KR900005771B1 - L-글루탐산의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

L-글루탐산의 제조방법
본 발명은 L-글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.
지금까지 발효에 의한 L-글루탐산의 상업적 규모의 각종 제조방법에 제안되었으며, 성장을 위해 올레산을 필요로 하나 비오틴을 필요로 하지 않는 미생물을 사용한 발효 방법이 L-글루탐산의 제조를 위한 상업적 방법으로 제안되었다. 본 발명자들은 고수율의 L-글루탐산을 제조하는 방법을 연구하였으며. 탄수화물과 아세트산의 비율을 고정된 범위로 유지시키면서 성장을 위해 올레산을 필요로 하나 비오틴을 필요로 하지 않는 L-글루탐산 생성 미생물을 올레산과 과량의 비오틴을 함유한 배지에서 배양함으로써, 더 많은 탄소원을 L-글루탐산으로 전환시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명은 이러한 발견을 기초로한 것이다.
본 발명은 성장을 위해 올레산을 필요로 하나 비오틴을 필요로 하지 않는 L-글루탐산 생성 미생물을 올레산 화합물 및 비오틴이 100㎍/l 이상인 비오틴 화합물을 함유한 배양 배지에서 탄소원으로서 탄수화물과 아세트산의 중량비를 약 80 : 20 내지 40 : 60으로 유지시키면서 배양함을 특징으로 하는 L-글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 사용된 미생물은 그의 분류에 비추어, 성장을 위해 올레산을 필요로 하나 비오틴을 필요로 하지 않는 L-글루탐산 생성 미생물(이후 때때로 본 발명의 L-글루탐산 생성 균주로 약칭함)이다.
이 균주 중에서, 본 발명자들은 브레비박테리움(Brevibacterium)속 또는 코리네박테리움(Corynebacter-ium)속에 속하는 미생물이 본 발명의 목적에 특히 적합하다는 것을 발견하였다. 예를들면, 브레비박테리움 티오게니탈리스 D-248(Brevibacterium thiogenitalis D-248), 브레비박테리움 플라붐 BN-11(Brevibacterium flavum BN-11) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 No.534-MS-023(Corynebacterium glutamicum No.534-MS-023)은 본 발명의 대표적인 L-글루탐산 생성균주이다.
상술한 균주들은 재단법인 오오사까 발효 연구소 (IFO), 일본국 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술 연구소(FRI) 및 한국과학기술원(KAIST)에 기탁되어 있다 FRI의 균주기탁은 부다페스트 협약하에 기탁되었으며, 균주들은 FRI에 저장되어 있다. 기탁번호 및 기탁일은 표 1과 같다.
[표 1]
Figure kpo00001
이들 균주 중에서, 브레비박테리움 티오게니탈리스는 본 발명의 균주가 성장을 위해 올레산을 필요로 하나 비오틴을 필요로 하지 않는다는 것을 제외하고는 일본 특허 공고 소 54(1976)-942에 기재된 미생물 특성과 같다. 브레비박테리움 플라붐의 미생물적 특성은 본 발명의 균주가 성장을 위해 올레산을 필요로 하나 비오틴을 필요로 하지 않는다는 것을 제외하고는 일본 특허 공고 소 39(1964)-17348에 기재된 것과 동일하다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 미생물적 특성은 본 발명의 균주가 성장을 위해 올레산을 필요로 하나 비오인을 필요로 하지 않는다는 것을 제외하고는 일본 농업 화학 잡지 39,328(1965)에 기재된 것과 동일하다.
일반적으로, 브레비박테리움 및 코리네박테리움 속의 미생물은 특성이 변화될 수 있으며, X-선, 자외선 또는 기타의 빛을 조사하거나 각종의 변이제로 처리하는 방법과 같은 인공 변이 처리에 의해서 분만 아니라 자발적으로도 특성이 변화할 수 있다. 이들 변이체들은 L-글루탐산을 제조할 수 있으며. 성장을 위해 올레산을 필요로 하나 비오틴을 필요로 하지 않는다면 본 발명의 목적을 위해 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 올레산 화합물은 올레산 그 자체, 그의 염 또는 에스테르 또는 올레산 함유 물질일 수 있다. 올레산 염의 예로서, 소듐염. 포타슘염 및 마그네슘 염이 있다. 올레산의 에스테르는 예를들면 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 및 폴리옥시에틸렌글리콜 모노올레이트 뿐만 아니라 상응하는 세스퀴올레이트, 트리올레이트 등이 있다. 상기 올레산 함유 물질의 예로서 라아드 오일, 지방 및 오일류 등이 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 올레산이 약 60mg/l이상. 바람직하게는 약 60-300mg/l가 되는 양의 올레산 화합물을 배지에 가한다. 올레산을 최초 배지에 충분히 가하지만, 배양하는 동안에 상기 농도를 유지하기 위해 올레산을 가할 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 비오틴 화합물은 비오틴 그 자체 또는 비오틴-활성 물질일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 비오틴 화합물은 비오틴이 약 100㎍/l이상, 바람직하게는 약 200∼500㎍/l가 되는 농도로 배지에 배합된다. 상기에 지정된 량의 비오틴을 최초배지에 충분히 가하지만. 배양하는 동안 상기 농도를 유지하기 위해 비오틴을 가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 탄수화물 및 아세트산은 배지에 탄소원으로서 사용된다. 탄수화물과 아세트산의 비율은 초기 배지를 포함한 전 배양 기간동안 약 80 : 20 내지 40 : 60(중량)의 범위, 바람직하게는 약 70 : 30 내지 50 : 50(중량)의 범위, 더욱 바람직하게는 약 60 : 40(중량)으로 유지한다.
탄수화물과 아세트산을 가하는 방법에 있어, 두 성분이 배지에 상기와 같은 비율로 존재하도록 한다. 그러므로, 양자를 동시에 가하거나 한가지가 소비되었을 때 따로 가하여 상기 비율을 유지할 수 있다. 결국, 두 성분의 비율이 상기의 범위가 되도록 유지시킨다.
본 발명에 사용된 탄수화물은 본 발명의 L-글루탐산 생성 미생물이 L-글루탐산을 생성할 수 있는 어떤 탄수화물일 수 있다. 탄수화물의 예를들면, 글루코오즈, 프럭토오즈, 슈크로오즈, 조설탕, 몰라세 및 각종 당화 전분(예를들면 타피오카, 사고야자, 고구마 전분)이 있으며, 이들 탄수화물은 혼합물로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어, 아세트산은 초기 배지에 약2%(w/v)이하의 농도, 바람직하게는 약 1%(w/v)이하의 농도로 가해진다. 배양 중간 단계에, 배지에 남아 있는 아세트산의 량이 약 1%(w/v) 농도를 넘지 않도록 아세트산을 가한다. 본 발명에 사용된 아세트산은 꼭 아세트산일 필요는 없으며, 그의 염(예를들면 소듐염, 포타슘염, 암모늄염 등) 또는 그의 혼합물일 수 있다.
필요하다면, 본 발명에 따른 배지는 상기의 특정 탄소원, 올레산 및 비오틴 이외에도 가종 유기 및 무기질소 화합물, 무기 금속염, 비타민 등과 같이 L-글루탐산 발효에 일반적으로 사용되는 각종 배지 성분을 함유할 수 있다. 또한 거품 방지제도 배지에 가해질 수 있다. 배양 방법은 공지의 방법으로 행하며, 호기성 교반 배양은 25-37℃의 배양 온도에서 수행된다. 배양하는 동안, 배지의 pH는 암모니아 기체, 암모니아수, 우레아 또는 수산화나트륨, 수산화칼륨 등과 같은 알칼리 단독 또는 배합물을 사용하여 약 pH7-pH8.5의 범위로 유지시킨다.
발효 브로스로 부터 L-글루탐산의 회수는 공지의 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 탄수화물을 L-글루탐산으로 전환시키는 비율이 높으므로, 고수율의 L-글루탐산을 제공할 수 있다. 따라서, L-글루탐산의 분리 및 단리가 편리하며, 제조 비용이 감소된다. 하기의 참고예 및 실시예는 본 발명을 더욱 상세이 설명한다.
[참고예 1]
1당 20ｇ의 글루코오즈, 2ｇ의 우레아 1ｇ의 KH2PO4, 0.4g의 MgSO4·7H2O, 20ｇ의 옥수수 침지액, 1ｇ의 CaCO3, 4㎎의 CuSO4·5H2O, 150㎎의 FeSO4·7H2O 및 300㎎의 소듐 올레이트를 함유한 종 배양 배지를 200m1 용량 원추 플라스크에 20ml 분배한다. 살균 후, 각 플라스크를 1루우프의 브레비박테리움 티오게니탈리스D-248(IFO-12331, FERM BP-433, KAIST 840124-12411)의 경사배양액으로 접종시키고, 28℃ 및 200rpm의 로타리쉐이커에서 18시간동안 배양한다. 생성된 배양액을 종배양액으로 사용한다.
한편, 11당 표 2에 기재된 비율의 1%탄소원, 1.5g의 KH2PO40.4g의 MgSO4·7H2O, 2g의 옥수수 침지액, 5mg의 MnSO4·4-6H2O, 200㎍의 비오틴, 200mg의 소듐을 올레이트 및 10mg의 페놀레드를 함유한 주배양 배지(pH7.2)를 200㎖용량의 원추 주름 플라스크에 50m1씩 분배한다. 살균 후, 2.5ml의 상기종배양액을 각 플라스크로 옮기고, 32℃ 및 200rpm의 로타리쉐이커에서 배양을 시작한다. 배양시작 8시간 후, 초기 탄소원 비율에 해당하는 탄소원을 대 1시간마다 총 35시간 동안 초기 배지에 0.4%(w/v)의 비율로 가한다.
결과는 표 2에 나타낸다. 하기의 설명에서, 미생물의 성장도는 590nm에서 50배 희석 배양액의 총합도로 표시된다. L-글루탐산의 측정은 글루탐산 데카르복실라제를 사용한 와버그의 마노메타법에 의해 수행된다.
[표 2]
Figure kpo00002
* 중량
** 50배 희석 배양액의 590nm에서의 흡광도.
표 2에서 명백한 바와같이, 글루코오즈 또는 아세트산을 단독으로 사용한 경우보다 글루코오즈 및 아세트산을 80 : 20 내지 40 : 60. 특히 70 : 30 내지 50 : 50의 중량비로 배합사용한 경우 L-글루탐산의 수율이 현저하게 증가되었다.
[참고예 2]
1당 6g의 글루코오즈, 5.8g의 암모늄 아세테이트(아세트산 4g), 1.59의 KH2PO40.4g의 MgSO4·7H2O, 2g의 옥수수 침지액, 5mg의 MnSO4·4-6H2O, 표 3에 기재된 양의 비오틴, 200mg의 소듐 올레이트 및 10mg의 페놀레드를 함유한 발효 배지(pH7.2)를 200㎖용량 주름 원추 플라스크에 50㎖씩 분배한다. 살균 후, 참고예 1과 같은 방법으로 제조된 종 배양액 2.5㎖를 플라스크에 옳기고 32℃ 및 200rpm의 로타리 쉐이커에서 배양을 시작한다. 배양시작후 8시간 되었을 때, 24%(w/v) 글루코오즈 수용액 0.5㎖(0.12g의 글루코오즈) 및 암모니아수로 pH를 미리 5.5로 조절한 16%(w/v) 아세트산 수용액 0.5㎖(0.08g의 아세트산)을 1시간 간격으로 총 35시간 동안 공급한다. 이 기간동안 지시약으로서 페놀레드의 색깔을 이용하여 30%수산화나트륨에 의해 배지의 pH를 7.2-8.0으로 맞춘다. 결과는 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00003
* 590nm에서 50배 회석 배양액의 흡광도
표 3의 결과로 부터, 미생물의 성장은 비오틴에 의해 영향을 거의 받지 않으며 오히려 저농도의 비오틴에서 미생물이 더 잘 성장하는 반면, 비오틴의 농도가 증가하면 L-글루탐산의 수율이 증가한다는 것을 알 수 있다. 그러므로 고수율의 글루탐산의 제조 및 축적을 위해, 배지에 약 100㎍/1이상의 비오틴을 배합할 필요가 있다는 것은 명백한다.
[실시예 1]
1당 20g의 글루코오즈, 2g의 우레아, 1g의 KH2PO4, 0.4g의 MgSO4·7H2O, 20g의 옥수수 침지액, 1g의 CaCO3,4㎎의 CuSO4·5H2O, 150㎎의 FeSO4·7H2O 및 300㎎의 소듐 올레이트를 함유한 종 배양 배지를 200㎖ 용량 원추 플라스크에 20㎖씩 분배한다. 살균 후, 각 플라스크를 표 4에 기재된 3종류의 균주로 접종시키고 28℃ 및 200rpm에서 로타리쉐이커에 18시간동안 배양한다. 이 배양액을 종 배양액으로 사용한다.
한편 1당 6g의 글루코오즈, 5.8g의 암모늄 아세테이트(4g의 아세트산), 1.5g의 KH2PO4, 0.4g의 MgSO4·7H2O, 2g의 옥수수 침지액, 5㎎의 MnSO4·6H2O, 200㎍의 비오틴, 200㎎의 소듐 올레이트 및 10㎎의 페놀레드를 함유한 발효배지(pH7.2)를 200㎖용량 주름 원추 플라스크에 50㎖씩 분배한다. 살균 후, 상기 종 배양액 2.5㎖씩을 플라스크에 옮기고, 32℃ 및 200rpm의 로타리쉐이커에서 배양을 시작한다.
배양 시작후, 8시간 되었을 때, 24%(w/v) 글루코오즈 용액 0.5㎖(0.12g의 글루코오즈) 및 암모니아수로 pH 5.5로 미리 맞춰진 16%(w/v) 아세트산 용액 0.5㎖(0.08g의 아세트산)를 1시간 간격으로 총 35시간 동안 동시에 공급한다. 그 동안 지시약으로서 페놀레드의 색깔을 이용하여 배지의 pH를 30%수산화나트륨 용액에 의해 pH 7.2∼8.0의 범위로 유지시킨다. 결과는 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure kpo00004
[실시예 2]
발효 배지의 탄소원으로서 슈크로오즈를 사용하는 것을 제외하고 브레비박테리움 티오게니탈리스 D-248(IFO 12331, FERM BP-433, KAIST 840124-12411)에 대해 실시예 1의 배양 방법을 반복한다. 탄소원을 기준으로 L-글루탐산의 수율은 70.8%이다.
[실시예 3]
1당 12g의 고구마 전분의 효소적 가수분해물(예를들면 글루코오즈) 11.6g의 암모늄 아세테이트(8g의 아세트산), 1.5g의 KH2FO4, 0.4g의 MgSO4·7H2O, 2g의 옥수수 침지액, 5㎎의 MnSO4,·4-6H2O, 200㎍의 비오틴, 175㎎의 소듐 올레이트 및 10㎎의 페놀레드를 함유한 발효배지(pH7.2)를 200m1용량 주름 원추 플라스크에 50㎖씩 분배한다. 살균 후, 실시예 1과 같은 방법으로 제조된 브레비박테리움 티오게니탈리스 D-248(IFO 12331, FERM BP-433, KAIST 840124-12411)의 종 배양액 2.5ml를 각 플라스크에 옮기고 배양한다. 배양시작후 10시간이 되었을 때 30%(w/v) 글루코오즈를 함유한 당화액 0.5㎖(0.15g의 글루코오즈) 및 암모니아수로 미리 pH 5.5로 맞춘 20%(w/v) 아세트산 용액 0.5㎖(0.1g의 아세트산)을 1시간 간격으로 총 26시간 동안 동시에 공급한다. 이 기간동안, 30%수산화나트륨용액에 의해 배지를 pH7.2∼8.0의 범위로 유지시킨다. 사용된 탄소원을 기준으로 L-글루탐산의 수율은 69.2%이다.
[실시예 4]
1당 14g의 몰라세(타탈슈가), 8.7g의 암모늄 아세테이트(6g의 아세트산), 1.5g의 KH2PO4, 0.4g의 MgSO4·7H2O, 1g의 옥수순 침지액, 5mg의 MnSO4·4-6H2O, 150㎍의 비오틴 및 150㎎의 소듐 올레이트를 함유한 발효배지(pH7.2)를 10ℓ들이 병 발효기에 4ℓ 부퍼 정도 공급하고 살균 후, 실시에 1과 같은 방법으로 제조된 브레비박테리움 티오게니탈리스 D-248(IFO 12331, FERM BP-433, KAIST 840124-12411)의 종 배양액 200㎖로 접종시킨다. 30℃, 500rpm 및 2ℓ/분 통기하에 배양을 시작한다. 초기의 탈소원이 거의 완전히 소비되었을 때, 배지의 초기부피를 기준으로 0.105%(w/v)의 몰라세(타탈슈가 기준) 및 0.045(w/v)의 아세트산을 용해된 산소의 농도를 증가시키면서 매시간 공급하여 사용된 탄소원의 총량이 초기액체 부피의 15%(w/v)에 도달할때 까지 배양을 계속한다. 이 기간동안, 배지의 pH는 암모니아수에 의해 pH7.3∼7.7의 범위로 자동 유지된다. 배양은 약 30시간에 완결되며, 이때 배양 브로스(6.1ℓ)에 62.5mg/㎖의 L-글루탐산이 축적된다. 그러므로 탄소원을 기준으로 한 수율은 63.5%이다. 이 브로스를 통상의 방법으로 처리하였을 때 328g의 L-글루탐산 조결정이 수득된다.
[실시예 5]
ℓ당 12g의 글루코오즈, 11.6g의 암모늄 아세테이트(8g의 아세트산), 1.5g의 KH2PO4, 0.4g의 MgSO4·7H2O, 2g의 옥수수 침지액, 5mg의 MnSO4·4-6H2O, 200㎍의 비오틴 및 200㎎의 소듐 올레이트를 함유한 발효배지(pH7.2)를 10ℓ들이 병 발효기에 4ℓ부피로 공급하고, 살균 후, 실시예 1과 같은 방법으로 제조된 브레비박테러움 티오게니탈리스 D-248(IFO 12331, FERM BP-433, KAIST 840124-12411)의 종 배양액 200㎖로 접종시킨다. 32℃, 500rpm 및 2ℓ/㎖ 통기하에 배양을 시작한다. 몰라세 및 아세트산(암모니아수에 의해 pH 5.5로 미리조정)을 사용된 탄소원의 총량이 16%(w/v)가 될때까지. 실시예 4와 같은 비율로 공급한다. 그러나, 배지의 pH는 30%수산화나트륨으로 조정한다. 배양은 약 36시간에 완결되며, 이때 배양 브로스(6.21)에서 67.1㎎/㎖의 L-글루탐산이 발견된다. 탄수화물을 기준으로 한 수율은 65%이다.
이 브로스로부터 통상의 방법으로 L-글루탐산을 회수하였을 때. 370g의 조결정이 수득된다.

Claims (8)

  1. 성장을 위해 올레산을 필요로 하나 비오틴을 필요로 하지 않는 L-글루탐산 생성 미생물을 올레산 화합물 및 비오틴이 100㎍/ℓ이상인 비오틴 화합물을 함유한 배양배지에서 탄소원으로서 탄수화물과 아세트산의 비율을 약 80 : 20 내지 40 : 60의 중량비로 유지시키면서 배양함을 특징으로 하는 L-글루탐산의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 탄수화물이 글루코오즈인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 탄수화물이 슈크로오즈인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 탄수화물이 고구마의 당화 전분인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 탄수화물이 몰라세인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 탄수화물과 아세트산을 배양 배지에서 약 70 : 30 내지 약 50 : 50범위의 중량 비율로 유지시키는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 탄수화물과 아세트산을 배양 배지에서 약 60 : 40의 중량비로 유지시키는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 배지에 함유된 올레산 화합물의 양이 약 60mg/ℓ이상인 방법.
KR1019840001358A 1983-03-18 1984-03-16 L-글루탐산의 제조방법 KR900005771B1 (ko)

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JP46712 1983-03-18
JP58046712A JPS59173090A (ja) 1983-03-18 1983-03-18 Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP46712/83 1983-03-18

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