KR100513996B1 - 연속발효에의한l-글루탐산의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-글루탐산 생산능력을 갖는 미생물을 탄소원과 질소원을 함유하는 액체 배지에 접종하고, 탄소원 및 세균 증식 촉진효과를 갖는 영양소 둘다를 공급하여 세균이 증식되도록 하는 L-글루탐산 연속 발효를 수행한 다음, 배양액에서 생성되고 축적된 L-글루탐산을 수거함을 포함하는, L-글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.

Description

연속 발효에 의한 Ｌ-글루탐산의 제조방법

본 발명은 연속 발효 방법에 의해 L-글루탐산을 효과적으로 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. L-글루탐산은 조미료와 같은 식품 재료 및 다양한 화학 상품의 원료 물질로서 광범위하게 사용되고 있다.

최근에 L-글루탐산에 대한 수요 급증에 따라 산업적으로 유리한 제조방법 개발이 요구되고 있고 하기 기술된 바와 같은 제조 방법이 개발되고 있다.

(1) 배치식(Batch) 배양 방법, 유가식(Fed-batch) 배양 방법

연속 배양 방법과 비교하여 이들 배양 방법은 이의 장치가 단순하고 배양이 짧은 기간에 종료되고 오염된 세균으로 인한 손해가 적다는 점에서 유리하다. 하지만 배양액내의 L-글루탐산의 농도가 시간 경과에 따라 증가하고 이의 생산성 및 수율이 산물로 인한 삼투압 또는 억제의 영향으로 감소한다. 따라서 장시간동안 고수율 및 고생산성을 안정하게 유지하는 것이 곤란하다.

(2) 연속 배양 방법

연속 배양 방법은 발효기내에 목적 산물이 고농도로 축적되는 것을 회피함으로써 고수율 및 고생산성이 장시간 동안 유지될 수 있다는 점을 특징으로 한다.

연속 배양 방법의 가장 단순하고 일반적인 형식은 단일-발효기 연속 배양 방법이고 L-라이신 발효 및 L-아르기닌 발효를 포함하는 아미노산 발효에 적용되는 단일 발효기 연속 배양 방법에 관한 많은 보고서가 발표되었다[참조: Lys: Toshihiko Hirao et. al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 269-273(1989), Arg: Tomoki Azuma et. al., J. Ferment. Technol., 66(3), 285-290(1988)]. L-라이신 및 L-아르기닌의 상기 발효 동안에 세균 증식 및 목적하는 아미노산의 생산이 동시에 일어남에 따라서 단일 발효기 연속 배양 방법은 용이하게 이들 발효에 적용되어 왔다.

한편, L-글루탐산 발효에 대해서는 단일-발효기 연속 배양 방법이 적용하기 어려운 것으로 여겨져왔다. 즉 다시 말해서, 세균 증식이 세균 증식에 필수적인 요소인 비오틴의 제한, 페니실린과 같은 항생제의 첨가, 계면활성제의 첨가 및 온도변화를 포함한 임의의 방법에 의해 종료되지 않는 한 통상적으로 L-글루탐산이 상기 L-글루탐산 발효에 의해 고농도로 축적될 수 없는 것으로 여겨져왔다[참조: 1.Japanese Journal of Fermentation Engineering Association, Vol. 41, No. 12, 645-651(1963); 2. Recent Japanese Industrial Chemistry, Vol. 23, 121-142, Asakura Shoten]. 배치식 배양 방법 및 유가식 배양 방법에 의해 대량의 L-글루탐산을 제조하기 위하여는 세균 증식이 종료되도록 배양 조건을 설정되어야만 한다. 따라서, 연속 배양 방법에 의한 L-글루탐산의 발효는 세균 증식을 종료하는 통상적인 배양 조건하에서 세균이 제거되어 세균이 발효기내에 유지될 수 없기 때문에 적합하지 않다고 여겨져왔다. L-글루탐산 발효를 위한 연속 배양 방법의 연구에 관하여, 제1 발효기 내에서 세균 증식을 촉진하고 제2 발효기 내에서 미생물 증식을 억제하여 L-글루탐산을 제조함을 포함하는 다중-발효기 연속 배양 방법의 연구가 초기단계에 수행된 바 있다[참조: 우에다 등, Japanese Journal of Fermentation Engineering Association, Vol. 41, No. 9, 450-458, 1964; 미무라 등, Japanese Journal of Fermentation Engineering Association, Vol. 42, No. 2, 70-78, 1964].

이어서 2개의 방법, 즉, 세포 재순환 배양 방법 및 고정화 세균 배양 방법이 개발되었는데, 이 배양 방법들은 세균 증식 과정 및 L-글루탐산 생산 과정이 독립적으로 수행되어야만 한다는 개념을 근거로 한 것이다.

첫 번째로, 세포 재순환 배양 방법은 L-글루탐산이 축적되지만 세균 증식이 종료된 배양액을 추출하고 세균으로부터 L-글루탐산을 분리시켜 세균만을 재순환시키는 것으로 구성되는 방법[참조: 미심사된 일본 특허공개공보 제52-136985호; 미심사 일본 특허공개공보 제60-133891호 또는 미심사 일본 특허공개공보 제62-48394호]이고 상기 방법은 비교적 장시간 동안 고수율 및 고생산성을 유지할 수 있다. 그러나, 상기 방법은 불리하게도 배양액에서 세균을 분리시키는 시스템을 요구하기 때문에 배양 시스템이 복잡하다. 더욱이, 세균 증식이 종료된 세균이 세포 재순환 배양 방법에 의해 재순환되기 때문에 자체적으로 L-글루탐산을 제조하는 세균 능력이 시간 경과에 따라 감소하여 배양시간을 제한한다.

고정화 세균 배양방법이 또한 고수율 및 고생산성으로 L-글루탐산을 회수할 수 있기는 하지만[참조: H.S. KIM et. al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 26, 2167-2174(1982)], 세균을 고정화시키는 담체가 L-글루탐산을 제조하기 위한 실제 적용에 있어서 비용이 많이 들고 또한 상기 방법은 담체 교환 기술과 같은 극복해야 될 많은 문제점을 안고 있다. 따라서, 상기 방법은 산업적 적용에 있어서 근본적으로 적합하지 않다.

상기 기술한 바와 같이 배치식 배양 방법 및 유가식 배양 방법에 의해 L-글루탐산을 고수율로 제조하기 위한 배양 조건이 세균 증식의 완전한 종료를 요구함에 따라서 L-글루탐산을 제조하기 위한 세균 능력이 배양 후반기에 감소되어 생산성을 향상시키기 곤란하다. 게다가, 통상적인 연속 배양 방법에 있어서는 세균을 발효기에 추가로 첨가하거나 세균을 재순환시키는 시스템이 요구되므로 하기와 같은 산업적 적용을 달성하기 위해서는 많은 문제점을 안고 있다: 전체 시스템이 복잡하고 세균 오염 가능성이 커지며 세균 증식을 종료시키는 조건하에서의 배양으로 인해 높은 생산성을 저속시키기가 매우 어려워질 수 있다.

L-글루탐산에 대한 필요성의 증대를 충족시키고 저렴한 비용으로 L-글루탐산을 제조하기 위해 L-글루탐산 발효의 생산성이 종래의 것보다 높은 수준으로 증가 되어야만 한다.

본 발명이 해결하려는 과제는 세균 증식 및 L-글루탐산 생산을 동시에 발효기내에서 촉진시킴을 포함하여, 간편한 장치내에서 L-글루탐산 발효의 고생산성 연속 배양 방법을 개발하는 것이다.

본 발명가들은 종래의 발효 방법에 의한 L-글루탐산의 제조방법을 개량시키기 위해 연구를 수행한 결과, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는, L-글루탐산 생산능을 갖는 미생물을 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지에 접종하고, 탄소원 및 세균 증식 촉진효과를 갖는 영양소 모두의 주입하에, 세균 증식을 종료시키지 않으면서 온도, 계면활성제, 항생제, 비오틴 농도 등을 조절하면서 연속 배양을 수행하여 연속 배양동안에 고생산성 및 고수율로 L-글루탐산을 생산할 수 있다는 것을 밝혔다. 달리 말해서, 본 발명가들은 세균 증식을 종료시키는 종래의 조건하에서는 이루어지지 않는 보다 높은 생산성을 갖는 신선한 세포를 증식시키면서 L-글루탐산을 효과적으로 생산할 수 있다는 발견 및 배양액이 추출된 이후에도 세균의 증식으로 인해 발효기내 세균 세포 중량이 유지될 수 있어 장시간의 연속 배양 동안에 고생산성이 유지될 수 있다.는 발견에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 한가지 양태에서 본 발명은 탄소원 및 질소원을 포함하는 액체 배지에 L-글루탐산 생산능력을 갖는 미생물을 접종하고 탄소원 및 세균 중식 촉진효과를 갖는 영양물을 세균 증식을 위해 주입하는 연속적인 L-글루탐산 발효를 수행하여 배양액중에서 생산되어 축적된 L-글루탐산을 수거하는 것을 특징으로하는 L-글루탐산의 제조 방법을 제공한다.

바람직하게는 미생물은, 비오틴 농도 10㎍/ℓ 이상의 액체배지에서 비오틴 작용 억제물질의 첨가없이 배양하는 경우에 L-글루탐산을 생산하는 특성을 갖는 미생물이다.

본 발명에 따라, L-글루탐산 축적능을 갖는 미생물을 특별한 제한 없이 사용한다. 예를 들어 하기의 세균 균주가 포함될 수 있다:

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM BP-4172(AJ 12821)

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM BP-1363(AJ 12300)

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM BP-5189(AJ 13029)

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067

브레비박테리움 플라붐 FERM BP-4173(AJ 12822)

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020

브레비박테리움 사카로리티컴(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC 14066

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM BP-4174(AJ 12823)

코리네박테리움 아세토액시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870

일반적으로, L-글루탐산을 축적하는 세균중에서, 몇몇 세균은 비오틴 작용 억제물질의 존재하에 과량의 비오틴을 포함하는 배양 배지에서 L-글루탐산을 축적하는 반면에, 몇몇 세균 균주는 비오틴 작용 억제물질의 부재하에 L-글루탐산을 축적한다는 사실은 널리 공지되어 있다. 이들 중에서 비오틴 작용 억제물질의 부재하에 L-글루탐산을 축적하는 균주가 본 발명에 따른 바람직한 미생물이다. 더욱 특히, 본 발명에 따라, L-글루탐산 축적능력을 갖는 미생물은 바람직하게는 비오틴작용 억제물질의 첨가없이 10㎍/l이상, 예를 들어, 10 내지 1000㎍/l의 농도의 비오틴을 포함하는 액체 배지에서 배양되는 경우에 L-글루탐산을 생산하고 축적하는 성질을 갖는 미생물이다.

더욱이, FERM BP-4172(AJ 12821), FERM BP-4173(AJ 12822) 및 FERM BP-4174(AJ 12823)[참조: 미심사 일본 특허 공개 공보 제6-23779호]와 같이 비오틴 농도 10㎍/l 이상, 예를 들어, 10 내지 1000㎍/l의 액체 배지에서 배양될 때 저하된 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성 및 L-글루탐산 생산 능력을 갖는 돌연변이 균주와 같이 L-글루탐산을 생산하고 축적하는 성질을 갖는 세균 균주가 사용되는 경우 세균 균주는 계면활성제 및 항생제와 같은 비오틴 작용을 억제물질의 첨가를 요구하지 않음으로써 L-글루탐산 발효를 위한 배양이 장시간 동안 용이하게 조제될 수 있으며 L-글루탐산이 비용면에서 저렴하게 생산될 수 있다. 또한, FERM BP-5189(AJ 13029)[참조: 국제공개공보 제WO 96/06180호]와 같이, 비오틴 작용 억제물질에 대한 온도 민감성 돌연변이를 가지며 비오틴 작용 억제품질의 부재하에 과량의 비오틴을 포함하는 배양 배지에서 L-글루탐산의 축적능을 갖는 돌이변이 균주에 대해서도 마찬가지이다.

본 발명에 따라 사용되는 배지로서 탄소원, 질소원, 무기염류 및 아미노산 및 비타민과 같은 미량 유기물질을 적절히 포함하는 일상적인 액체 배지가 만족스럽다. 탄소원으로서 글루코즈, 슈크로즈, 프럭토즈, 갈락토즈 및 락토즈와 같은 당; 이들 당을 포함하는 당화전분 용액; 고구마 당밀, 사탕무우 당밀 및 줄기 당밀; 및 추가로 아세트산과 같은 유기산, 에탄올 및 글리세린 등과 같은 알콜이 사용될 수 있다. 질소원으로서, 암모니아 가스, 액상 암모니아, 암모늄염, 요소, 질산염, 보충용으로서 유기 질소원, 예를 들어 오일 케이크, 콩 단백질 가수분해 용액(가수분해물), 카제인 분해산물, 기타 아미노산, 옥수수 침지액, 효모 추출물, 고기 추출물 및 펩톤과 같은 펩타이드, 발효를 위해 사용되는 여러가지 세균 추출물 및 이의 가수분해 산물을 첨가할 수 있다. 무기염으로서, 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등이 적절하게 첨가될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 미생물이 이의 중식을 위해 특정한 영양소를 요구하는 경우 영양소는 제제 또는 동일한 것을 포함하는 천연 산물로서 첨가된다. 추가로 경우에 따라 소포제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 배양 배지의 탄소원 농도는 5g/l 이하로 유지하는 것이 바람직하다. 상기 이유는 배양액의 추출로 인한 당 함량의 손실을 최소로 유지하기 위함이다.

미생물의 배양은 일반적으로 pH 5 내지 8 및 25 내지 45℃의 온도범위에서 호기조건하에 수행된다. 배양액의 pH를 무기산 또는 유기산 및 알칼리성 물질 및 추가로 요소, 탄산칼슘 및 암모니아 가스를 사용하여 범위내에 결정된 값으로 조정할 수 있다. 산소 주입율이 상승시켜야 하는 경우, 산소를 공기에 첨가하여 산소 농도를 21% 이상으로 유지하고 압력 또는 교반 속도의 상승하에서 배양하며 통기율을 상승시키는 방법이 사용될 수 있다.

비오틴 작용 억제물질의 존재하에 L-글루탐산을 축적하는 세균 균주의 연속 배양을 수행하는 경우, 적절한 온도(25 내지 40℃), 적당한 계면활성제 농도(폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노팔미테이트; 100 내지 5000mg/l), 적당한 항생제 농도(페니실린; 0.1 내지 50U/ml) 및 적당한 비오틴 농도(5 내지 5000 ㎍/ℓ)에서 어느 정도로 세균 증식을 제어하고 유지시킴으로써 L-글루탐산을 세균 증식과 함께 고수율 및 고생산성으로 생산한다.

브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869의 경우, 예를 들어, 세균 증식의 제어 및 유지가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트를 사용하여 수행되는 경우에, 이의 농도는 100 내지 1000mg/l이 바람직하다.

효과적으로 L-글루탐산을 축적하기 위해 경우에 따라 비오틴 또는 이의 유도체가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 추가로 지방산 또는 이의 에스테르 또는 페니실린 또는 이의 유도체가 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 비오틴 또는 이의 유도체의 첨가는 장시간 동안 세균이 L-글루탐산의 생산능을 유지하는데 효과적이다. 이의 첨가 양은 배양액에서 약 5 내지 5000㎍/l의 최종 농도로 조정되는 것이 만족스럽다. 지방산으로서, 탄소수 12 내지 18의 포화 고지방산이 바람직하다. 이의 에스테르는 글리세롤 에스테르, 솔비탄 에스테르, 슈크로즈 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 중에서 선택된다. 지방산 또는 이의 에스테르 및 페니실린 또는 이의 유도체가 첨가되는 경우에 이들은 정상 농도 즉, 증식의 정지없이 증식이 유지될 수 있는 농도 미만의 최종농도로 첨가된다. 예를 들어, 지방산 또는 이의 에스테르가 첨가되는 경우에 이의 농도는 약 100 내지 1000mg/l가 적합하고; 페니실린 또는 이의 유도체가 첨가되는 경우 배지내의 이의 농도는 약 0.2 내지 10U/ml가 적합하다.

연속적인 L-글루탐산 발효에서, 탄소원 및 세균 증식 촉진효과를 갖는 영양소(성장 촉진 영양물) 모두가 주입된다. 탄소원의 예는 상기 언급한 것을 포함한다. 증식 촉진 영양소는 영양소가 세균 증식을 촉진하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 용어 "세균 증식"은 세포수의 증가를 말한다. 증식 촉진 영양소의 예는 질소원, 무기염류 및 아미노산 및 비타민과 같은 미량 유기 영양물을 포함한다.

탄소원 및 증식 촉진 영양소를 세균 증식 및 L-글루탐산 생산 모두를 유지하는데 효과적인 양으로 주입된다. 탄소원 및 증식 촉진 영양소를 용액의 형태로 주입하는 것이 바람직하다. 둘 다를 포함한 용액 또는 별개로 이를 포함하는 용액을 주입 용액 또는 용액들로서 주입할 수 있다.

배치식 배양 또는 유가식 배양은 본 발명에 따른 연속 배양의 초기 단계에서 만족스럽게 수행하여 L-글루탐산의 농도 및 세균 세포 농도를 증가시킬 수 있으며, 이후에 연속 배양(및 추출)을 개시할 수 있거나; 고농도의 세균을 접종할 수 있고 일단 배양은 개시되면 연속 배양을 수행할 수 있다.

주입 용액의 공급 및 추출은 적절한 단계에서 개시되어야만 한다. 주입용액의 공급 시간을 반드시 추출 시간에 맞출 필요는 없다. 주입 용액의 공급 및 추출은 연속적으로 또는 간헐적으로 만족스럽게 수행될 수 있다. 주입 용액에 상기 언급한 바와 같은 세균 증식을 위해 요구되는 영양소를 첨가하여 연속적인 세균 증식을 촉진시킨다.

생산성은 다음 수학식에 의해 계산된다.

[수학식 1]

본 발명의 방법에 따라서, L-글루탐산의 생산성은 유가식 배양 방법(배양 시간 40시간)과 비교하여 약 2배로 증가된다.

세포 재순환 배양 방법과 비교하여, L-글루탐산의 생산 능력은 장시간동안 본 발명의 배양 방법에 의해 유리하게 유지될 수 있음이 명백하다. 이것은 본 발명의 연속 배양 방법 및 세포 재순환 배양 방법에 의한 배양 전반에 걸쳐 L-글루탐산을 생산하는 능력 변화의 결과로부터 명백하다. 도 1에 나타낸 배양 조건은 문헌[참조: 미심사 일본 특허공개공보 제62-48394호]에 기술된 방법에 따른다. 하지만 본 발명의 연속 배양 방법에서는 500mg/l의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트가 첨가됨에 이어서 글루코즈, KH₂PO₄, MgSO₄, 콩 단백질 가수분해물 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트 및 배양액의 추출물을 포함하는 주입 용액의 연속 공급을 수행했다. 따라서 본 발명의 방법은 세포 재순환 연속 배양보다 고농도로 L-글루탐산의 생산성을 안정하게 유지할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 사용되는 발효 장치의 하나의 대표적인 예는 도 2에 나타내었다. 바람직하게는, 고생산성을 갖는 신선한 세균 세포를 증식시키면서 L-글루탐산을 생산하는 연속 배양 방법은 일반적으로 실질적인 배양 제어 관점에서 단일 발효기내에서 수행된다. 하지만 세균을 증식시키면서 L-글루탐산을 생산하는 어떤 연속 배양 방법도 이의 발효기의 수에 관계없이 만족할만하다. 발효기의 용량이 적기 때문에 때때로 여러개의 발효기가 사용될 수 있다. 상기 경우에 발효기가 연속 배양을 위해 직렬 또는 병렬로 함께 연결되어도 각각의 발효기의 배양 조건이 세균 증식하에 L-글루탐산을 생산하도록 하는 조건인 한 L-글루탐산의 고생산성이 성취될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 L-글루탐산은 고생산율로 연속적으로 생산될 수 있다. 지속적인 배양은 연속 생산 공정에 의해 달성될 수 있으며 이는 힘든 작업을 감소시킨다. 더욱이, 상기 장치는 세포 재순환 배양 방법 및 다단계 연속 배양 방법 등에 의한 것과 비교하여 단순하여 본 발명의 방법이 비용의 절감 및 세균 오염을 감소시키는데 효과적이다.

실시예

본 발명은 하기의 실시예에서 상세하게 설명될 것이다.

실시예 1

글루코즈 30g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄·7H₂O 0.4g/l, 요소 4g/l, FeSO₄·7H₂O 20mg/l, MnSO₄·4H₂O 20mg/l, 콩 단백질 가수분해물 15ml/l 및 비오틴 300μg/l를 포함하는 배지(30ml)를 500ml 플라스크에 붓고 이어서 115℃에서 10분동안 가열하에 살균시킨다. 이를 실온으로 냉각함에 이어서 30℃에서 24시간 동안의 종균 배양을 위해 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869를 접종했다.

글루코즈 60g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄ 1g/l, 콩 단백질 가수분해물 15ml/l 및 비오틴 300μg/l를 포함하는 배지(270ml)를 미리 살균된 1ℓ 발효기에 붓고 이어서 상기 언급한 종균 배양액(30ml)을 첨가하고 수득한 배양액을 30℃에서 배양했다. 통기율은 분당 300ml이었고 NH₃ 가스를 사용하여 pH를 7.5로 유지했다.

배양을 개시한지 5시간 후에 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트를 최종 농도 500mg/l로 첨가했다. 발효기에, 글루코즈 180g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄ 1g/l, 콩 단백질 가수분해물 15ml/l 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트 500mg/l를 포함하는 주입 용액을 시간당 30ml로 연속적으로 첨가하고 동일한 용적의 배양액을 추출하여 반응기내 작용 용적을 일정한 용적으로 유지했다.

추출된 모든 배양액의 당 농도는 5g/l이하이었다.

도 3은 배양 전반에 걸친 비증식율(specific growth rate)의 변화를 보여준다. 여기에서, 용어 "비증식율"은 매우 짧은 시간 dT내에 증식하는 세균의 농도 dX가 이때에 존재하는 세균 농도 X와 정비례하는 경우에 비례상수를 의미하고 상수는 l/h의 단위로 나타낸다. 농도 X는 배양액의 단위 용적내에 포함된 세포의 건조 중량("g/l"로서 표시)이다. 추가로, 비증식율의 상대값은 대수증식의 초기단계에서 비증식율이 1로서 정의되는 상대값을 의미한다. 유가식 배양 방법과는 달리, 세균 증식은 본 발명의 연속 배양 방법에 의한 배양 전반에 걸쳐 연속적이다.

40시간동안 연속 배양한 결과는 L-글루탐산의 수율이 56%이었고 이의 생산성이 5g/l/hr이었다. 수율은 배양에서 수득한 L-글루탐산 총량을 배양에서 사용된 당의 총량으로 나누어 계산했고 여기에서 양은 중량을 기준으로 한다. 생산성은 이전에 언급한 수학식에 따라 계산된다.

비교를 위해 유가식 배양 방법을 또한 조사했다.

특히, 글루코즈 60g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄ 1g/l, 콩 단백질 가수분해물 15ml/l 및 비오틴 300μg/l를 포함하는 배지(270ml)를 미리 살균한 1ℓ 발효기에 붓고 이어서 동일한 조건하에서 배양을 위해 상기 언급한 종균 배양액을 첨가했다.

배양을 개시한지 5시간 후에, 보다 많은 양의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트를 최종 농도 2000mg/l에 첨가한다. 시간당 6ml로 글루코즈 400g/ℓ 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트 2000mg/l을 포함한 주입 용액을 연속적으로 첨가했다. 하지만, 동일한 용적의 배양액을 추출하지 않았기 때문에 발효기내 작용 용적은 증가했다. 도 3에 나타낸 바와 같이 이들 조건하에서 세균 증식은 20시간 전에 종료되었다. 따라서 상기 배양은 40시간까지 계속되어 수득한 결과는 L-글루탐산의 56% 수율 및 이의 생산성 2.6g/ℓ/hr이었다. 수율은 상기와 같은 동일한 방법으로 계산했다. 생산성은 최종 배양액의 단위 용적당 배양에서 생산된 L-글루탐산의 양(g/1)을 배양시간(시간)으로 나누어 계산했다.

본 발명의 연속 배양 방법은, 유가식 배양 방법과 비교하여, L-글루탐산의 생산이 단위 시간당 2배로 생산성이 현저히 향상되었다.

실시예 2

글루코즈 30g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄·7H₂O 0.4g/l, 요소 4g/l, FeSO₄·7H₂O 20mg/l, MnSO₄·4H₂O 20mg/l, 콩 단백질 가수분해물 15ml/l 및 비오틴 300μg/l를 포함하는 배지(30ml)를 500ml 플라스크에 붓고 이어서 115℃에서 10분동안 가열하에 살균시킨다. 이를 실온으로 냉각함에 이어서 30℃에서 24시간동안의 종균 배양을 위해 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM BP-4172(AJ 12821)를 접종했다.

글루코즈 60g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄ 1g/l, 콩 단백질 가수분해물 15ml/l 및 비오틴 300μg/l를 포함하는 배지(270ml)를 미리 살균된 1ℓ 발효기에 붓고 이어서 상기 언급한 종균 배양액(30ml)을 첨가하고 수득한 배양액을 30℃에서 배양했다. 통기율은 분당 300ml이고 pH를 NH₃ 가스를 사용하여 7.5로 유지했다.

상기 배양액에 글루코즈 300g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄ 1g/l, 및 콩 단백질 가수분해물 15ml/l를 포함하는 주입 용액을 시간당 25ml로 연속적으로 첨가하고 동일한 용적의 배양액을 추출하여 발효기내 작용 용적을 일정한 용적으로 유지했다.

추출된 모든 배양액의 당 농도는 5g/l이하이었다.

도 4는 배양 전반에 걸친 비증식율의 변화를 보여준다. 세균 증식이 배양 전반에 걸쳐 계속된다는 것을 나타낸다.

40시간동안 연속 배양한 결과는 L-글루탐산의 수율이 56%이었고 이의 생산성이 6.6g/ℓ/hr이었다.

비교하기 위해 유가식 배양 방법을 또한 조사했다.

특히, 글루코즈 60g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄ 1g/l, 콩 단백질 가수분해물 15ml/ℓ및 비오틴 300μg/l를 포함하는 배지(270ml)를 미리 살균한 1ℓ 발효기에 붓고 이어서 동일한 조건하에서 상기 언급한 종균 배양액(30ml)을 첨가했다. 시간당 7ml로 글루코즈 500g/ℓ을 포함한 주입 용액을 연속적으로 40시간까지 연속적으로 첨가했다. 수득한 결과는 L-글루탐산의 수율이 54%이었고 이의 생산성이 3.2g/ℓ/hr이었다. 수율 및 생산성은 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 방법으로 계산했다.

유가식 배양 방법과 비교하여, 본 발명의 연속 배양 방법에 의한 L-글루탐산의 생산은 단위 시간당 2배로 생산성이 현저히 향상되었다.

실시예 3

글루코즈 30g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄·7H₂O 0.4g/l, 요소 4g/l, FeSO₄·7H₂O 20mg/l, MnSO₄·4H₂O 20mg/l, 콩 단백질 가수분해물 15ml/ℓ 및 비오틴 300μg/l를 포함하는 배지(30ml)를 500ml 플라스크에 붓고 이어서 115℃에서 10분동안 가열하에 살균시킨다. 이를 실온으로 냉각함에 이어서 30℃에서 24시간동안의 종균 배양을 위해 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM BP-4172(AJ 12821)을 접종했다.

글루코즈 60g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄ 1g/l, 콩 단백질 가수분해물 15mg/l 및 비오틴 300μg/l를 포함하는 배지(270ml)를 미리 살균된 1ℓ 발효기에 붓고 이어서 상기 언급한 종균 배양액을 첨가하고 수득한 배양액을 30℃에서 배양한다. 통기율은 분당 300ml이었고 pH를 NH₃ 가스를 사용하여 7.5로 유지했다. 상기 배양액에 글루코즈 180g/l, KH₂PO₄ 1g/l, MgSO₄ 1g/l, 및 콩 단백질 가수분해물 15ml/l를 포함하는 주입 용액을 시간당 40ml로 연속적으로 첨가하고 동일한 용적의 배양액을 추출하여 반응기내 작용 용적을 일정한 용적으로 유지했다.

추출된 모든 배양액의 당 농도는 5g/l이하이었다.

100시간동안 연속 배양한 결과는 L-글루탐산의 수율이 55%이었고 이의 생산성이 8.3g/ℓ/hr이었다. 수율 및 생산성은 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 방법으로 계산했다.

도 5는 배양 전반에 걸친 L-글루탐산의 생산능의 변화를 보여준다. 이것은 장시간에 걸쳐 활성이 높은 수준으로 유지되었음을 나타낸다. L-글루탐산을 생산하는 활성도는 세포 중량(건조 중량: g)을 기준으로 단위 시간(hour)당 생산되는 L-글루탐산(g)의 양으로서 나타냈다.

본 발명은 세균 증식 및 L-글루탐산 생성을 동시에 발효기내에서 촉진시킴을 포함하여, 간편한 장치내에서 L-글루탐산 발효의 고생산성 연속 배양 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명의 배양 방법 및 세포 재순환 배양 방법에 의한 배양 전반에 걸친 L-글루탐산의 생산 활성도의 변화를 보여주고,

도 2는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 발효기의 한가지 예를 보여주며(단일 발효기),

도 3은 실시예 1의 연속 배양 방법 및 비교되는 유가식 배양 방법에서 관찰된 시간에 따른 비증식율의 변화를 보여주고,

도 4는 실시예 2의 연속 배양 방법 및 비교되는 유가식 배양 방법에서 관찰된 배양 전반에 걸친 비증식율의 변화를 보여주며,

도 5는 실시예 3의 연속 배양 방법에서 관찰된 배양 전반에 걸친 L-글루탐산의 생산 활성도의 변화를 보여준다.

Claims (3)

1. L-글루탐산 생산능력을 갖는 미생물(여기서, 미생물은 비오틴 농도가 10㎍/ ℓ 이상인 액체 배지중에서 비오틴 작용 억제물질의 첨가 없이 배양되는 경우 L-글루탐산을 생산하는 성질을 갖는 미생물이다)을 탄소원과 질소원을 함유하는 액체배지에 접총하고;

   (1) 탄소원 및 세균 증식 촉진 효과를 갖는 영양물질 둘다를 공급하여 미생물이 증식됨과 동시에 L-글루탐산이 생산되도록 하고 (2) 배양액을 연속적으로 발효기로부터 추출하는, 연속적인 L-글루탐산 발효를 수행한 다음;

   배양액에 생성되어 축적된 L-글루탐산을 수거함을 포함하여, 단일 발효기를 사용한 연속 발효에 의한 L-글루탐산의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 미생물이 저하된 a -케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성을 갖거나 비오틴 작용 억제물질에 대한 온도 민감성 돌연변이를 갖는 미생물인 방법.
3. 제1항에 있어서, 미생물이 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네 박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물인 방법.

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