KR970001829B1

KR970001829B1 - 생분해성 고분자 PHA(Polyhydroxyalkanoate)의 유가식 발효생산 방법

Info

Publication number: KR970001829B1
Application number: KR1019930018449A
Authority: KR
Inventors: 임대우; 이명섭; 정성구; 장호남; 김범수; 이승철
Original assignee: 제일합섬 주식회사; 박홍기
Priority date: 1993-09-14
Filing date: 1993-09-14
Publication date: 1997-02-17

Abstract

내용 없음.

Description

생분해성 고분자 PHA(Pdlyhydroxyalkanoate)이 유가식 발효생산 방법

제1도는 본 발명에 따른 PHA 생산 공정의 개략도이다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 발효조 2 : 포도당 분석기

3 : 컴퓨터 4 : 공급기질

5 : 막, 모듈 6 : 유출액조

7,7' : 페리스탈틱 펌프(peristaltic pump) 8 : 기질주입 펌프

본 발명은 생분해성 고분자 PHA(Polyhydroxyalkanoate)의 경제적인 발효생산 공정에 관한 것으로, 특히 기질 농도의 제어를 자동화한 유가식 공정에 의한 고농도, 고수율의 PHA 제조방법에 관한 것이다.

PHA(Polyhydroxyalkanoate)는 미생물의 체내에 에너지 저장물의 형태로 축적되는 폴리에스터로서, 그중의 하나인 PHB(polyhydroxybutyrate)가 1925년 레모이그네(Lemoigne)에 의해 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 처음으로 발견되었다. PHA는 합성 고분자와 견줄만한 우수한 성질을 가진 생분해성 고분자로, 식품 포장용 및 일회용 제품포장용 등으로 사용된다면 합성고분자 물질의 난분해성으로 인한 심각한 공해문제를 해결할 수 있게 된다. PHB는 영국의 ICI사와 오스트리아의 Chimie Linz사에 의해 포도당, 설탕 등으로부터 상업적으로 생산되고 있으며, 이보다 물성이 우수한 P(HB-co-HV)(polyhydroxybutyrate-co-valerate) 공중합체는 포도당과 프로피온산의 혼합기질로부터 ICI 사에 의해 생산되고 있지만 현재의 높은 제조원가로는 기존의 비분해성 플라스틱을 대체하기가 어려운 실정이므로 제조원가를 절감하는 공정에 대한 연구가 꾸준히 진행되고 있다.

유가식 배양은 발효도중 기질을 첨가하면서 배양하는 방식으로, 균체성장 및 유용물질 생산을 위해서는 배양액 중의 기질 농도를 최적 상태로 유지하는 것이 필수적이다.

종래, 산업계와 실험실에서 행해져 온 유가식 배양방법은 기질 농도를 측정할 수 있는 센서의 부족 또는 부재로 인해 경험적인 방법에 의존하거나 많은 시간과 노동력을 필요로 하는 방법들을 사용하므로서 최적 생산조건을 정확히 유지하는 것이 힘들었다. 따라서, 본 발명의 목적은 PHA를 고농도, 고수율로 제조하기 위한 유가식 발효 생산방법을 제공하는데 있다.

상기 목적 뿐만 아니라 용이하게 표출되는 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 기질농도의 균일한 제어를 자동화하고 균체성장기와 PHA 생산기의 pH 조절용 알카리로 특정화합물을 사용하므로서 경제적으로 PHA를 얻을 수 있었다.

본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

제1도는 본 발명에 따른 PHA 생산공정의 개략도이다.

먼저, PHA 제조에 사용되는 통상의 배지성분을 발효조(1)에 투입한 후, PHA 생성능을 갖는 균주를 접종하고 공지의 조건으로 배양한다. 배양중 일정시간 간격으로 페리스탈틱 밸브(7)를 가동시켜 발효액을 일정량 취하여 막모듈(5)을 통과시키므로서 균체와 배양액을 분리한 후, 균체는 발효조(1)로 재순화시킨다. 균체와 배양액의 분리로 인하여 일정량의 배양액이 모아지면 페리스탈틱 밸브(7')가 작동하여 배양액이 포도당 분석기(2)로 이송되고, 포도당 분석기(2)내에서는 포도당의 농도가 측정된 후 유출액조(6)로 이송되어 저장된다.

한편, 측정된 포도당의 농도는 컴퓨터(3)에 입력되고 미리 설정된 값 이상이 될 경우에는 컴퓨터(3)가 정보를 명령하여 기질주입펌프(8)를 작동하여 적량의 공급기질(4)을 발효조(1)에 공급하므로서 일정한 포도당 농도가 유지되도록 하는 것이다.

포도당 분석기(2)의 샘플링시간 간격은 컴퓨터(3) 프로그램을 통하여 임의로 조절할 수 있으며, 측정된 포도당 농도로부터 미리 설정된 농도가 유지되도록 ON/OFF, PI, PID, 적응제어 방식 등 여려 제어방법을 이용하여 기질주입펌프(8)를 작동시킨다.

포도당을 탄소원으로 하면 PHA를 생성할 수 있는 공지의 균주가 본 발명에서는 모두 사용될 수 있고, 본 발명에서는 일례로서 알카리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus)를 사용하였다. 또한, 공지 PHA 생성능을 갖는 균주의 배양조건은 여러 가지 문헌에 공지된 방법을 사용하였을 뿐만 아니라 배지조성 및 미량원소도 공지의 것을 사용하였다. 막모듈(5)에서 분리된 매양액에는 배지조성성분 뿐만 아니라 발효산물이 함유되어 있는 것이고, 측정된 포도당의 농도가 기준설정치 이상일 경우에는 기질주입펌프(8)가 작동되지 않는 것이다.

본 발명에서와 같은 일련의 조작은 컴퓨터 프로그램으로서 자동으로 조절될 수 있다. 그러나, 본 발명에서는 계속해서 배양액중의 일부를 샘플링해야 하므로 발효액의 체적이 줄어드는 문제점이 나타날 수도 있지만, 주입기질(4)이 투입되므로서 해결될 수 있고, 샘플링양이 200ml 이내이므로 스케일업되어 발효조가 커지게 되면 큰 문제가 되지 않는 것이다.

한편, PHA와 생고분자의 생산에 있어서는 균체 성장기와 PHA 생산기로 구분되는 2단계 배양을 실시한다. 제1단계인 균체 성장기에서는 탄소원, 질소원을 비롯한 모든 영양분을 충분히 공급해 주어야 하며, 제2단계인 PHA 생산기에서는 질소원을 제한시키고 탄소원을 충분히 유지시켜 주어야 한다. 본 발명의 실시예에 이용된 균주인 Alcaligenes eutrophus의 예를들면, 탄소원으로 포도당, 질소원으로 암모니아를 이용하는 경우, 균체 성장기에 최적인 포도당 농도는 10∼20g/l로 알려져 있으며, 질소원이 제한되지 않도록 pH 제어용 알카리로서 암모니아수를 이용하여 암모니아를 공급한다. PHA 생산기에 최적 농도인 10∼30g/l의 포도당을 유지하고, 질소원을 제한 시키기 위해 pH 제어용 알카리를 암모니아수에서 NaOH 나 KOH로 바꾸어 주어야 한다. 또한, 기질농도가 너무 높으면 균체 성장 및 PHA 생산이 저해되므로 발효전 시간에 걸쳐서 탄소원의 농도를 일정하게 유지하여야 한다.

본 발명은 알카리게네스 유트로퍼스 이외에 보다 우수한 균주를 이용하여 포도당, 설탕, 유산, 유당, 갈락토스, 에탄올, 메탄올, 전분, 당밀 등 다양한 탄소원으로부터 PHB를 포함하는 PHA를 생산하는 데에도 이용될 수 있다.

이하, 본 발명에 의한 기질제어 방식에 따른 PHA 생산의 구체적인 실시예를 설명한면 다음과 같다.

실시예 1

탄소원으로 포도당을 이용할 수 있는 변이주 알카리게네스 유토로퍼스(Alcaligenes eutrophus : NICB 11599)를 균주로 사용하여, 초기 배지 조성은(L당) 포도당 20g, (NH₄)SO₄4g, KH₂PO₄13.3g, MgSO₄7H₂O 1.2g, 구연산 1.7g, 미량 원소용액 10ml로 하였으며, 미량 원소용액의 조성은(L당) FeSO₄·7H₂O 10g, ZnSO₄·7H₂O 2.25g, CuSO₄·5H₂O 1g, MnSO₄-4.5H₂O 0.5g, CaCl·2H₂O 2g, Na₂B₄O₇·10H₂O 0.23g, (NH₄)₆Mo₇O₂₄0.1g, HCI 10ml로 하였다.

2.5L 발효조(한국발효기)에 700mL의 초기 배지를 투임하고 종배양된 배양액 100mL를 접종하여 배양온도 34℃, pH 6.8로 조절하면서 배양하였다. 공기 유속은 1vvm, 교반의 배양액 중의 산소가 제한되지 않도록 300∼1000rpm으로 조절하였다.

배양액중의 포도당 농도는 10분에 한 번씩 측정하면서 15g/l로 제어하기 위하여 700g/L의 포도당 용액이 자동적으로 공급되도록 하였다. 30시간이 경과하여 균체 농도가 70g/l에 이르렀을 때 pH 제어용 알카리를 암모니아수에서 10N NaOH/KOH 용액으로 교환하여 질소원을 제한한 결과, 50시간에 균체 농도 159g/l, PHB 농도 121g/l를 얻었다. 이때에 PHB 함량은 균체 건조 무게의 76%, 생산성은 2.41g/l/h였다. 소모된 포도당에 대한 PHB 생산수율은 (0.3g PHB/g 포도당)이었다. 이 결과는 알카리게네스 유트로퍼스를 이용하여 PHB를 생산하는 방법으로서 지금까지 문헌에 보고된 결과중 PHB 농도 및 생선성에 있어서 가장 높은 수치이다.

실시예 2

26시간이 경과하여 균체 농도가 62g/L에 이르었을 때 질소원을 제한하면서 동시에 700g/L 포도당 용액 1L에 프로피온산 50mL를 혼합한 용액을 공급한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 행하였다. 그 결과, 46시간에 4.3몰%의 HV(hydroxyvalerate) 단량체가 포함된 P(HB-co-HV) 공중합체 117g/L와 균체 농도 158g/L를 얻었다. 이때에 PHA 함량은 균체 건조무게의 74%, 생산성은 2.54g/l/h였으며, 배양액중의 프로피온산 농도는 42시간까지 0.77g/L 이하로 낮게 유지되었다.

실시예 3

28시간에 균체 농도가 66g/L에 이를 때까지 균체를 성장시키다가, 이후 질소원을 제한하면서 700g/L 포도당 용액 1L에 프로피온산 100mL를 혼합한 용액을 공급한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 행하였다. 그 결과, 44.5시간에 12.2몰%의 HV(hydroxyvalerate) 단량체가 포함된 P(HB-co-HV) 공중합체 74g/L와 균체 농도 129g/L를 얻었다. 이때의 PHA 함량은 균체 건조무게의 58%, 생산성은 1.67g/l/h 였으며, 배양액중의 프로피온산 농도는 0∼1.27g/L 사이로 유지되었다.

실시예 4

37.5시간에 균체 농도가 72g/L에 이를 때까지 균체를 성장시키다가, 이후 질소원을 제한하면서 700g/L 포도당 용액 1L에 프로피온산 150mL를 혼합한 용액을 공급한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 행하였다. 그 결과, 39시간에 13.9몰%의 HV(hydroxyvalerate) 단량체가 포함된 P(HB-co-HV) 공중합체 64g/L와 균체 농도 113g/L를 얻었다. 이때의 PHA 함량은 균체 건조무게의 57%, 생산성은 1.65g/l/h였다. 배양액중의 프로피온산 농도는 7.55g/L까지 점점 증가하는 경향을 보였다.

Claims

발효액의 일부를 샘플링하여 균체와 배양액을 분리시켜, 균체는 재순환시키고 배양액은 포도당 분석기에 통과시켜 포도당 농도를 측정한 후 측정치를 컴퓨터에 입력하고 미리 설정된 농도 이하일 경우 공급기질에 주입되도록 하여 자동적으로 기질농도를 일정하게 유지시킴을 특징으로 하는 기질 제어 방식에 의한 생분해성 고분자 PHA의 유가식 발효생산 방법.
제1항에 있어서, pH 제어용 알카리로 균체 성장기에는 암모니아수를 공급하고, PHA 생산기에는 NaOH 또는 KOH를 공급, 질소원 농도를 조절함을 특징으로 하는 유가식 발효생산 방법.