KR960007613B1 - 미생물을 이용한 엘-글루탐산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

미생물을 이용한 L-글루탐산의 제조방법

본 발명은 미생물을 미용한 L-글루탐산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비오틴이 과량 함유된 탄수화물 배지에서 올레산을 필요로 하는 미생물 균주를 사용하여 L-글루탐산을 제조하는 발효적 방법에 관한 것이다.

일반적으로 사탕수수 당밀, 사탕무우 당밀같은 탄수화물을 이용하는 L-글루탐산의 발효에 있어서 발효배지중의 비오틴 농도가 필요량이상으로 되면 L-글루탐산의 수율이 상당량 감소된다는 것은 공지의 사실이다. 이러한 L-글루탐산의 수율 감소 현상을 회복하기 위해 말론산(malonic acid)과 요오드화 초산(iodoacetic acid)에 대하어 가소성을 가지는 균주를 배양하여 계면 활성제를 초기 사입 배지에 첨가시키는 방법(한국 특허 공고 84-2197호), 올레산을 필요로 하는 균주를 배양하여 탄소원인 탄수화물과 아세트산의 비율을 적당량 조절하는 방법(한국 특허 공개 84-8166호), 비오틴(biotin)은 필요로 하지 않으나 올레산을 필요로하는 균주를 과량의 올레산원을 함유한 배지에서 공기보다 산소 농도가 높은 기체를 통과시키면서 배양하는 방법(한국 특허 공고 91-7821호)등이 개시되어 있다.

본 발명자들은 L-글루탐산을 제조하기 위해 L-글루탐산 생산 균주의 여러 변이주를 유도하는 과정에서 올레산을 필요로 하는 균주가 폴리옥시에틸랜 글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틴렌 소르비탄 지방산 에스테르같은 비이온성 계면 활성제로 제어를 받을때 세포막의 포화 지방산과 불포화 지방산의 몰비가 변화되어 L-글루탐산의 세포막 투과성이 개선되어 비오턴이 과량 함유된 탄수화물 배지에서도 L-글루탐산이 높은 수율로 제조될 수 있음을 알게되었다.

본 발명과 관련되어 사용된 균주는 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)CFC-L610의 변이주로 올헤산을 필요로 하는 균주이다.

본 발명에 사용된 변이주는 통상적으로 사용되는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구이니딘(이하MTG라 함)을 처리하여 유도된 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)CFC-LIO8(1992년 11월 3일 기탁, 기탁번호 KFCC-10778호)이다.

본 발명과 관련된 변이주 CPC-LIO8(KPCC-lOW8호)의 분리방법은 브레비박테리움 락토퍼멘텀 CFC-L610을 배양하여 NTG와 반응시킨 후 올레산이 포함된 배지와 최소 배지에 도말하여 올레산이 포함된 배지에서 생육된 집락을 채취하여 다량의 L-글루탐산을 축적하는 균주를 분리하므로써 이루어진다.

변이 처리 유도된 CFC-LIO8균주의 유도 방법과 올레산이 포함된 배지에서 성장 정도는 다음의 실시예1 및 실시예 2에 나타내었다.

본 발명에 따른 미생물을 이용한 L-글루탐산의 제조방법에 있어서 특징은 올레산 요구성 브레비박테리움 락토퍼멘텀 변이주 CFC-LIO8(기탁번호 KFCC-lO778호)를 비오틴이 과량 함유된 사탕수수 당밀의 탄수화물 배지애서 비이온성 계면활성제인 폴리옥시애틸렌 글리콜 지방산 애스테르, 또는 폴리옥시애틸렌 소르비한 지방산 에스테르를 첨가하여 호기적 상태로 배양하여 L-글루탐산을 축직 및 회수함에 있다.

이때 상기 배지에 첨가된 올레산의 양은 배지 IL당 200-500mg이고, 대수 중기에 0.03-0.05%의 폴리옥시에틸렌 글리콜 지방산 에스테르 및 0.03-0.05%의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르를 첨가하게 된다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1

브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)CFC-1610을 배양시킨후 살균된 증류수로 조제된 500ug/m1 NTG 용액과 30℃에서 30분간 반응시켰다. 이렇게 처리된 균주를 인산 완충 용액으로 세척하고 균체를 분리하여 아래 표1의 성분을 포함한 배지에 도말하였다. 올레산이 포함된 배지에서 생육된 집락을 채취하여 최소 배지에 레플리커(Replica) 도말하여 최소 배지에서 성장하지 않는 균주를 선별, 분리하였다.

실시예1에서 분리되어진 변이주를 표1의 성분이 함유되어 있는 각각의 배지에 접종하여 30℃에서 48시간 배양한 후 각 균주의 중식 정도를 관찰하였다. 증식 결과는 다음의 표2에 기록되어 있다.

실시예3

다음 표 3에 기륵되어 있는 성분이 함유된 배양액 40m1를 500m1 삼각플라스크에 분주한후 121℃에서 15분 동안 살균했다.

브레비박테리움 락토퍼멘텀CFC-L610과 CFC-L108을 표3에 수록된 성분이 함유된 배지에 무균적으로 접종한 후 30℃에서 이틀동안 진탕 배양하였다.

배양 결과 배양 완료액에 축적된 L-글루탐산의 양은 다음의 표4와 같다.

실시예4

2.0%의 글루코스, 0.1%의 KHP0, 0.05%의 MgS07HO, 0.01%의 FeS07H0, 0.2%의 우레아, 0.2%의 참치 침지액, 300㎍/m1의 티아민 하이드로클로라이드(thiamine-HCI) 및 0.015%의 소듐올레이트(올레산 함량 95%)를 함유한 종배양 배지의 pH를 7.0으로 조정하고 살균한 후 5리터의 발효조에 브레비박테리움 락오퍼멘텀 CFC-LIO8의 사면 배양액으로 접종한 후 30℃에서 20시간 동안 배양했다. 얻어진 총 배양액 200ml를 8.0%의 사탕수수 당일(버트란도 당도 계산법에 의해 결정된 총 슈가), 0.4%의 우레아, 0.15%의 NHHPO0.05%의 MgSO7H0, 0.01%의 FeSO. 7H0,0.01%의 MnSO4H0, 300㎍/ml의 티아민 하이드로클로라이드 200㎍/ml의 비오틴, 0.2%의 참치 침지액 및 표 5에 기재된 농도와 소듐 올레이트(올레산 함량 95%)를 함유한 살균 배지 10러터가 들어있는 30리터 발효조로 옮기고 32℃에서 500rpm(분당 회전수)으로 발효를 시작했다. 배양액중의 당도가 1.0-1.5%가 되도록 살균한 당밀(당도 40%)을 추가하고 pH는 기체 상태의 암모니아를 자동적으고 가하여 7.7-7.8범위로 유지했다. 온도는 계면 활성제 첨가전까지는 32℃로 하고 그 후에는 35℃-37℃로 유지하며 통기량은 배양 과정동안 0.5VVM으로 하여 30시간 배양하였다. 배양하는 과정중에 계면 활성제로 0.03-0.05%의 폴리옥시에틸렌 글리콜 지방산 에스테르를 대수 중기에 첨가했다.

배양 결과 L-글루탐산의 대당 수율(%)은 다음 표5와 같다.

실시예 5

실시예 4에서 대수 중기에 투입되는 계면 활성제로서 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산에스테르를 다음의 표6에 기재된 농도로 첨가시키는 것을 제외하고는 실시예 4의 방법과 동일하게 실시하였다.

배양 결과 L-글루탐산의 대당 수율(%)은 다음 표6과 같다.

Claims (3)

1. 올레산 요구성 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermen

   tum) 변이주 CFC-LIO8(기탁번호 KFCC-10778호)를 비오틴이 과량 함유된 사탕수수 당밀의 탄수화물 배지에 폴리옥시에틸렌 글리콜지방산 에스테르. 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르를 첨가한 후, 호기적 상태로 배양하여 L-글루탐산을 축적 및 회수함을 특징으로 하는 미생물을 이용한 L-글루탐산의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 배양 배지에 첨가된 올레산의 양은 배지 1리터당 200-500mg임을 특징으로 하는 미생물을 이용한 L-글루탐산의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 폴리옥시에틸린 글리콜 지방산 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르는 대수 중기에 배지에 대하여 0.03-0.05% 첨가됨을 특징으로 하는 미생물을 이용한 L-글루탐산의 제조방법.