JPS6324679B2

JPS6324679B2 -

Info

Publication number: JPS6324679B2
Application number: JP61267751A
Authority: JP
Inventors: Masanari Yamada; Hiroki Tsutsui; Kyosuke Yomoto
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1986-11-12
Filing date: 1986-11-12
Publication date: 1988-05-21
Also published as: JPS62171692A

Description

【発明の詳細な説明】

＜産業上の利用分野＞本発明は、発酵法によるＬ−スレオニンの製造
方法に関するものである。＜従来の技術＞プロテウスまたはプロビデンシアに属する微生
物を用いた発酵法によるＬ−スレオニンの製造方
法としては、Ｌ−イソロイシン要求性株を用いる
方法（特公昭43−4440号公報）やα−アミノ−β
−ハイドロキシ吉草酸に耐性を有し、かつＬ−イ
ソロイシン要求性を有する微生物を用いる方法
（日本農芸化学会講演要旨集９頁（1970）が知ら
れている。＜発明が解決しようとする問題点＞しかし、これらの方法によるＬ−スレオニンの
生成蓄積濃度、または、糖などの原料からのＬ−
スレオニン生成収率は、十分に満足できるもので
はなかつた。＜問題点を解決するための手段および作用＞本発明者らは、さらに生産性の高いＬ−スレオ
ニンの製造方法について、鋭意研究した結果、プ
ロビデンシア属に属し、Ｌ−スレオニン生産能を
有する微生物にスレオニンアルドラーゼ欠損性を
付与することによつて、Ｌ−スレオニン蓄積濃
度、生成収率が著しく向上することを見出し、本
発明に到達した。本発明で用いられる微生物は、プロビデンシア
属に属し（バージーのマニユアル・オブ・システ
マテイツクバクテリオロジーVol.1（1984）、第495
〜496頁に従う）、スレオニンアルドラーゼを欠損
する性質とＬ−スレオニン生成能をあわせ持つも
のである。また、Ｌ−イソロイシンに対する栄養要求性、
α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸などスレオ
ニンアナローグに対する耐性およびエチオニンな
どメチオニンアナローグに対する耐性はＬ−スレ
オニン生成能に有効に作用するので、これらのい
くつかの特性ないしはすべての特性をあわせ持つ
微生物がより好ましく用いられる。また、これら
特性は通常の変異誘導操作により付与することが
可能である。ここでいう栄養要求性とは、広義の意味であ
り、不完全欠失型（いわゆるLeaky型）も含むも
のである。さらにその要求物質の生合成前駆物質で要求性
が満足される場合も含むものである。本発明で用いられる微生物は変異株により提供
されその代表的なものとしては、例えば以下のも
のがある。プロビデンシア・レトゲリNS−133（FERM
Ｐ−8082）（α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草
酸耐性、エチオニン耐性、Ｌ−イソロイシン要求
性、スレオニンアルドラーゼ欠損性）プロビデン
シア・レドゲリNS133I−69（FERM Ｐ−8085）
（α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、エ
チオニン耐性、Ｌ−イソロイシン要求性、Ｌ−ロ
イシン要求性、スレオニンアルドラーゼ欠損性）
プロビデンシア・レトゲリNS−133は、プロビデ
ンシア・レトゲリTY−１（FERM Ｐ−8079、α
−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、エチオ
ニン耐性、Ｌ−イソロイシン要求性）を親株とし
て、スレオニンアルドラーゼ欠損性変異株として
分離されたものであり、また、プロビデンシア・
レトゲリNS133I−69は、プロビデンシア・レト
ゲリNS133（FERM Ｐ−8082）を親株として、
通常の変異処理方法によつて、Ｌ−ロイシン要求
性株として得られたものである。スレオニンアルドラーゼ欠損性変異株を得るに
は、親株を紫外線照射するか、あるいは変異誘発
剤（例えば、Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸な
ど）で処理したのち、Ｌ−スレオニンを主な窒素
源とし、ごく微量の酵母エキスを含むような平板
培地にて、30℃で３〜５日培養し、生じた小さな
コロニーを釣菌分離する。そして、これらの菌株
のうち、休止菌体反応で、Ｌ−スレオニンからの
グリシンの生成が親株よりも有意に少ない菌株を
スレオニンアルドラーゼ欠損性変異株として分離
した。本発明において用いる菌株と、その親株のスレ
オニンアルドラーゼ活性を検定した結果を実施例
１に示す。また、本発明においては、上記のようにして取
得されるスレオニンアルドラーゼ欠損性変異株
に、Ｌ−ロイシン要求性などのスレオニン生産性
を向上せしめる特性を通常の変異誘導操作によつ
て付与することができるので、このような変異株
を使用することもでる。本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地
は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応
じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地
である。炭素源としては、グルコース、フラクトース、
でん粉およびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの
ごとき有機酸、グリセロールのごときアルコール
類などを２〜15％、窒素源として、酢酸アンモニ
ウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、
硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩、
アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを0.5
〜4.0％、有機微量栄養素としては、Ｌ−イソロ
イシンなどの被要求物質が0.001〜0.4％、または
必要に応じてコーンステイープリカー、ペプト
ン、酵母エキスなど０〜４％をそれぞれ適当量含
有する培地が好適に用いられる。これらの他に、
リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄
７水和物、硫酸マンガン４−６水和物などが少量
添加される。培養は、好気的条件が望ましい。培養の間、培
地のPHは５〜９に、温度は24〜37℃に調節し、48
〜120時間振とうまたは、通気培養すれば好まし
い結果が得られる。培養液からＬ−スレオニンを採取するには、例
えば、菌体を除去した培養過液をPH２に塩酸で
調製したのち、強酸性カチオンイオン交換樹脂に
通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱
アンモニア後、濃縮する。これにアルコールを添
加し、冷却保存下で生成した結晶を集め、Ｌ−ス
レオニンを得ることができる。＜実施例＞実施例１Ａ（スレオニンアルドラーゼ欠損変異株の取
得）プロビデンシア・レトゲリTY−１（FERM
Ｐ−8079、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草
酸耐性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−イソロイシ
ン要求性）の菌体に通常の方法で紫外線照射
し、この細胞を酵母エキス0.01％添加した寒天
板培地（グルコース0.5％、Ｌ−スレオニン0.5
％、リン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カ
リウム0.7％、硫酸マグネシウム７水和物0.01
％、Ｌ−イソロイシン0.005％、寒天２％）に
塗布した。次に、30℃で４〜６日培養し、生じ
たコロニーのうち小さなコロニーを釣菌分離し
た。この分離した菌株の洗浄菌体を１ｍＭピリド
キサール−5′−リン酸存在下でＬ−スレオニン
10ｇ／と30℃、４時間反応させ、生成したグ
リシンが親株と比べて有意に少ない菌株とし
て、スレオニンアルドラーゼ欠損株（プロビデ
ンシア・レトゲリNS−133）を取得した。Ｂ（スレオニンアルドラーゼ欠損性の検定）下記第１表に示す各菌株を、Ｌ−スレオニン
５ｇ／を含むブイヨン培地100mlで30℃、５
時間、坂口フラスコを用いて振とう培養した。
この菌体を50ｍＭリン酸カリウムバツフアー
（PH8.0）で二度洗浄したのち、超音波処理（０
℃、100W、５分間）により菌体を破砕した。この菌体破砕液を遠心（10000rpm、４℃、
20min）し、その上清を粗酵素液とした。この
粗酵素液を用いて、下記組成の酵素反応液系
で、スレオニンアルドラーゼ活性を測定した。酵素反応液 125ｍＭＬ−スレオニン 0.1ml 1M、PH8.5 トリス−HCLバツフアー 0.1ml 0.9M KCl 0.1ml 0.5ｍＭピリドキサール−5′−リン酸 0.1ml 145IU アルコールデヒドロゲナーゼ 0.1ml ２ｍＭ NADH 0.1ml 粗酵素液 0.1ml H₂O 0.3ml 計 1.0ml スレオニンアルドラーゼによつて、スレオニ
ンから生成するアセトアルデヒドをNADHの
減少によつて測定した。

【表】＊スレオニンアルドラーゼ活性は、蛋白１
mgあたり、１分間に生成するアセトアルデ
ヒドのμmoleで表わした。
結果は、第１表に示すとおりであり、本発明
で使用するプロビデンシア・レトゲリNS133
は、親株のプロビデンシア・レトゲリTY−１
と比べて、スレオニンアルドラーゼ欠損性であ
ることが明らかである。実施例２Ａ（Ｌ−ロイシン要求性変異株の取得）プロビデンシア・レトゲリNS133（FERM
Ｐ−8082、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草
酸耐性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−イソロイシ
ン要求性、スレオニンアルドラーゼ欠損性）の
菌体に、通常の方法で紫外線照射し、この細胞
をポリペプトン0.01％添加した寒天平板培地
（グルコース0.5％、硫安0.1％、リン酸第１カ
リウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫酸
マグネシウム７水和物0.01％、Ｌ−イソロイシ
ン0.005％、寒天２％）に塗布した。次に、30℃で４〜６日間培養し、生じたコロ
ニーのうち小さなコロニーを釣菌分離した。分
離された菌株のうちより実施例１のＢに示す方
法により、Ｌ−ロイシン要求性変異株を選出し
た。Ｂ（Ｌ−ロイシン要求性の検定）下記第１表に示す各菌株を、ブイヨン寒天斜
面培地で24時間培養しその菌体をごく微量かき
とり、Ｌ−ロイシン無添加およびＬ−ロイシン
0.01％添加した下記組成の合成寒天平板培地に
うすく塗布し、30℃で４〜６日間培養しその生
育の有無を観察した。Ｌ−ロイシン無添加寒天
平板培地で生育できず、Ｌ−ロイシン添加寒天
平板培地で生育するものをＬ−ロイシン要求性
変異株とした。合成寒天培地グルコース 0.5％（NH₄）₂SO₄ 0.1％ KH₂PO₄ 0.3％ K₂HPO₄ 0.7％ MgSO₄・7H₂O 0.01％Ｌ−イソロイシン 0.005％寒天 2.0％結果は第２表に示すとおりであり、本発明方
法で使用するＬ−ロイシン要求性株プロビデン
シア・レトゲリNS133I−69は、親株のプロビ
デンシア・レトゲリNS133との比較より明らか
に、Ｌ−ロイシン要求性を獲得している。

【表】 (注) ＋：生育あり −：生育なし
実施例３第３表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培
地で30℃、16時間振とうして前培養したのち、あ
らかじめ115℃、10分間蒸気滅菌した下記組成の
主発酵用培地（ただし表−２の比較例として示し
た親株の場合にはＬ−ロイシンは無添加）40mlを
含む１容、三角フラスコに植継ぎ30℃、
150rpm、振幅３cmの条件下で90時間培養した。発酵用培地グルコース（別滅菌）８％（NH₄）₂SO₄ ２％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ ２％ Mn⁺⁺ ２％Ｌ−イソロイシン 0.0025％Ｌ−ロイシン 0.08％ CaCO₃（別滅菌）４％ PH 7.0 7.0（KOHで中和）培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した
液中のＬ−スレオニン濃度を自動アミノ酸分析
計（日本電子JLC200A）で定量したところ第３
表に示すような結果を得た。

【表】スレオニン生成収率は、消費グルコースに対す
る生成スレオニンの重量収率で表わした。蓄積濃
度、Ｌ−スレオニン生成収率ともいずれの場合も
親株に比べて有意に向上した。実施例４プロビデンシア・レトゲリNS133I−69を、液
体ブイヨン培地で30℃、16時間振とう培養し、こ
れを実施例２の発酵用培地のうち（NH₄）₂SO₄を
0.5％、グルコースを4.0％とした培地900mlを分
注したガラス製小型ジヤーフアーメンターへ10％
となるように接種した。30℃で、800rpm、通気
量1vvmで、通気撹拌培養を開始した。 PH調節および窒素源の供給は、25％アンモニア
水で行い、PHは、6.5〜8.0に維持した。グルコースを適宜添加し、最終的に合計120ｇ
のグルコース培養に用いた。 76時間培養後、培養液中には23.0ｇ／のＬ−
スレオニン（対グルコース重量収率19.1％）が生
成した。培養液より菌体を除き、その500mlを強力チオ
ン交換樹脂ダイヤイオンSK・IB（Ｈ型）のカラ
ムにとおした。カラムを水洗後、2Nアンモニア
水でカラムの吸着成分を溶出し、脱色後、減圧濃
縮した。これにエタノールを加え、冷却し、生成
した結晶を集めて乾燥した結果、純度96％以上の
Ｌ−スレオニンの結晶10.4ｇが得られた。＜発明の効果＞本発明により、高い収率および蓄積濃度でＬ−
スレオニンの生成が可能となり、より安価なＬ−
スレオニンの生産が可能となる。

Claims

【特許請求の範囲】１プロビデンシア（Providencia）属に属し、
スレオニンアルドラーゼ欠損性を有し、かつＬ−
スレオニン生産能を有する微生物を培養して、培
養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記
培養液よりＬ−スレオニンを採取することを特徴
とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造方法。２使用する微生物がさらにＬ−ロイシン要求性
を有する微生物であることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の発酵法によるＬ−スレオニン
の製造方法。