JP3301140B2 - 発酵法によるl−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるl−グルタミン酸の製造法Info
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Description
タミン酸の製造法に関する。L−グルタミン酸は食品、
医薬品、化学品等として重要なアミノ酸である。
テリウム属またはコリネバクテリウム属に属する微生物
を用いた発酵法により工業的に生産されている。従来の
L−グルタミン酸発酵においては、培地に含まれるビオ
チンもしくはビオチン活性物質の濃度がL−グルタミン
酸の生産性に大きく影響することが知られており、ビオ
チンもしくはビオチン活性物質が生育の適量以下の制限
条件下において培養を行うか、あるいは甘藷、甜菜から
の糖汁もしくは廃糖蜜等のビオチン過剰原料を炭素源と
して使用する場合はペニシリンG、F、K、O、V、X
等のペニシリン類またはシュクロースモノパルミテー
ト、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート等
の高級脂肪酸もしくはその誘導体より成る界面活性剤を
ビオチン作用抑制物質として培地に添加する等の方法で
培養が行われていた。
てα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の存在を明
らかにした上で本酵素活性の低下した変異株を誘導し、
そのL−グルタミン酸生産能を調べた報告があるが、該
変異株のL−グルタミン酸生産能は親株とほぼ同じであ
ったとされている(Agric. Biol. Chem., 44, 1897〜19
04 (1980)、Agric. Biol. Chem., 46, 493〜500 (198
2))。
法によりL−グルタミン酸を工業的にさらに安価に製造
する方法を提供することである。
酵法によるL−グルタミン酸の製造法を改良すべく鋭意
研究した結果、ブレビバクテリウム属またはコリネバク
テリウム属に属し、野生株に比べてα−ケトグルタル酸
デヒドロゲナーゼ活性が低下し、かつL−グルタミン酸
生産能を有する変異株をビオチン過剰原料を炭素源とす
る液体栄養培地中で培養すると、ペニシリン類や界面活
性剤等のビオチン作用抑制物質を培地に添加することな
く高蓄積、高収率でL−グルタミン酸が生産されること
を見い出し、本発明を完成するに至った。
属またはコリネバクテリウム属に属し、野生株に比べて
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下し、か
つL−グルタミン酸生産能を有する変異株をビオチン濃
度10乃至1000μg/lの液体栄養培地中でビオチ
ン作用抑制物質を培地に添加することなく培養し、培養
液中にL−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする発酵法によるL−グルタミン酸の
製造法を提供するものである。
リウム属またはコリネバクテリウム属に属し、野生株に
比べてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下
し、かつL−グルタミン酸生産能を有するものであれば
いかなるものでもよいが、具体的に例示すると以下のよ
うな菌株を挙げることができる。ブレビバクテリウム・
ラクトフェルメンタム AJ12821(FERM B
P−4172) ブレビバクテリウム・フラバム AJ12822(FE
RM BP−4173) コリネバクテリウム・グルタミカム AJ12823
(FERM BP−4174)
またはコリネバクテリウム属のL−グルタミン酸生産菌
を親株として変異誘導することによって得られる。親株
はブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属に
属し、L−グルタミン酸生産能を有するものであれば特
に限定されないが、例えば以下のような野生株を使用す
ることができる。 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ATCC
13869 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC140
20 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC1
4066 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC1303
2 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC
13870
線照射、X線照射、放射線照射、変異誘起剤処理等の通
常の方法が用いられ、例えば250μg/mlのN−メ
チル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジンにより3
0℃で20分間処理する方法等がある。また、遺伝子組
換え法により育種することもできる。
離する方法は限定されないが、例えば、L−グルタミン
酸を単一炭素源及び単一窒素源とする培地で生育できな
いが、この培地のL−グルタミン酸をコハク酸及びアン
モニアで代替した培地で生育可能な菌株として分離する
方法がある(Agric. Biol. Chem., 46, 493〜500 (198
2))。以下に変異株の取得方法の具体例を示す。
ム ATCC13869の菌体にN−メチル−N′−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジンによる通常の変異処理
(250μg/ml、30℃、20分)を施した後、表
1の組成の固体培地上で培養し、コロニーを形成させ
た。これよりレプリカ法により、L−グルタミン酸を単
一炭素源及び単一窒素源とする培地で生育できない変異
株を分離した。すなわち、表2の組成の培地上では、3
0℃で2日間培養しても生育できないが、L−グルタミ
ン酸ナトリウムをコハク酸10g/l及びアンモニア水
1ml/lで代替した同培地上では同条件下で生育して
くるコロニーを採取した。かくして得られた変異株の1
つがブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム AJ
12821(FERM BP−4172)である。同様
の方法により、ブレビバクテリウム・フラバム ATC
C14067を親株としてブレビバクテリウム・フラバ
ム AJ12822(FERM BP−4173)を、
またコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13
032を親株としてコリネバクテリウム・グルタミカム
AJ12823(FERM BP−4174)を得た。
タル酸デヒドロゲナーゼ活性を以下のようにして測定し
た。表3に示す組成の培地20mlを500ml容振と
うフラスコに張り込み、115℃、10分間加熱殺菌し
た。これに供試菌株を接種して31.5℃、36時間培
養した。得られた培養液より菌体を遠心分離し洗浄した
後、30%グリセロールを含む0.1M濃度TES(N
−トリス(ハイドロキシメチル)メチル−2−アミノエ
タンスルホン酸)−NaOH緩衝液20mlに懸濁し
た。菌体を超音波破砕して遠心分離した上清をセファデ
ックスG−25カラムを用いてゲル濾過し、これを粗酵
素液とした。次いで表4に示す組成の反応液を用いて粗
酵素液のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を調
べた。反応は反応液1.5mlに粗酵素液0.1mlを
添加することにより開始し、室温にて365nmにおけ
る吸光度の変化を追跡した。対照として反応液からα−
ケトグルタル酸を除いたものを使用した。
ように、上述の方法により得られた変異株はいずれも親
株として用いた野生株に比べてα−ケトグルタル酸デヒ
ドロゲナーゼ活性が著しく低下していた。
た場合のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の低
下の度合は特に限定されるものではないが、野生株に比
べて5分の1乃至500分の1、好ましくは10分の1
乃至100分の1程度に活性が下がっている変異株の使
用が好ましい。
を生成蓄積させるには、甘藷、甜菜からの糖汁あるいは
廃糖蜜等のビオチン過剰原料を炭素源とする液体栄養培
地またはデンプン糖化液、酢酸等の炭素源にビオチンを
過剰に添加した液体培地中で培養を行う。ここで、従来
の方法では、ビオチンを過剰に含む液体培地中に培養を
行う場合にはビオチン作用抑制物質、すなわちペニシリ
ンG、F、K、O、V、X等のペニシリン類またはシュ
ークロースモノパルミテート、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノパルミテート等の高級脂肪酸もしくはその誘
導体より成る界面活性剤を培地に添加することがL−グ
ルタミン酸を高収率で生産するために必要であったが、
野生株に比べてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活
性が低下した本発明の変異株を使用する場合、10乃至
1000μg/lの高濃度のビオチンを含む液体栄養培
地で培養する際においても上記のようなビオチン作用抑
制物質の添加を行うことなく高収率、高蓄積でL−グル
タミン酸を生成蓄積させることができる。
窒素源、無機イオンその他の栄養素を適宜含有する。窒
素源としては、通常のL−グルタミン酸発酵に用いられ
るアンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿
素等が用いられ、その他リン酸塩、マグネシウム塩等の
無機イオンが必要に応じて適宜使用される。また、必要
により、サイアミン等の微量栄養素が適宜培地に添加さ
れる。
温度24〜42℃、培養中pHは5〜9に制御するのが
よく、pHの調整には無機あるいは有機の酸性あるいは
アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アン
モニアガス等を使用することができる。
方法は、イオン交換樹脂処理、晶析等公知の方法を適宜
組み合わせることにより行われる。
明する。
00ml容肩付フラスコに入れ加熱殺菌した。この培地
に各菌株を接種し、31.5℃に保ちつつ15時間振盪
培養した(以下、これを種母培養液という)。
し、その20mlずつを500ml容振盪フラスコに分
注し115℃で10分加熱殺菌した。なお、この培地中
のビオチン濃度は60μg/lであった。
み量の10%相当接種し、往復振とう機により31.5
℃で培養を行った。培養中、培養液をpH6.0〜8.
5に保つように450mg/mlの濃度の尿素溶液を少
量ずつ添加した。36時間で発酵を終了し、培養液中に
蓄積したL−グルタミン酸の量を測定した。
−グルタミン酸の蓄積が極めて低かったのに対して、α
−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した変異
株は、いずれも良好にL−グルタミン酸を生成蓄積し
た。
メンターに300mlずつ張込み120℃で10分加熱
殺菌した。なお、この培地中のビオチン濃度は150μ
g/lであった。
養液を張込み量の10%相当を接種し31.5℃で通気
撹拌培養を行った。培養中アンモニアガスにより培養液
のpHを7.8に調製した。32時間で発酵を終了し、
培養液中に蓄積したL−グルタミン酸の量を測定した。
L−グルタミン酸の蓄積が極めて低かったのに対して、
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した変
異株は、いずれも良好にL−グルタミン酸を生成蓄積し
た。
000μg/lの各濃度で添加した培地を調製し、1リ
ットル容ジャーファーメンターに300mlずつ張込み
120℃で10分加熱殺菌した。
養液を張込み量の10%相当を接種し31.5℃で通気
撹拌培養を行った。培養中アンモニアガスにより培養液
のpHを7.8に調整した。30時間で発酵を終了し、
培養液中に生成蓄積したL−グルタミン酸の量を測定し
た。
濃度を3μg/lに制限したL−グルタミン酸生産培地
においては、親株と変異株のL−グルタミン酸蓄積量は
ほぼ同等であった。一方、ビオチン濃度10乃至100
0μg/lの培地においては、親株はL−グルタミン酸
生産能が低下したのに対して、α−ケトグルタル酸デヒ
ドロゲナーゼ活性が低下した変異株は良好にL−グルタ
ミン酸を生成蓄積した。
れば、高濃度のビオチンを含有する培地においてもペニ
シリン類あるいは界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
を培地に添加することなくL−グルタミン酸を高収率、
高蓄積で生産することができる。
Claims (2)
- 【請求項1】ブレビバクテリウム属またはコリネバクテ
リウム属に属し、野生株に比べてα−ケトグルタル酸デ
ヒドロゲナーゼ活性が5分の1乃至500分の1程度に
低下し、かつL−グルタミン酸生産能を有する変異株を
ビオチン濃度10乃至1000μg/lの液体栄養培地
中でビオチン作用抑制物質を培地に添加することなく培
養し、培養液中にL−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする発酵法によるL−グル
タミン酸の製造法。 - 【請求項2】野生株に比べてα−ケトグルタル酸デヒド
ロゲナーゼ活性が10分の1乃至100分の1程度に低
下したことを特徴とする請求項1記載の製造法。
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