 측정하였다. 형광 지시약을 함유하지 않은 Sorbfi1 실리카겔을 O.11mm층으로 피복한 10 ×15cm의 TLC 플레이트(Stock Company Sorbpolymer사, Krasnodar, Russia)를 사용하였다. Sorbfil 플레이트를 이동상으로서 프로판-2-올:아세트산에틸:25% 암모니아수:물 = 40:40:7:16(v/v)을 사용하여 전개시켰다. 닌하이드린의 아세톤 용액(2%)을 가시화 시약으로 사용하였다.

발효 배지의 조성(g/l)

글루코스 40.O

(NH₄)₂SO₄ 16.0

K₂HPO₄ 0.1

MgSO₄·7H₂0 1.0

FeSO₄·7H₂0 0.01

MnSO₄·5H₂0 0.01

티아민-HCl 0.0002

효모 추출물 2.0

티로신 0.125

CaCO₃ 2O.O

글루코스 및 황산마그네슘을 따로따로 멸균시킨다. CaCO₃를 180℃에서 2시간 동안 건열 멸균시킨다. pH를 7.0으로 조절한다. 멸균후, 항생 물질을 배지에 첨가한다. 결과를 표 2에 기재한다.

이. 콜라이 균주	OD₆₀₀	페닐알라닌 g/l
AJ12739(pAYCTER3)	7.0	1.5
AJ12739(pYDDG2)	7.8	1.9

표 2로부터 yddG 유전자 증폭에 의해 AJ12739주의 페닐알라닌 생산성이 개선된 것을 알 수 있다.

실시예 4: 에세리키아 콜라이 염색체에서 P_L 프로모터 및 SD_lacz를 갖는 하이브리드 제어인자에 의한 yddG 유전자의 고유의 상류영역의 치환

yddG 유전자 발현을 증강하기 위해, Datsenko K.A. 및 Wanner B.L.에 의해 기재되어 있고(참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645, 2000), 또한 "Red-driven 통합(Red-driven integration)"이라고 불리는 방법에 의해 에세리키아 콜라이 유래의 lacZ 유전자의 샤인 달가노(Shine-Dalgarno) 서열(SD 서열)에 연결한 λ 파지의 초기 P_L 프로모터 영역(참조: Giladi et al., J. Mol. Biol., 260, 484-49l, 1996)을 고유의 영역 대신에 에세리키아 콜라이 BW25113주의 염색체의 yddG 암호화 영역 상류에 통합시켰다. 또한, 인공 DNA 단편은 클로람페니콜 내성 유전자(Cm^R)를 함유하였다(도 1). yddG 유전자의 상류에 위치하는 치환된 고유 영역의 뉴클레오타이드 서열을 서열목록에 기재한다(서열번호 9).

세균 염색체의 상응하는 영역내로 통합된 상기한 인공 DNA 단편의 제작을 몇 단계로 실시하였다. 제1 단계에서, PCR에 의해 BglII 제한부위를 "상류" 영역에, P_L 프로모터 및 yddG 유전자의 ATG-개시 코돈에 직접 연결된 에세리키아 콜라이 유래의 lacZ 유전자의 SD 서열을 "하류" 영역에 함유하는 DNA 단편을 수득하였다. λ DNA(#SD001l, "Fermentas"사, Lithuania)를 PCR의 주형으로서 사용하였다. PCR은 프라이머 P1(서열번호 10) 및 P2(서열번호 11)를 사용하여 실시하였다. 프라이머 P1은 BglII 제한부위를 함유한다. 프라이머 P2는 λ DNA 서열, XbaI 제한부위, 에세리키아 콜라이 유래의 lacZ 유전자의 SD 서열 및 yddG 판독 프레임 유래의 36개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 세균 염색체내로 당해 단편의 추가의 Red-driven 통합을 위해 yddG 유전자 유래의 서열을 프라이머 P2에 도입하였다.

모든 PCR에서 증폭장치(Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR System)를 사용하여 실시하였다. 총 용적 10Oμl의 반응 혼합액은 반응 혼합액중 최종 농도 2mM이 되도록 MgCl₂를 첨가한 10μl의 10 ×PCR 완충액("Fermentas"사, Lithuania), dNTP 각각 200μl, 개발한 프라이머 각각 400nM 및 Taq 폴리머라제 2u("Fermentas"사, Lithuania)로 이루어져 있다. 목적하는 DNA 단편을 0.2ng로서 계산하고, 추가의 PCR-driven 증폭을 위한 주형 DNA량을 반응 혼합액에 첨가하였다. PCR의 온도 조건은 다음과 같았다. 95℃, 5분의 초기 DNA 변성후, 95℃, 30초의 변성, 50℃, 30초의 어닐링, 72℃, 30초의 신장을 30회 및 72℃, 5분의 최종 중합화를 실시하였다.

병행하여, 본 DNA 단편 제작의 제2 단계를 실시하였다. 주형으로서 시판하는 플라스미드 pACYC184(GenBank/EMBL 수탁번호 X06403, "Fermentas"사, Lithuania) 및 프라이머 P3(서열번호 12) 및 P4(서열번호 13)를 사용하여, PCR에 의해 Cm^R 유전자를 증폭시켰다. 프라이머 P3은 P_L 프로모터를 함유하는 먼저 수득된 DNA 단편과 추가로 결합시키기 위해 사용된 BglII-제한부위를 함유한다. 프로모터 P4는 세균 염색체내로 당해 단편의 추가의 Red-driven 통합에 필요한 에세리키아 콜라이 유래의 yddG 유전자의 상류에 위치하는 36개의 뉴클레오타이드를 함유한다.

수득된 2개의 DNA 단편을 BglII 제한 엔도뉴클레아제로 처리한 다음, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결처리하였다(참조: Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).

프라이머 P2 및 P4를 사용하는 PCR에 의해 연결 생성물을 증폭시켰다. 반응 혼합액 중에 연결 생성물 2ng을 함유하고, 신장 시간을 2분 이하로 연장시킨 이외에는 상기한 바와 같이 PCR을 실시하였다. 제작된 yddG 유전자 상류 DNA 영역의 구조를 도 1에 도시한다. 제작된 DNA 영역의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 14에 기재한다.

에탄올 침전에 의해 정제한 수득된 DNA 단편을 전기천공 및 에세리키아 콜라이 BW25113주의 세균 염색체내로의 Red-driven 통합에 사용하였다. Red-driven 통합 시스템을 담당하는 λ파지 유래 유전자의 공여체로서 온도 감수성 레플리콘을 갖는 재조합 플라스미드 pKD46(참조: Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645, 2000)을 사용하였다.

암피실린 (100μg/ml)을 첨가한 LB 액체 배지에서 30℃에서 밤새 BW25113(pKD46)의 세포를 생육시킨 후, 암피실린(100μg/ml) 및 L-아라비노스(10mM)(플라스미드가 암호화하는 Red-driven 통합 시스템의 유전자를 유도하기 위해 아라비노스를 사용한다)를 첨가한 SOC 배지(효모 추출물 5g/l, NaCl 0.5g/l, 트립톤 20g/l, KCl 2.5mM, MgCl₂ 1OmM)로써 1:100 희석하고, 세균 배양액의 600nm의 광학 밀도가 OD값이 0.4 내지 0.7에 도달할 때까지 30℃에서 생육시켰다. 세균 배양액 10ml에서 생육한 세포를 빙냉한 탈이온수로 3회 세정한 다음, 100μl의 물에서 현탁하였다. 탈이온수 중에 용해시킨 DNA 단편(10ng) 10μl를 세포 현탁액에 첨가하였다. 제품 취급 설명서에 따라 전기천공("Bio-Rad"사, USA)(No. 165-2098, version 2-89)에 의해 전기천공을 실시하였다. 전기 쇼크를 준 세포를 1ml의 SOC에 첨가하여, 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음, 클로람페니콜 25μg/ml를 함유하는 L 한천 배지상에 도말하였다. yddG 유전자 상류의 Cm^R 마커의 존재를 프라이머 P4(서열번호 13) 및 P5(서열번호 15)를 사용하는 PCR에 의해 24시간 이내에 생육한 콜로니에 관해서 시험하였다. 이 목적을 위하여 새롭게 분리한 콜로니를 20μl의 물에 현탁한 다음, 1μl를 PCR에 사용하였다. PCR의 조건은 다음과 같다. 95℃, 10분 초기 DNA 변성후, 95℃, 30초 변성, 50℃, 30초의 어닐링, 72℃, 50초의 신장을 30회 및 72℃, 5분의 최종 중합화를 실시하였다. 시험된 몇개의 Cm^R 콜로니는 필요한 2172 뉴클레오타이드의 DNA 단편을 함유하였다.

실시예 5: 트립토판 생산에 미치는 증강된 yddG 유전자 발현의 효과

공지된 트립토판 생산 에세리키아 콜라이 SV164(pGH5)주를 트립토판 생산에 미치는 증강된 yddG 유전자 발현의 효과를 평가하기 위한 친주로서 사용하였다. SV164(pGH5)주에 관해서는 미국 특허 제6,180,373호 또는 유럽 특허 제0662143호에 상세히 기재되어 있다.

트립토판 생산에 미치는 강력한 구성 P_L 프로모터의 제어하에 증강된 yddG 유전자 발현의 효과를 시험하기 위해 에세리키아 콜라이 BW25113주의 염색체 유래의 DNA 단편을 트립토판 생산 에세리키아 콜라이 SV164(pGH5)주에 P1 형질도입(참조: Miller, J.H.(1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)에 의해 이입하며, SV164 P_L-yddG(pGH5)를 수득하였다.

SV164(pGH5) 및 SV164 P_L-yddG(pGH5)의 모든 균주를 20mg/l의 테트라사이클린(pGH5 플라스미드의 마커)으로 보충된 영양 브로스 3ml속에서 37℃에서 18시간 동안 배양하여 수득된 배양액 0.3ml를, 20 ×200mm의 시험관중에 테트라사이클린(20mg/l)을 함유하는 발효 배지 3ml에 접종하여, 회전 진탕기를 사용하여 250rpm으로 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양후, 배지중의 트레오닌의 축적량을 TLC에 의해 측정하였다. Sorbfil 플레이트를 이동상으로서 프로판-2-올:아세톤:물:25% 암모니아수 = 25:25:7:6(v/v)을 사용하여 전개시켰다. 닌하이드린의 아세톤 용액(2%)을 가시화 시약으로서 사용하였다. 발효 배지의 조성을 표 3에 기재한다.

배양후, 배지중에 축적된 트립토판의 양을 실시예 3에 기재된 바와 같이 TLC에 의해 측정하였다. 수득된 결과를 표 4에 기재한다.

표 4로부터 증강된 yddG 유전자 발현에 의해 SV164(pGH5)주의 트립토판 생산성이 개량된 것을 알 수 있다.

본 발명에 따라 L-아미노산, 예를 들면, L-페닐알라닌 및 L-트립토판의 생산성이 향상된 에세리키아속 세균 및 당해 세균을 이용한 L-아미노산의 제조법이 제공된다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> PROCESS FOR PRODUCING L-AMINO ACID USING ESCHERICHIA <130> B890SMOP1411 <150> RU 2001131571 <151> 2001-11-23 <150> RU 2002121670 <151> 2002-08-14 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 882 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgacacgac aaaaagcaac gctcataggg ctgatagcga tcgtcctgtg gagcacgatg 60 gtaggattga ttcgcggtgt cagtgagggg ctcggcccgg tcggcggcgc agctgctatc 120 tattcattaa gcgggctgct gttaatcttc acggttggat ttccgcgtat tcggcaaatc 180 ccgaaaggct atttactcgc cgggagtctg ttattcgtca gctatgaaat ctgtctggcg 240 ctttccttag ggtatgcggc gacccatcat caggcgattg aagtgggtat ggtgaactat 300 ctgtggccca gcctgacaat tctctttgcc attctgttta atggtcagaa aaccaactgg 360 ttgattgtac ctggattatt attagccctc gtcggcgtct gttgggtgtt aggcggtgac 420 aatgggttac attatgatga aatcatcaat aatatcacca ccagcccatt gagttatttc 480 ctggcgttca ttggtgcgtt tatctgggca gcctattgca cagtaacgaa taaatacgca 540 cgcggattta atggaattac cgtttttgtc ctgctaacgg gagcaagtct gtgggtttac 600 tattttctta cgccacaacc agaaatgata 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Asn Gly Leu His 130 135 140 Tyr Asp Glu Ile Ile Asn Asn Ile Thr Thr Ser Pro Leu Ser Tyr Phe 145 150 155 160 Leu Ala Phe Ile Gly Ala Phe Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr 165 170 175 Asn Lys Tyr Ala Arg Gly Phe Asn Gly Ile Thr Val Phe Val Leu Leu 180 185 190 Thr Gly Ala Ser Leu Trp Val Tyr Tyr Phe Leu Thr Pro Gln Pro Glu 195 200 205 Met Ile Phe Ser Thr Pro Val Met Ile Lys Leu Ile Ser Ala Ala Phe 210 215 220 Thr Leu Gly Phe Ala Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly 225 230 235 240 Asn Val Thr Ile Met Ala Val Gly Ser Tyr Phe Thr Pro Val Leu Ser 245 250 255 Ser Ala Leu Ala Ala Val Leu Leu Ser Ala Pro Leu Ser Phe Ser Phe 260 265 270 Trp Gln Gly Ala Leu Met Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Cys Trp Leu 275 280 285 Ala Thr Arg Arg Gly 290 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 tgatcggatc cgaaatgaga tataa 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 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Sequence: primer <400> 10 aaatcagatc ttcagaattc tcacctacc 29 <210> 11 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 11 tatcagccct atgagcgttg ctttttgtcg tgtcatagct gtttccttct agacggccaa 60 tgcttcgta 69 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 12 tagcgaagat ctctgatgtc cggcggtgct tttg 34 <210> 13 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 13 cgccttcgca aattgaccta cctcaatagc ggtagattac gccccgccct gccactc 57 <210> 14 <211> 1362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Cm-resistance gene, PL promoter and SD sequence from lacZ gene <400> 14 cgccttcgca aattgaccta cctcaatagc ggtagattac gccccgccct gccactcatc 60 gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac agacggcatg 120 atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat 180 ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa 240 actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata 300 ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa 360 atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt 420 gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa 480 ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg 540 cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata 600 ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat 660 atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa 720 tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga 780 acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt 840 atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta 900 ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttactg atttagtgta tgatggtgtt 960 tttgaggtgc tccagtggct tctgtttcta tcagctgtcc ctcctgttca gctactgacg 1020 gggtggtgcg taacggcaaa agcaccgccg gacatcagag atcttcacct accaaacaat 1080 gcccccctgc aaaaaataaa ttcatataaa aaacatacag ataaccatct gcggtgataa 1140 attatctctg gcggtgttga cataaatacc actggcggtg atactgagca catcagcagg 1200 acgcactgac caccatgaag gtgacgctct taaaaattaa gccctgaaga agggcagcat 1260 tcaaagcaga aggctttggg gtgtgtgata cgaaacgaag cattggccgt ctagaaggaa 1320 acagctatga cacgacaaaa agcaacgctc atagggctga ta 1362 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 15 ttaaccacga cgtgtcg 17

Claims

L-페닐알라닌 및 L-트립토판으로부터 선택된 L-아미노산 생산능을 갖는 에세리키아속 세균의 세포내에서 하기 (A) 또는 (B)에 기재된 단백질의 활성을, 당해 단백질을 암호화하는 DNA에 의한 상기 세균의 형질전환에 의해, 또는 상기 세균의 염색체 위의 상기 DNA를 강력한 프로모터의 제어하에 둠으로써 증강시켜, 상기 세균에 의해 상기 L-아미노산 생산성이 증강된, L-페닐알라닌 및 L-트립토판으로부터 선택된 L-아미노산 생산능을 갖는 에세리키아속 세균:

(A) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는

(B) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중에서 한개 내지 5개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하고, L-페닐알라닌; p-플루오로-DL-페닐알라닌 및 5-플루오로-DL-트립토판으로부터 선택된 아미노산 유사체; 또는 이들 모두에 대한 세균의 내성을 증강시키는 활성을 갖는 단백질.
삭제
제1항에 있어서, 상기 형질전환이 DNA를 함유하는 다중 복제 벡터에 의해 이루어지거나, 또는 상기 세균 염색체로 유전자의 다중 복제 도입에 의해 이루어지는 세균.
제1항에 있어서, DNA의 고유의 프로모터가 보다 강력한 프로모터로 치환된 세균.
제1항, 제3항 및 제4항 중의 어느 한 항에 따르는 세균을 배지중에서 배양하고, 당해 배지중에 생성 및 축적된, L-페닐알라닌 및 L-트립토판으로부터 선택된 L-아미노산을 배지로부터 수거하는 것을 특징으로 하는, L-페닐알라닌 및 L-트립토판으로부터 선택된 L-아미노산의 제조방법.
제5항에 있어서, L-아미노산이 L-페닐알라닌인 방법.
제6항에 있어서, 상기 세균의 페닐알라닌 생합성에 관여하는 유전자의 발현이 증강된 방법.
제5항에 있어서, L-아미노산이 L-트립토판인 방법.
제8항에 있어서, 상기 세균의 트립토판 생합성에 관여하는 유전자의 발현이 증강된 방법.
제1항, 제3항 및 제4항 중의 어느 한 항에 따르는 세균으로서, L-페닐알라닌 생산능을 갖는 세균을 배지에서 배양하는 단계 및 당해 배지중에 L-페닐알라닌을 생성 및 축적시켜 수득된 L-페닐알라닌과 아스파라긴산 또는 이의 유도체로부터 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 합성하는 단계를 포함하는, α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르의 제조방법.
제10항에 있어서, L-페닐알라닌을 L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르로 에스테르화하는 단계, 당해 L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 아스파라긴산의 유도체로서 N-아실-L-아스파라긴산 무수물과 축합시키는 단계, 이러한 반응 혼합물로부터 N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 분리하는 단계 및 N-아실-α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 수소화하여 α-L-아스파르틸-L-페닐알라닌의 저급 알킬에스테르를 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.