JPH0313873B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、発酵法によるＬ−スレオニンの製造
方法に関するものである。 〔従来の技術〕 プロビデンシア属に属する微生物を用いる発酵
法によるＬ−スレオニンの製造法はまだ知られて
いない。ただし、バージーのマニユアル・オブ・
システマテイツクバクテリオロジー第１巻（1984
年）で、一部プロビデンシア属に分類変更された
旧ブロテウス属に属する微生物を用いた発酵法に
よるＬ−スレオニンの製造方法としてはＬ−イソ
ロイシン要求株を用いる方法（特公昭43−4440号
公報）やα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐
性を有しかつＬ−イソロイシン要求性を有する微
生物を用いる方法（日本農芸化学会講演要旨集
P.9（1970年））が知られている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、従来の微生物を培養してＬ−ス
レオニンを生成せしめる方法は多量のアラニン及
びバリンを副生するため、Ｌ−スレオニンの生成
収率が低下し、また高純度のＬ−スレオニンを得
るためには、煩雑な精製工程を要し、工業的に実
用化するには不利であつた。 〔問題点を解決するための手段及び作用〕 本発明者らは、Ｌ−スレオニンの高い生産性を
維持すると同時に、アラニンおよび／またはバリ
ンの副生を制御する方法について鋭意検討した結
果、プロビデンシア属に属し、Ｌ−スレオニン生
産能を有する微生物のピルベートキナーゼ
（EC2.7.1.40）の活性を低下させることによりア
ラニンおよび／またはバリンの副生が効果的に制
御されることを見いだし本発明に到達した。 すなわち、本発明は、プロビデンシア
（Providencia）属に属し、Ｌ−スレオニン生産
能を有し、かつピルベートキナーゼ
（EC2.7.1.40）の活性が、その親株よりも低い変
異株を培養して、培養液中にＬ−スレオニンを生
成蓄積せしめ、前記培養液よりＬ−スレオニンを
採取することを特徴とする発酵法によるＬ−スレ
オニンの製造方法である。 プロビデンシア属に属する微生物のピルベート
キナーゼの活性が低下した変異株はこれまで分離
されたことがない。また、ブレビバクテリウム属
に属し、ピルベートキナーゼ欠損の変異株を用い
てＬ−リジンを製造することは公知（H.Ozaki
and I.Shiio；Agric.Biol.Chem.Vol.47，P.1569
−1576（1983））であるが、本発明のごとく、ピル
ベートキナーゼの活性が親株よりも低下した変異
株を用いることにより、Ｌ−スレオニンを著量生
成蓄積せしめ、かつ、アラニン、バリンの副生が
制御されることはまつたく知られていなかつた。 本発明において使用するピルベートキナーゼの
活性が親株よりも低い菌株としては、親株を基準
としてその70％以下、好ましくは50％以下にピル
ベートキナーゼ活性が低下したものが望ましく用
いられる。 たとえ、親株を基準としてその70％以下にピル
ベートキナーゼの活性が低下していなくとも、そ
の菌株の誘導されたもととなる野生株を基準とし
てその70％以下にピルベートキナーゼ活性が低下
していれば、本発明と同様な効果が達成されるも
のであるので、そのような菌株を用いることは本
発明の範囲内に包含される。 本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属
（バージーのマニユアル・オブ・システマテイク
バクテリオロジー第１巻（1984）、第495〜496頁
に従う）に属する微生物である。また、Ｌ−スレ
オニン生成能向上に有効な形質、たとえばＬ−イ
ソロイシン、Ｌ−ロイシンに対する栄養要求性、
α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸等スレオニ
ンアナログに対する耐性およびエチオニン等メチ
オニンアナログに対する耐性等のうち少なくとも
一つを既に付与された変異株であつてもよい。こ
れらの形質は通常の変異誘導操作により付与する
ことが可能である。ここでいう栄養要求性とは広
義の意味であり、不完全欠失型（いわゆるLeaky
型）も含むものである。さらにその要求物質の生
合成前駆物質で要求性が満足される場合も含むも
のである。 本発明で用いられる変異株の代表的なものとし
ては、例えば以下のものがある。 プロビデンシア・レトゲリFPSS25（FERMP−
8227）、（α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐
性、エチオニン耐性、Ｌ−イソロイシン要求性な
いしleaky、Ｌ−ロイシン要求性、ピルベートキ
ナーゼweak）。この変異株はプロビデンシア・レ
トゲリTP3−105（α−アミノ−β−ハイドロキシ
吉草酸耐性、エチオニン耐性、Ｌ−イソロイシン
要求性ないしleaky、Ｌ−ロイシン要求性）から
誘導されたものである。 変異株の誘導は通常の変異処理法によつて比較
的容易に取得できる。すなわち、ピルベートキナ
ーゼ活性低下変異株を得るには、親株を紫外線照
射するかあるいは変異誘発剤（例えばＮ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチ
ルメタンスルホン酸等）で処理した後、通常の最
少培地（例えばデイビスの最少培地）にごく微量
（例えば1μｇ／ml）のβ−フルオロピルビン酸を
含む平板培地にて30℃で３〜４日培養して生じた
小さなコロニーを釣菌分離する。そしてこれらの
菌株のうち、唯一炭素源をグルコースとした場合
には増殖不良で、唯一炭素源をピルビン酸あるい
はクエン酸にした場合には増殖良好な菌株を選定
すればよい。 本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地
は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応
じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地
である。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
でん粉およびセルロースの加水分解物、糖蜜等の
糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の如き
有機酸、グリセロールの如きアルコール類等を２
〜15％、窒素源として、酢酸アンモニウムの如き
有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウムの如き無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を0.5〜4.0％、有機微
量栄養素としては、Ｌ−イソロイシン等の被要求
物質が0.001〜0.4％、または必要に応じてコーン
ステイープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜
４％をそれぞれ適当量含有する培地が好適に用い
られる。これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグ
ネシウム、硫酸第１鉄７水和物、硫酸マンガン４
−６水和物等が微量成分として少量添加される。 培養は、好気的条件で行なう。培養の間、培地
のPHは５から９に、温度は24〜37℃に調節し、48
〜120時間振とうまたは通気培養すれば好ましい
結果が得られる。 培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、例
えば菌体を除去した培養液をPH２に塩酸で調製
したのち、強酸性カチオンイオン交換樹脂に通液
後、希アンモニア水で吸着成分を溶出し、脱アン
モニア後、濃縮する。これにアルコールを添加
し、冷却保存下で生成した結晶を集め、Ｌ−スレ
オニンを得ることができる。 〔実施例〕 以下、実施例によつて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ （ピルベートキナーゼ活性低下変異株の分離） プロビデンシア・レトゲリTP3−105（α−アミ
ノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−エチオニ
ン耐性、Ｌ−イソロイシン要求性ないしleaky.L
−ロイシン要求性）の菌体を通常の方法でＮ−メ
チル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処
理し、この細胞をβ−フルオロピルビン酸ナトリ
ウム1μｇ／ml添加した寒天平板培地（グルコー
ス0.5％、硫安0.1％、リン酸第１カリウム0.3％、
リン酸第２カリウム0.7％、硫酸マグネシウム７
水和物0.01％、Ｌ−イソロイシン0.005％、Ｌ−
ロイシン0.005％、寒天２％）に塗布した。次に、
30℃にて４〜５日培養し、生じたコロニーのうち
小さなコロニーを釣菌分離した。分離された変異
株の中でピルベートキナーゼ活性低下変異株と思
われるものを選定するため、以下の方法で検定し
た。 グルコース、ピルビン酸ナトリウム、クエン酸
三ナトリウム二水和物のいづれか一種を0.5％含
有する寒天平板培地（硫安0.1％、リン酸第１カ
リウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫酸マ
グネシウム７水和物0.01％、Ｌ−イソロイシン
0.005％、Ｌ−ロイシン0.005％、寒天２％）にう
すく塗布し、30℃にて３〜４日培養してその生育
の有無を観察した。グルコース含有寒天平板培地
で生育が不良でピルビ酸ナトリウムあるいはクエ
ン酸三ナトリウム二水和物含有寒天培地で生育の
良好な変異株をピルベートキナーゼ活性低下変異
株であると予想し、実施例２に示すようにピルベ
ートキナーゼの活性測定を行つた。 実施例 ２ （ピルベートキナーゼ活性測定） 実施例１で得た変異株（FPSS25）とその親株
（TP3−105）について活性測定を行つた。粗酵素
液の調整は以下の方法で行つた。上記菌株をそれ
ぞれ液体ブイヨン培地で30℃、16時間振とうして
前培養したのち、あらかじめ115℃、10分間蒸気
減菌した下記に示す主発酵用培地40mlを含む１
容三角フラスコに植継ぎ30℃、150rpm、振幅30
cmの条件下で90時間培養した。培養終了後、低速
遠心し炭酸カルシウムを除去し、上清を遠心分離
して菌体を得た。この菌体を生理食塩水で２度洗
浄した後、30％グリセロール含有50ｍＭトリスー
塩酸緩衝液に懸濁し、超音波破壊後その遠心上清
を粗酵素液とした。 酵素活性測定法はGutmann et al.の方法（メ
ソード・イン・エンザイマテイクアナリシス第２
版第３巻第774−778頁（1974年））によつた。そ
の結果を第１表に示す。 発酵用培地（酵素活性測定用） グルコース（別減菌） ８％ （NH₄）₂SO₄ 2.5％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe 2ppm Mn 2ppm Ｌ−イソロイシン 0.0025％ Ｌ−ロイシン 0.08％ 酵母エキス 0.1％ CaCO₃（別減菌） ４％ PH 7.0（KOHで中和）

【表】 実施例 ３ 第２表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培
地で30℃、16時間振とうして前培養したのち、あ
らかじめ115℃、10分間蒸気減菌した下記組成の
主発酵用培地40mlを含む１容三角フラスコに植
継ぎ30℃、150rpm、振幅３cmの条件下でTP3−
105は90時間、FPSS25は120時間培養した。 発酵用培地（スレオニン発酵用） グルコース（別減菌） ８％ （NH₄）₂SO₄ 2.5％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe 2ppm Mn 2ppm Ｌ−イソロイシン 0.0025％ Ｌ−ロイシン 0.08％ CaCO₃（別減菌） ４％ PH 7.0（KOHで中和） 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した
液中の生成アミノ酸濃度を自動アミノ酸分析計
（日本電子JLC200A）で定量したところ第２表に
示すような結果を得た。

〔発明の効果〕

本発明法によりアラニンおよび／またはバリン
の副生を制御し、高純度のＬ−スレオニンの生産
が可能となつた。煩雑な精製工程を要しないの
で、工業的に実用化するのに有利である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ プロビデンシア（Providencia）属に属し、
   Ｌ−スレオニン生産能を有し、かつピルベートキ
   ナーゼ（EC2.7.1.40）の活性が、その親株よりも
   低い変異株を培養して、培養液中にＬ−スレオニ
   ンを生成蓄積せしめ、前記培養液よりＬ−スレオ
   ニンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ
   −スレオニンの製造方法。