KR100198039B1 - 발효에 의한 l-글루탐산의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 야생형 균주 브레비박테리움(Brevibacterium)속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)속과 비교하여 더 낮은 α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 갖는 상기 브레비박테리움 속 또는 코리네박테리움 속으로부터 유도된 L-글루탐산 생성 미생물의 돌연변이체를 바이오틴 활성 억제 물질을 첨가하지 않은, 농도가 10내지 1000 μg/l인 바이오틴-함유 액체 영양 배지중에서 배양시키고, 배양액중에 L-글루탐산을 생성 및 축적시키고 상기 배양액으로부터 L-글루탐산을 회수함을 특징으로 하는 발효법에 의해 L-글루탐산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라 더 경제적이고 더 효율적인 방식으로 발효법에 의해 L-글루탐산을 산업적으로 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 발효에 의해 L-글루탐산을 제조하는 방법에 관한 것이다. L-글루탐산은 식품, 약제 및 화학물질 등에 중요한 아미노산이다.
과거에는, L-글루탐산의 산업적 제조는 브레비박테리움(Brevibacterium)속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)속에 포함되는 미생물을 사용한 발효법에 의해 수행하였다. 선행 기술에 따른 L-글루탐산 발효법에서, 바이오틴은 미생물의 생장을 위한 필수적인 요소이며 바이오틴 또는 배양 배지에 함유된 바이오틴-활성물질의 농도가 L-글루탐산의 분비에 큰 영향을 미친다고 공지되어 있다. 따라서, 미생물을 배양하는 다양한 방법이 L-글루탐산의 생산성을 최대화하기 위해 사용되어 왔다. 예를 들면, 미생물의 생장을 위해 요구되는 바이오틴 또는 바이오틴-활성 물질의 제한된 양을 함유하는 배지에서 배양을 수행한다. 또 다른 방법으로서, 비싸진 않지만 바이오틴을 너무 많이 함유하여 고수율의 L-글루탐산을 수득할 수 없는 사탕수수 또는 사탕무우 당밀등과 같은 물질을 탄소원으로서 사용하는 경우에는, 페니실린(예: 페니실린 G, F, K, O, V, X 등) 또는 고급 지방산 또는 이의 유도체로 구성된 계면활성제(예: 슈크로오즈 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트 등)를 미생물성 세포의 초기 대수 성장기에서 바이오틴 활성을 억제하기 위한 물질로서 배지에 첨가한다.
한편, 브레비박테리움 속의 L-글루탐산-생성 균주에서의 α -케토글루타르산 데하이드로게나제 활성의 존재 및 낮은 활성의 α -케토글루타르산 데하이드로게나제를 갖는 돌연변이체의 유도에 대한 보고가 공개되어 있으며, 여기서 상기 돌연변이체에 의한 L-글루탐산 생산성에 대한 연구는 이러한 돌연변이체가 모균주와 동일한 L-글루탐산 생산성을 나타냄을 보여준다[참조: Agric. Biol. Chem., 44 1897-1904, 1980; Agric. Biol. Chem., 46, 493-500, 1982].
본 발명의 목적은 더 경제적이고 더 효과적인 발효에 의해 L-글루탐산을 산업적으로 제조하는 개선된 방법을 제공하는 것이다
본 발명의 발명자들은 발효에 의해 L-글루탐산을 생성하는 통상적인 방법을 개선시키기 위해 철저한 연구를 수행했으며, 야생형 균주와 비교하여 더 낮은 α -케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 갖고 상기 야생형 균주로부터 유도되는, 브레비박테리움 속 또는 코리네박테리움 속으로부터의 L-글루탐산-생성 미생물의 돌연변이체를 과량의 바이오틴을 함유하는 액체 영양 배지에서 배양하는 경우, 바이오틴 활성-억제 물질로서 페니실린 및 계면활성제 등을 배지에 첨가하지 않고서도 L-글루탐산이 고 축적율 및 고수율로 생성된다는 사실을 밝혀내고, 이로써 본 발명을 완성시켰다.
요약하면, 야생형 균주와 비교하여 더 낮은 α -케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 갖고 상기 야생형 균주로부터 유도된, 브레비박테리움 속 또는 코리네박테리움 속으로부터의 L-글루탐산 생성 미생물의 돌연변이체를 바이오틴 활성 억제 물질을 첨가하지 않은, 농도가 10내지 1000μg/1인 바이오틴-함유 액체 영양 배지 중에서 배양시키고; 상기 배양액중에 L-글루탐산을 생성 및 축적시킨 다음, 상기 배양액으로부터 L-글루탐산을 회수함을 특징으로 하는, 발효에 의해 L-글루탐산을 생성시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 사용되는 돌연변이 체는 야생형 균주와 비교하여 더 낮은 α -케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 갖고 상기 야생형 균주로부터 유도된, 브레비박테리움 속 또는 코리네박테리움 속으로부터의 L-글루탐산 생성 미생물로부터 유도된 어떠한 돌연변이 체일 수도 있다. 이러한 돌연변이체는 동시에, L-글루탐산의 생산성을 향상시키는데 효과적인 것으로 공지되어 있는, 비타민-P 활성을 갖는 화합물에 대한 내성, 데코이닌 또는 투베르시딘에 대한 내성, 증가된 과산화물 디스뮤타제(dismutase) 활성 등과 같은 기타 특성을 가질 수 있다[참조: 미합중국 특허 제4,334,020호, 제4,389,483호 및 제4,529,697호]. 하기 균주가 이의 예시적 양태로서 제시된 것이다.
브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) (Corynebac terium glutamicum) AJ 12821 (FERM BP-4172), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavium) (Coryne-bacterium glutamicum) AJ 12822(FERM BP-4173), 코리네박테리움 글루타미쿰(Coryne-bacterium glutamicum) AJ 12823 (FERM BP-4174).
이들 돌연변이체는 브레비박테리움 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 L-글루탐산 생성 균주의 인공적 돌연변이 처리에 의해 수득된다. 모균주는 브레비박테리움 속 또는 코리네박테리움 속에 속하고 L-글루탐산을 생성시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며 하기 기재된 야생형 균주가 사용될 수 있다.
브레비박테리움 락토퍼멘툼 (Brevibacterlum lactofermentum) (Coryne bacterium gluta-micum) ATCC 13869, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)(Corynebacterium glutamicum) ATCC 14067, 브레비박테리움 디바리카튬(Brevibacterium divaricatum) (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020, 브레비박테리움 로제움(Brevibacterium roseum) ATCC 13825, 브레비박테리움 사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC 14066, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토액시도필룸 (Corynebacterium acetocidophilium) ATCC 13870, 코리네 박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC 15806, 코리네박테리움 릴륨(Corynebacterium lilium) (Corynebacterium glutamicum) ATCC 15990, 코리네 박테리움 멜라세콜라 (Corynebacterium melassecola) ATCC 17965.
상기 돌연변이 체를 초래하는 돌연변이 유발 방법은 통상적인 방법, 예를 들어, 자외선 조사, X-선조사, 방사선조사, 돌연변이 유발성 제제를 사용한 처리(예: N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘 250μg/ml로 30℃에서 20분간 처리) 등일 수 있다. 또한, 육종(breeding)이 재조합 DNA 기술에 의해 수행될 수 있다.
돌연변이 유발 처리가 적용되는 세포로부터 본 발명에 따른 돌연변이체를 분리하는 방법은, 예를 들어, 탄소 및 질소 공급원으로서 L-글루탐산만을 함유하는 배지상에서 생장할 수 없지만, 상기 배지중 L-글루탐산이 석신산 및 암모니아로 대체된 배지상에서는 생장할 수 있는 균주를 분리하는 방법을 포함하지만 특별히 제한되지는 않는다[참조: Agric. Biol. Chem., 46, 493-500, 1982]. 돌연변이체를 분리하는 방법의 양태가 하기에 기술되어 있다.
브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869의 세포는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(250μg/ml, 30℃, 20분)을 사용하여 통상적 돌연변이 유발 처리시킨 다음, 표 1에 기재된 조성의 한천 배지상에서 배양을 수행하여 콜로니를 형성한다. 그 다음에 레플리카(replica) 방법을 사용하여 탄소 및 질소원으로서 L-글루탐산만을 함유하는 배지상에서 생장할 수 있는 돌연변이체를 상기 콜로니로부터 분리한다. 즉, 30℃에서 2일간 배양시킨 후에도 표 2에 기재된 조성의 배지상에서 생장할 수 없지만 표 2에서 나트륨 L-글루타메이트가 석신산 10g/1 및 암모니아 1m1/1로 대체된 배지상에서는 동일한 조건하에서 생장하는 콜로니를 골라낸다. 이렇게 하여 모 야생형 균주 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869와 비교하여 더 낮은 α -케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 갖는 많은 돌연변이체가 수득된다. 브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ 12821(FERM BP-4172)를 대표적 균주로서 선별한다. 유사한 방법으로, 모균주로서 야생형 균주 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 각각 사용하여 브레비박테리움 플라붐 AJ 12822(FERM BP-4173) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 AJ 12823(FERM BP-4174)가 수득된다.
상기 언급된 3개의 돌연변이체 및 이들의 모균주 각각의 α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성은 하기 방식으로 측정된다.
표 3에 기재된 조성의 배지 20m1를 500m1들이 진탕 플라스크 안으로 붓고 115℃에서 10분 동안 멸균한다. 시험될 균주의 세포를 배지내로 접종하고 31.5℃에서 36시간 동안 배양시킨다. 세포를 생성된 배양물로부터 원심분리에 의해 회수한 후 30%글리세롤 함유 0.1M TES[N-트리스 (하이드록시 메틸)메틸 -2-아미노에탄 설폰산]-NaOH 완충액 20m1중에 현탁시킨다. 그 다음에 세포를 초음파 처리하고 이를 원심분리하여 수득된 상등액을 Sephadex G-25 컬럼을 사용하여 겔 여과시킨다. 이로써 조 효소 용액이 제조된다. 그 다음에, 조효소 용액의 α -케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 표 4에 기재된 조성의 반응 용액을 사용하여 측정한다. 반응은 반응 용액 1.5ml에 상기 조 효소 용액 0.1ml을 첨가함으로써 개시하며 365nm에서의 흡광도의 변화를 실온에서 추적한다. α-케토글루타르산이 결핍된 반응 용액을 대조용으로 사용한다.
결과는 표 5에 기재되어 있다. 여기서 명백히 나타나는 바와 같이, 상기 기술된 방법으로 수득된 3개의 돌연변이체 모두는 각각의 야생형 모균주보다 상당히 더 낮은 α-글루타르산 데하이드로게나제 활성을 가진다.
(1단위는 반응 혼합물중 3-아세틸피리딘 아데닌 디뉴클레오타이드를 분당 1μmol 소모하는데 요구되는 효소의 양으로 정의된다)
본 발명에서 사용되는, 야생형 균주로부터 유도된 돌연변이체의 α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성이 야생형 균주보다 더 낮은 정도는 제한될 필요는 없지만, 바람직하게는 활성이 모균주의 1/5내지 1/500, 보다 바람직하게는 1/10 내지 1/100인 돌연변이체를 사용한다.
수득된 돌연변이체를 사용하여 L-글루탐산을 생성하고 축적하기 위해, 사탕수수 및 사탕무우 당밀 등과 같은 과량의 바이오틴을 함유하는 물질이 탄소 원으로서 사용된 액체 영양 배지에서 또는 바이오틴이 당화된 용액, 아세트산 등과 같은 탄소원에 과량으로 첨가된 액체 배지에서 배양을 수행한다. 이때, 통상적으로, 배양을 과량의 바이오틴을 함유하는 액체 배지에서 수행하는 경우, 페니실린 G, F, K, O, V, X 등과 같은 바이오틴 활성을 억제하는 물질을 필수적으로 첨가하거나 보다 고급 지방산 또는 이의 유도체(예: 슈크로오즈 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트 등)로 구성된 계면활성제를 배지에 첨가하여 L-글루탐산을 고수율로 생성한다 그러나, 야생형 균주 보다 더 낮은 α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 갖는, 상기 야생형 균주로부터 유도된 본 발명에 따른 돌연변이체가 사용되는 경우, L-글루탐산은 상기 언급된 바이오틴 활성-억제 물질을 첨가하지 않고도, 심지어는 바이오틴을 10 내지 1000μg/1의 고농도로 함유하는 액체 영양 배지에서 조차도, 고수율로 생성되고 고축적율로 축적될 수 있다.
사용되는 액체 영양 배치는, 탄소원 이외에, 적당한 영양물질, 예를 들어, 질소원, 무기 이온 등을 함유한다. 사용되는 질소원은 L-글루탐산 발효에 통상적으로 사용되는 암모늄 염, 암모니아 수, 암모니아 기체, 우레아 등일 수 있으며 적당한 무기 이온, 예를 들어, 포스페이트, 마그네슘염 등이 또한, 필요한 경우, 사용될 수 있다. 또한, 미량 영양 물질(예: 티아민 등)이, 필요한 경우, 적당하게 첨가될 수 있다.
배양은 호기성 조건하에서 온도를 24 내지 42℃로 조절하고 pH를 5 내지 9로 조정하면서 수행하는 것이 바람직하다. pH는 무기 또는 유기, 산성 또는 알칼리성 물질을 사용하거나 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 기체 등을 사용하여 조정할 수 있다
배양액으로부터 L-글루탐산을 회수하는 방법에는 공지된 방법, 예를 들어, 이온-교환 수지 처리, 결정화 등과 같은 방법을 적당히 조합시킨 방법이 포함될 수 있다.
[실시예]
본 발명에 대한 보다 상세한 설명은 하기 실시예를 참조로 하기에 기재된다.
[실시예 1]
표 6에 기재된 조성을 갖는 씨드(seed) 배양물 배지를 제조하고 이의 20m1분량을 500m1들이 진탕 플라스크에 넣은 다음 멸균시킨다. 3개 돌연변이체 및 이들의 모균주, 즉, 야생형 균주 각각을 상기 배지에 접종하고 31.5℃로 유지하면서 역(reciprocal) 진탕기를 사용하여 15시간 동안 배양을 수행한다. 이것이 하기에 씨드 배양물로서 언급될 것이다.
그 다음에, 배양 배지를 표 7에 기재된 조성을 사용하여 개별적으로 제조하고 이의 20m1 분량을 500m1들이 진탕 플라스크에 붓고 난 후 115℃에서 10분 동안 멸균시킨다. 이 배지중 바이오틴의 농도는 60 μg/1이다.
상기 언급된 씨드 배양물을 약 10용적%의 비율로 각 배지에 접종하고 배양을 31.5℃에서 역 진탕기를 사용하여 수행한다. 450mg/m1 농도의 우레아 용액을 배양시키는 동안 배양액의 pH를 6.0 내지 8.5로 유지시키면서 소량 첨가한다. 발효를 36시간째에 종결시키고 배양액중에 축적된 L-글루탐산의 양을 측정한다.
표 8에 기재된 바와 같이, L-글루탐산의 축적은 배지중에 바이오틴이 과량으로 존재하기 때문에 야생형 균주를 사용한 경우 매우 낮지만, 반면 낮은 α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 갖는 돌연변이체는 모두 다량의 L-글루탐산을 생성하고 축적한다.
[실시예 2]
배양 배지를 표 9에 기재된 조성을 사용하여 제조하고 이의 300m1 분량을 1ℓ들이 자르(jar) 발효기에 붓고 난 후 120℃에서 10분간 멸균시킨다. 이 배지중 바이오틴의 농도는 150μg/1이다.
실시예 1에 따른 각 균주의 씨드 배양물을 10용적%의 비율로 배지에 접종시키고 31.5℃에서 통기 및 교반과 함께 배양을 수행한다. 배양액의 pH는 암모니아 기체를 사용하여 7.8로 조정한다. 발효를 32시간째에 종결시키고 배양액에 축적된 L-글루탐산의 양을 측정한다.
표 10에 기재된 바와 같이, 야생형 균주를 사용한 경우 과량의 바이오틴 때문에 L-글루탐산의 축적이 매우 낮지만, 반면 낮은 α -케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 갖는 돌연변이체는 모두 다량의 L-글루탐산을 생성하고 축적한다.
[실시예 3]
배양 배지를 3, 10, 50, 300 및 1000μg/1의 농도로 첨가된 바이오틴을 포함하는 표 11에 기재된 조성을 사용하여 제조하고 이의 300m1 분량을 1ℓ들이 자르 발효기에 붓고 난 다음 120℃에서 10분 동안 멸균시킨다.
실시예 1에 따른 균주 각각의 씨드 배양물을 약 10용적%의 비율로 각 배지에 접종하고 배양을 31.5℃에서 통기 및 교반과 함께 수행한다. 배양액의 pH를 암모니아 기체를 사용하여 7.8로 조정한다. 발효를 30시간째에 종결시키고 배양액에 생성되고 축적된 L-글루탐산의 양을 측정한다.
표 12에 기재된 바와 같이, 바이오틴이 3μg/1의 농도로 제한된 L-글루탐산 생성 배양 배지에서는 L-글루탐산의 축적량이 모 야생형 균주 및 돌연변이체 둘다에 대해 거의 동일하다. 한편, 10내지 1000μg/1의 농도로 바이오틴을 함유하는 배지에서는 야생형 균주에 의한 L-글루탐산 생성은 억제된 반면 낮은 α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 갖는 돌연변이체는 모두 다량의 L-글루탐산을 생성하고 축적 한다.
Claims (1)
- 야생형 균주와 비교하여 더 낮은 α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 갖고 상기 야생형 균주로부터 유도되는, 브레비박테리움 속 또는 코리네박테리움 속으로부터의 L-글루탐산 생성 미생물의 돌연변이체를, 바이오틴 활성 억제 물질을 첨가하지 않고 농도가 10 내지 1000μg/1인 바이오틴-함유 액체 영양 배지중에서 배양시키고; 이러한 배양액중에 L-글루탐산을 생성 및 축적시킨 다음, 상기 배양액으로부터 L-글루탐산을 회수함을 특징으로 하는, 발효에 의해 L-글루탐산의 제조방법.
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