JPS6235759B2

JPS6235759B2 -

Info

Publication number: JPS6235759B2
Application number: JP9958985A
Authority: JP
Inventors: Masanari Yamada; Hiroki Tsutsui; Kyosuke Yomoto
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1985-05-13
Filing date: 1985-05-13
Publication date: 1987-08-04
Also published as: JPS61260891A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、発酵法によるＬ―スレオニンの製造
方法に関するものである。〔従来の技術〕プロテウスまたはプロビデンシアに属する微生
物に用いた発酵法によるＬ―スレオニンの製造方
法としては、Ｌ―イソロイシン要求性株を用いる
方法（特公昭43−4440号公報）やα―アミノ―β
―ハイドロキシ吉草酸に耐性を有しかつＬ―イソ
ロイシン要求性を有する微生物を用いる方法（日
本農芸化学会講演要旨集p.9（1970））が知られて
いる。〔発明が解決しようとする問題点〕しかし、これらの方法によるＬ―スレオニンの
生成蓄積濃度、または糖などの原料からのＬ―ス
レオニン生成収率は十分に満足できるものではな
かつた。〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明者らは、さらに生産性の高いＬ―スレオ
ニンの製造方法について鋭意研究した結果、プロ
ビデンシア属に属しＬ―スレオニン生産能を有す
る微生物にＬ―ロイシン要求性を付与することに
よつて、Ｌ―スレオニン蓄積濃度、生成収率が著
しく向上することを見い出し本発明に到達した。本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属
に属し（バージーのマニユアル・オブ・システマ
テイツクバクテリオロジーVol.1（1984）、第
495〜496頁に従う）、生育のために少なくともＬ
―ロイシンを必要とする性質とＬ―スレオニン生
成能をあわせ持つものである。またＬ―イソロイ
シンに対する栄養要求性、α―アミノ―β―ハイ
ドロキシ吉草酸等スレオニンアナローグに対する
耐性およびエチオニン等メチオニンアナローグに
対する耐性はＬ―スレオニン生成能に有効に作用
するので、これらのいくつかの特性ないしはすべ
ての特性をあわせ持つ微生物がより好ましく用い
られる。またこれら特性は通常の変異誘導操作に
より付与することが可能である。ここにいう栄養要求性とは、広義の意味であ
り、不完全欠失型（いわゆるLeaky型）も含むも
のである。さらにその要求物質の生合成前駆物質で要求性
が満足される場合も含むものである。本発明で用いられる微生物は変異株により提供
されその代表的なものとしては、例えば以下のも
のがある。プロビデンシア・レトゲリNS―140（FERM
Ｐ―8083）（α―アミノ―β―ハイドロキシ吉草酸耐性、
エチオニン耐性、Ｌ―イソロイシン要求性、Ｌ―
ロイシン要求性）プロビデンシア・レトゲリNS―140は、プロビ
デンシア・レトゲリTY―１（FERM Ｐ―8079，
α―アミノ―β―ハイドロキシ吉草酸耐性、エチ
オニン耐性、Ｌ―イソロイシン要求性）を親株と
して、通常の変異処理方法によつて、Ｌ―ロイシ
ン要求性株として得られたものである。Ｌ―ロイシン要求性株を得るには、親株を紫外
線照射するか、あるいは変異誘発剤（例えばＮ―
メチル―N′―ニトロ―Ｎ―ニトロソグアニジ
ン、エチルメタンスルホン酸等）で処理したの
ち、通常の最少培地（例えば、デイビスの最少培
地）に、ごく微量のカザミノ酸または酵母エキス
を含むような平板培地にて30℃で３〜５日培養
し、生じた小さなコロニーを釣菌分離する。そし
てこれらの菌株のうち生育にＬ―ロイシンを必要
とするものを選定すればよい。さらに具体例を実施例１に示す。本発明において用いる菌株とその親株のＬ―ロ
イシン要求性を検定した結果を実施例１に示す。本発明におけるＬ―スレオニン生産用の培地
は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応
じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地
である。炭素源としては、グルコース、フラクトース、
でん粉およびセルロースの加水分解物、糖密等の
糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の如き
有機酸、グリセロールの如きアルコール類等を２
〜15％、窒素源として、酢酸アンモニウムの如き
有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウムの如き無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を0.5〜4.0％、有機微
量栄養素としては、Ｌ―イソロイシン等の被要求
物質が0.001〜0.4％、または必要に応じてコーン
ステイープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜
４％をそれぞれ適当量含有する培地が好適に用い
られる。これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグ
ネシウム、硫酸第１鉄７水和物、硫酸マンガン４
−６水和物等が少量添加される。培養は、好気的条件が望ましい。培養の間、培
地のPHは５から９に、温度は24〜37℃に調節し、
48〜120時間振とうまたは通気培養すれば好まし
い結果が得られる。培養液よりＬ―スレオニンを採取するには、例
えば菌体を除去した培養液をPH２に塩酸で調製
したのち、強酸性カチオンイオン交換樹脂に通液
後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アン
モニア後、濃縮する。これにアルコールを添加
し、冷却保存下で生成した結晶を集め、Ｌ―スレ
オニンを得ることができる。〔実施例〕実施例１Ａ（Ｌ―ロイシン要求性変異株の取得）プロビデンシア・レトゲリTY―１（FERM Ｐ
―8079、α―アミノ―β―ハイドロキシ吉草酸耐
性、Ｌ―エチオニン耐性、Ｌ―イソロイシン要求
性）の菌体に、通常の方法で紫外線照射し、この
細胞を、ポリペプトン0.01％添加した寒天平板培
地（グルコース0.5％、硫安0.1％、リン酸第１カ
リウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫酸マ
グネシウム７水和物0.01％、Ｌ―イソロイシン
0.005％、寒天２％）に塗布した。次に、30℃に
て４〜６日間培養し、生じたコロニーのうち小さ
なコロニーを釣菌分離した。分離された菌株のう
ちより実施例１のＢに示す方法により、Ｌ―ロイ
シン要求性変異株を選出した。Ｂ（Ｌ―ロイシン要求性の検定）下記第１表に示す各菌株を、ブイヨン寒天斜面
培地で24時間培養しその菌体をごく微量かきと
り、Ｌ―ロイシン無添加、およびＬ―ロイシン
0.01％添加した下記組成の合成寒天平板培地にう
すく塗布し、30℃にて４日間培養しその生育の有
無を観察した。Ｌ―ロイシン無添加寒天平板培地
で生育できず、Ｌ―ロイシン添加寒天平板培地で
生育するものをＬ―ロイシン要求性変異株とし
た。合成寒天培地グルコース 0.5％（NH₄）₂SO₄ 0.1％ KH₂PO₄ 0.3％ K₂HPO₄ 0.7％ MgSO₄・7H₂O 0.01％Ｌ―イソロイシン 0.005％寒天 2.0％結果は第１表に示すとおりであり、本発明方法
で使用するＬ―ロイシン要求性株プロビデンシ
ア・レトゲリNS―140は、親株のプロビデンシ
ア・レトゲリTY―１との比較より明らかに、Ｌ
―ロイシン要求性を獲得している。

【表】 (注) ＋：生育あり −：生育なし
実施例２第２表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培
地で30℃16時間振とうして前培養したのち、あら
かじめ115℃、10分間蒸気滅菌した下記組成の主
発酵用培地（ただし表―２の比較例として示した
親株の場合にはＬ―ロイシンは無添加）40mlを含
む１容、三角フラスコに植継ぎ30℃、
150rpm、振幅３cmの条件下で90時間培養した。発酵用培地グルコース（別滅菌）８％（NH₄）₂SO₄ ２％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe〓 2ppm Mn〓 2ppm Ｌ―イソロイシン 0.0025％Ｌ―ロイシン 0.08％ CaCO₃（別滅菌）４％ PH 7.0（KOHで中和）培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した
液中のＬ―スレオニン濃度を自動アミノ酸分析
計（日本電子JLC200A）で定量したところ第２
表に示すような結果を得た。

〔発明の効果〕

本発明法により、高い収率および蓄積濃度でＬ
―スレオニン生成が可能となり、より安価なＬ―
スレオニンの生産が可能となる。

Claims

【特許請求の範囲】

１プロビデンシア（Providencia）属に属し、
生育のために少なくともＬ―ロイシンを必要と
し、かつＬ―スレオニン生産能を有する微生物を
培養して、培養液中にＬ―スレオニンを生成蓄積
せしめ、前記培養液よりＬ―スレオニンを採取す
ることを特徴とする発酵法によるＬ―スレオニン
の製造方法。