SU974817A1 - Способ получени L-треонина - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА, предусматривающий приготовление посевного материала путем выращивани  продуцирующих его микроорганизмов вида Escherichia coli в жидкой среде в присутствии гидролизата или автолизата белоксодержащего субстрата и пенициллина , введение посевного материала в ферментативную среду, содержащую источники Углерода, азота и минеральные соли, ферментацию в глубинных услови х с последующей обработкой культуральной жидкости и выделение.м целевого продукта, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода треонина, снижени  продолжительности ферментации при одновременном уменьшении расхода сырь , при приготовлении посевного материала из вида Escherichia coli используют штамм Escherichia coli ВНИИ генетика 472 Т-23, выращивание которого осуществл ют при рН 6,5-7,5 путем дробного введени  в посевную среду аммиачной воды.

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, а именно к способу получени  незаменимой аминокислоты - L-треонина, примен емой в качестве компонента различных питательных смесей медицинского назначени , добавки в пищу человека и в корм животных, а также как реактив дл  фармацевтической и химической промышленности и как РОСТОВОЙ фактор дл  микроорганизмов, продуцирующих другие аминокислоты, например L-лизин, L-roносерин .

Известен способ получени  Ь-треонина с использованием штамма Escherichia coli ВНИИгенетика 472 Т, способного усваивать сахарозу и устойчивого к треонину и гомосерину. Способ предусматривает при культивировании плазмидного продуцента выращивание посевного материала на жидкой посевной среде с последующим введением посевного материала в ферментационную среду. На стадии выращивани  посевного материала в посевную среду внос т источники углерода, азота, минеральHbje соли, мел, а также гидролизат белоксодержащих субстратов и пеницил лин. После глубинной ферментации культ ральную жидкость обрабатывают и выде л ют целевой продукт. В известном способе при культивировании плазмидного продуцента треонина значение рН к концу выращивани  посевного материала снижаетс  до 5,0 5,5. При внесении посевного материал с низким значением рН в ферментацион ную среду, котора  имеет нейтральное значение рН, происходит задержка начала разви-пм культуры на несколько часов, св занна  с адаптацией культу ры к новым услови м культивировани , что приводит к увеличению продолжительности ферментащш. Максимальное накоппение L-треонина (до 32 г/л) достигаетс  за 55 ч ферментации. При этом на синтез t г a вIHoкиcлoты расходуетс  4г углеводов. Недостатками указанного метода получени  L-треонина  вл ютс  недостаточно высокий уровень накоплени  L-треонина и больша  продолжитель-, ность ферментации. Целью предлагаемого изобретени   вл етс  повышение уровн  накоплени  треонина в кудьтуральной жидкости и сокран;ение продолжительности ферментации при одновременном уменьшении расхода углеводов на синтез аминокислоты . Поставленна  цель достигаетс  тем что в способе получени  L-треонина, предусматривающем приготовление посевного материала путем выращивани  продуцирукицих его микроорганизмов вида Escherichia coli в жидкой среде в присутствии гидролизата или автоли зата белоксодержащего субстрата и пенициллина, введение посевного мате риала в ферментационную среду, содер жащую источники углерода, азота и минеральные соли, ферментацию в глубинных услови х с последующей обработкой культуральной жидкости и вьще лением целевого продукта, предложено согласно изобретениюпри приготовлении посевногр материала из вида Escherichia coli использовать штамм Escherichia coli ВНИИгенетика 472 Т-23, выращивание которого осуществл ют при рН 6,5-7,5 путем дробного введени  в посевную среду аммиачной воды. Способ позвол ет получить до 55 г/л L-треонина за 40 ч ферментации при минимальном расходе углеводов до 2,5 2,5 г на 1 г треонина. Штамм E.coli ВНИИгенетика 472 Т-23 депонирован в Центральном музее промьшшенных микроорганизмов и имеет регистрационньй номер ЦМПМ В-2307. Штамм E.coli ВНИИгенетика 472 Т-23 и штаммпрототип E.coli ВНИИгенетика 472 Т имеют общего предшественника - штамм E.coli ВНИИгенетика 472, который получен введением детерминантов и сбраживани  сахарозы в клетки штамма E.coli ВНИИгенетика М-1, и  вл ютс  мутанта ми этого штамма, устойчивыми к треонину и гомосерину при их содержании в среде более 0,5 г/л. Штамм E.coli ВНИИгенетика 472 Т-23 отличаетс  от штамма E.coli ВНИИгенетика 472 Т стабильным сохранением признака устойчивости к указанным аминокислотам.и более стабильным сохранением плазмиды в процессе культивировани  на обогащенных питательных средах, а также более высокой удельной продуктивностью (см. табл.1). Штамм E.coli ВНИИгенетика 472 Т-23 имеет следующую культурально-морфоло-. гическую характеристику. Морфолаги . Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами размером 1,5-2 мкм в длину. Культурально-физиологические признаки . М со-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37 С образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колонии гладка , кра  ровные илислегка волнистые , центр колонии слегка припод- ци  пастообразна , легко эмульгиру- ютс . Рост на агаризованной минимальной среде Адамса. Через 40-48 ч роста при 37°С образует колонии 0,5-1,5 мм в диаметре, серовато-белые, полупрозрачные слегка с блест щей поверхностью , ослизн ющиес  через 4-5 суток. Рост в м со-пе-птонном бульоне. После 24 ч роста при 37°С наблюдаетс  сильное«равномерное помутнение, небольшой осадок, запах характерный. Рост в жидкой минимальной среде Адамса. Через двое суток роста с аэрацией при наблюдаетс  сильное

мере необходимости. На 27 часу ферментации концентраци  треонина в культуральной жидкости достигает 48 г/л, на 40 часу - 55 г/л. Расход сахара на 1 г треонина на конец ферментации составл ет 2,5 г.

Дл  выделени  треонина 400 мл культуральной жидкости нагревают в течение 5 мин до температуры , затем биомассу отдел ют центрифугированием. Полученный нативный раствор упаривают под вакуумдм до 80 мл, добавл ют к нему 20 мл этанола и кристаллизуют при температуре . Кристашш фильтруют и сушат. Получают г L-треонина.

Пример 2. Продуцент треонина и услови  выращивани  посевного материала те же, что и в примере 1. Отли

чие состоит в том, что значение рН в ходе выравщвани  посевного материала поддерживают на уровне 6,5. Через 24 ч культивировани  посевной-материал с титром клеток 1-10 (дол  клеток , утративших плазмиду, не более 6%) в количестве 10% внос т в ферментационнз среду следующего состава,%: Глюкоза2

Аммоний сернокислый 0,5 Калий фосфорнокисгалй однозамещенный 0,1 Ферментацию ведут в тех же услови х , что и в примере 1, с тем отличием , что в качестве рН-статирукнцего агента используют питательную добавку , состо щую из смеси 40% раствора глюкозы и 25% водного раствора аммиака в соотношении 6:1 (по объемам). Через 40 ч ферментации накопление треонина составл ет 41 г/л. Расход глюкозы на t г синтезированного треонина составл ет 3,1 г.

Дл  вьщелени  L-треонина 400 мл культуральной жидкости нагревают в течение 20 мин до , затем биомассу отдел ют центрифугированием. Полученный нативный раствор пропускают через колонку со смолой КУ-2-8 в форме. Сорбированный треонин элюируют 3%-ным раствором аммиака, упаривают до содержани  сухих веществ 80%, добавл ют зтанол в количестве 1/3 отобъема упаренного алюата и кристаллизуют в течение 12 ч при температуре О- (+5) С. Кристаллы L-треонина отфильтровывают , промьтают и.сушат. Получают 15 г L-треонина (выход составл ет 92%). Анализ чистоты продукта методом тонкослойной хроматографии (10 мкг) показывает отсутствие других аминокислот.

П р и м е р 3. Продуцент треонина и услови  выращивани  посевного материала те же, что и в примере 1. Отличие состоит в том, что в качестве питательной добавки в посевную среду вместо автолизата дрожжей внос т гидролизат БВК в количестве (в расчете на исходный БВК). Посевной материал выращивают в услови х рНстатировани  при рН 7,5iO,1 в течение 24 ч. Титр клеток в готовом по севном материале 0,9-10 кл/мл (дол , клеток, утративших плазмиду, не более 8%). Посевной материал в количестве 10% используют дл  засева ферментационной среды следующего состава, %г Сахароза8

Аммоний сернокислый 0,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1 Ферментацию ведут в тех же услови х , что и в примере 1. Через 13 ч

культивировани , когда концентраци  углевода в среде снижаетс  до.5% в ферментационную среду внос т дополнительно еще 4% сахарозы. К 30 часам ферментации сахар утилизуетс  полностью и накопление треонина составл ет 39 г/л. На синтез 1 г треонина расходуетс  3,0 г сахарозы.

Дл  вьщелени  L-треонина культуральную жидкость обрабатывают также, как в примере 1. Полученный нативный раствор упаривают до содержани  сухих веществ 30% и кристаллизуют при охлаждении (+3-5°С). Получают технический препарат L-трёонина с содержанием основного вещества 90%. Выход продукта составл ет 75%.

Таким образом, предлагаемый способ позвол ет снизить продолжительность ферментации до 30-40 ч по сравнению с 30-55 ч ito известному способу. При этом выход составл ет 39-55 г/л Lтреонина (в известном способе максЬмальный выход, достигаемый за 55 ч ферментации, составл ет 32 г/л). Минимальный расход углеводов на синтез 1 г L-треонина составл ет 2,5 г, что на 40% ниже, чем в известном, в котором на синтез 1 г аминокислоты расходуетс  4 г углеводов.

59

равномерное помутнение, запах характерный .

Рост по уКолу в м со-пептонном агаре. Хороший рост по всему уколу.

Рост на желатине. Желатину не разжижает .

Рост на молоке. Хороший рост с коагул цией молока.

Образование индола. Индол образует .

Рост на различных: углеводах. Хорошо растет на сахарозе, глюкозе, лактозе , маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе, глицероле, маннитоле с образовамием кислоты и газа.

Отношение к антибиотикам. Устойчив к пенициллину.

Патогенность. Не патогенен.

Соде1 жание плазмид. Клетки содержат многокопийную плазмиду pYN (мол.вес 5.8 мегадальтон), обеспечив ающую устойчивость бактерий к пени циллину и Н1есущую гены треонинового оперона.

Способ осуществл ют следующим образом .

Клетки продуцента E.coli ВНИИгенетика 472-Т-23 выращивают на агаризованной шнимaльнoй питательной среде в присутствии пеницшшина, затем суспензией клеток, (;мытых со скошенного агара, засевают жидкую питательную посевную среду, содержащую источники углерода, азота, необходимые минерапьные соли, питательную добавку в виде гидролизатов белоксодержащих субстратов и пенициллин. Посевной материал выращивают в ферментере, оснащенном системой рН-статировани , при температуре 35-37 6 и непрерывном азрировании и перемешивании в течение 20-30 ч. Значение рН в ходе выращивани  посевного материала поддерживают на уровне 6,5-7,5 дробным введением в ферментер аммиачной воды. Приготовленный таким образом посевной материал используют дл  засева ферментационной среды, содержащей источники углерода (например сахар или глюкозу) источники азота и необходимые минеральные сол. Ферментацию осуществл ют в ферментерах, оснащенных системой рН-статировани , при рН 6,5-7,5, температуре 35-37С и непрерывном перемешивании и азрировании. В качестве рН-статирующего агента примен ют либо аммиачную воду, либо сбаллансированную по углероду и аммиаку подпитку.

7 ,

Продолжительность ферментации 30-40 ч На 40 ч культивировани  в культуральной жидкости накапливаетс  до 55 г/л треонина. Дл  вьщелени  треонина культуральную жидкость подвергают быстрому нагреву в течение не более 20 мин до температуры 60-100 С, с целью предупреждени  лизиса клеток, затем биомассу отдел ют центрифугированием или сепарированием. Выделение треонина из полученного нативного раствора осуществл ют одним из известных способов.

Способ по сн етс  следующими примерами .

Пример 1. Культуру продуцента E.coli ВНИИгенетика 472 Т723, выращенную на агаризованной минимальной среде с глюкозой в присутствии пенициллина , пересевают на жидкую посевную питательную среду следующего состава , %:

Сахар технический 4 Аммойий сернокислый 0,5 Калий фосфорнокислый двузамещенный0,2

Магний сернокислый 0,04 Автолизат дрожжей 0,2 Пенициллин . 0,01 Доза засева 1-10 клеток в мл. Выращивание посевного материеша провод т в ферментере емкостью 0,5 л при аэрировании 0,5 л воздуха в минуту , перемешивании 900 об/мин, температуре 37С. рН-статирование осуществл ют на уровне 7,01.0,1 путем автоматической подачи в ферментер аммиачной воды. Врем  выращивани  посевного материала 20 ч. Титр клеток в готовом посевном материале l-lO Kn/Mn (дол  клеток, утративших плазмиду, не более 6%)., Посевной материал в количестве 10% внос т в ферментационную среду следующего состава, %:

Сахар технический 8 Аммоний сернокислый 0,5 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1 . Ферментацию провод т в ферментере с рабочим объемом 0,5 л, оборудованном системой рН-статировани . Режим ферментации: аэрирование 0,5 л/мин, перемешивание 900 об/мин, температура 37°С, рН-статирование на уровне 7,0t ±0,1 путем подачи аммиачной воды. После исчерпани  из ферментахщонной среды начальной порции сахара его внос т дробно в несколько порций, по

Сравнительна  характеристика штаммов E.coli ВНИИгенетика 472 Т и 472 Т-23

Относительное содержание клеток, сохран ющих после 10 генераций на бульоне Хоттингера, устойчивость,к

треонину и гомосерину, %

ВНИИгенетика 472 Т 1-3 ВНИИгенети .ка 472 Т-23 100

Максимальна  удельна  продуктивность г треонина г биомассы в ч

пенициллину , %

0,14

82-98 0,23 98-99

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА, предусматривающий приготовление посевного материала путем выращивания про-