JPH0346111B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

＜産業上の利用分野＞ 本発明は発酵法によるＬ−スレオニンの製造法
に関するものである。 ＜従来の技術＞ プロビデンシア属に属する微生物を用いる発酵
法によるＬ−スレオニンの製造法としては、メチ
オニン代謝拮抗物質に耐性を有し、かつ、Ｌ−ス
レオニン生産性を有する微生物を用いる方法（特
開昭61−216698号公報）や、生育のためにＬ−ロ
イシンを必要とし、かつＬ−スレオニン生産能を
有する微生物を用いる方法（特開昭61−260891号
公報）が知られている。 ＜発明が解決しようとする問題点＞ しかし、これらの方法によるＬ−スレオニンの
生成蓄積濃度、または、糖などの原料からのＬ−
スレオニン生成収率は十分に満足できるものでは
なかつた。 ＜問題点を解決するための手段および作用＞ 本発明者らは、さらに生産性の高いＬ−スレオ
ニンの製造方法について鋭意研究した結果、プロ
ビデンシア属に属しＬ−スレオニン生産能を有す
る微生物に、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤
に対する耐性を付与することにより、Ｌ−スレオ
ニン生産性が向上することを見出し本発明に到達
した。 すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属
し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対する
耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する
微生物を培養して、培養液中にＬ−スレオニンを
生成蓄積せしめ、前記培養液よりＬ−スレオニン
を採取することを特徴とする発酵法によるＬ−ス
レオニンの製造法である。 ここで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤と
は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼによるピルビン
酸からアセチルCoAを生成する反応を阻害し、
その結果微生物の生育を抑制する物質のことであ
る。 ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤としては、
例えばフルオロピルビン酸、ブロモピルビン酸、
グリオキシル酸、チアミンアナローグなどが挙げ
られ、好ましくはチアミンアナローグが用いられ
る。好ましく使用できるチアミンアナローグとし
てはたとえばオキシチアミン、デアミノチアミ
ン、チアミンチアゾール、ピリチアミンなどが挙
げられ、このうちオキシチアミンが特に好ましく
用いられる。 本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属
に属し（バージーのマニユアル・オブ・システマ
テイク・バクテリオロジー第一巻（1984）、第495
〜496頁に従う）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻
害剤に対して耐性を有する微生物である。 かかる性質を有していれば、他の栄養要求性、
他の薬剤抵抗性を持つものでも本発明の範囲に含
まれる。特に、上記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ
阻害剤耐性に加え、、Ｌ−イソロイシンまたは、
Ｌ−ロイシンに対する栄養要求性ないしleaky型
要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸など
スレオニン代謝拮抗物質に対する耐性およびエチ
オニンなどメチオニン代謝拮抗物質に対する耐性
は、Ｌ−スレオニン生成能に有効に作用するの
で、これらのいくつかの特性ないしはすべての特
性をあわせ持つ微生物がより好ましく用いられ
る。 本発明で用いられる変異株の代表的なものとし
ては、例えば、プロビデンシア・レトゲリ
OTR28−70（FERM Ｐ−9193）が挙げられる。 この変異株は、プロビデンシア・レトゲリTP6
−28（α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、
Ｌ−エチオニン耐性、チアイソロイシン耐性、Ｌ
−イソロイシン要求性、Ｌ−ロイシン要求性）を
親株として、通常の変異処理方法によつて得られ
たもので、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤の
うち、チアミンアナローグから選ばれたオキシチ
アミンに耐性を有する変異株である。 変異株の誘導は、通常の変異処理法によつて行
うことができる。 すなわち、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤
に耐性を有する変異株を得るには親株を紫外線照
射するか、あるいは、変異誘発剤（例えば、Ｎ−
メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、
エチルメタンスルホン酸など）で処理した後、親
株が十分生育できないような濃度のピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ阻害剤を含む固体培地で親株より
有意に生育可能な菌株を取得すればよい。 本発明におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻
害剤耐性株とは、その親株より強い耐性を有する
菌株のことであり、好ましくは、親株の24時間後
の相対生育度が40％以下になるような濃度のピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を含む培地で培養
した場合の相対生育度が50％以上を示すようなも
のをいう。 例えば、オキシチアミン耐性株の場合は、オキ
シチアミン10ｍＭとなるように添加した培地で培
養した時の24時間後の相対生育度が、無添加の場
合の50％以上のものをオキシチアミン耐性株とい
う。 ここで、相対生育度は培養液の660nｍにおけ
る吸収度を測定し、各菌株のピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ阻害剤を添加していない培養液の吸光度
を100％として表わした場合の相対吸光度で示す。 本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地
は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応
じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地
である。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
でん粉およびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの
ごとき有機酸、グリセロールのごときアルコール
類などを２〜15％、窒素源として、酢酸アンモニ
ウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、
酢酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩、
アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを0.5
〜4.0％、有機微量栄養素としては、Ｌ−イソロ
イシン、Ｌ−ロイシンなどの被要求物質が0.001
〜0.4％、または必要に応じてコーンステイープ
リカー、ペプトン、酵母エキスなど０〜４％をそ
れぞれ適当量含有する培地が好適に用いられる。
これらの他に、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸第１鉄７水和物、硫酸マンガン４−６水
和物などが微量成分として少量添加される。 培養は、好気的条件で行なう。培養の間、培地
のPHは５から９に、温度は24〜37℃に調節し、48
〜120時間振とうまたは通気培養すれば好ましい
結果が得られる。 培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、通
常の方法を用いることができる。例えば、菌体を
除去した培養液をPH２に塩酸で調製したのち、強
酸性カオチンイオン交換樹脂に通液後、希アンモ
ニア水で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後、濃
縮する。これにアルコールを添加し、冷却保存下
で生成した結晶を集め、Ｌ−スレオニンを得るこ
とができる。 ＜実施例＞ 以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ Ａ （オキシチアミン耐性株の分離） プロビデンシア・レトゲリTP6−28（α−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−エチオ
ニン耐性、チアイソロイシン耐性、Ｌ−イソロ
イシン要求性ないしはLeaky型要求性、Ｌ−ロ
イシン要求性）の菌体に常法によりＮ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理
（300μｇ／ml、30℃で20分）したのち、この細
胞をオシキチアミン−HCｇ30ｍＭ、Ｌ−ロイ
シン50mg／添加した寒天培地（コハク酸ナト
リウム0.8％、硫安0.1％、リン酸第１カリウム
0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫酸マグネ
シウム７水和物0.01％を含む完全合成培地）に
塗布した。次に30℃にて、５〜７日培養し、生
じた大きなコロニーを釣菌分離して、オキシチ
アミン耐性株プロビデンシア・レトゲリ
OTR28−70を取得した。 Ｂ （オキシチアミン耐性株の耐性度） 下記第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地
を用いて30℃で６時間振とう培養し、生育した
菌体を集菌し生理食塩水でよく洗浄した。この
菌体懸濁液を、オキシチアミン０、１、５、10
ｍＭの濃度でそれぞれ含む最少培地（培地組
成：コハク酸ナトリウム0.8％、硫安0.1％、リ
ン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウム
0.7％、硫酸マグネシウム水和物0.01％、Ｌ−
イソロイシン0.005％、Ｌ−ロイシン0.005％）
５mlに植菌して、30℃にて14時間培養し、各菌
株の生育度を調べた。その結果は、第１表に示
すとおりである。ただし、オキシチアミンは、
市販のもの（シグマ社製）を用いた。 本発明方法で使用するオキシチアミン耐性株
プロビデンシア・レトゲリOTR28−70では、
親株のプロビデンシア・レトゲリTP6−28と比
較して、オキシチアミンによつて生育が阻害さ
れず、オキシチアミンに対する耐性を獲得して
いることが明らかである。

【表】 各菌株のオキシチアミンを添加していない
培養液の吸光度を100％として表わした。
実施例 ２ （Ｌ−スレオニン生産菌の培養およびＬ−スレ
オニンの生産） 第２表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用い
て30℃、16時間振とうして前培養したのち、115
℃、10分間オートクレーブで滅菌した下記組成の
発酵培地40mlを含む１容三角フラスコに接種
し、30℃、150rpm、振幅３cmの条件下で74時間
培養した。 発酵用培地 グルコース（別滅菌） ８％ （NH₄）₂SO₄ ３％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm Ｌ−イソロイシン 0.005％ Ｌ−ロイシン 0.06％ CaCO₃（別滅菌） ４％ PH ７（KOHで中和） 培養終了後、培養液から菌体、炭酸カルシウム
を除去し、その、液中のＬ−スレオニンを自動ア
ミノ酸分析計（日本電子JLC.200A）を定量した
ところ、第２表に示す結果を得た。

【表】 スレオニン生成収率は、消費グルコースに対す
る生成スレオニン重量収率で表わした。 本発明例のプロビデンシア・レトゲリOTR28
−70は、親株のプロビデンシア・レトゲリTP6−
28と比較して、蓄積量、生成収率とも、顕著に高
いＬ−スレオニンを生産した。 実施例 ３ 第３表に示す各菌株を、液体ブイヨン培地で30
℃、16時間、振とう培養し、これを実施例２の発
酵用培地のうち、（NH₄）₂SO₄を0.5％、グルコー
スを4.0％とした以外は同様の培地800mlを分注し
たガラス製小型ジヤーフアーメンターへ、接種サ
イズ10％となるように接種した。30℃、800rpm、
通気量1vvmにて、通気撹拌培養を開始した。PH
調節および窒素源の供給は、25％アンモニア水で
行ない、PHは、6.5〜8.0に維持した。グルコー
ス、KH₂PO₄、MgSO₄・7H₂O、Ｌ−ロイシンお
よびＬ−イソロイシンを断続的に添加しながら、
64時間培養したところ第３表に示すような結果を
得た。

【表】 プロビデンシア・レトゲリOTR28−70の培養
液より菌体を除き、その液500mlを強カオチン
交換樹脂ダイヤイオンSK−1B（Ｈ型）のカラム
を通した。カラムを水洗後、2Nアンモニア水で
カラムの吸着成分を溶出し、脱色後減圧濃縮し
た。 これにエタノールを加え、冷却し、生成した結
晶を集めて乾燥した結果、純度96％以上のＬ−ス
レオニン32.4ｇを得た。 ＜発明の効果＞ 本発明法により、高い収率および高い蓄積濃度
でＬ−スレオニン生成が可能となり、より安価な
Ｌ−スレオニンの生産が可能となる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プロビデンシア（Providencia）属に属し、
   ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対する耐性
   を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微生
   物を培養して、培養液中にＬ−スレオニンを生成
   蓄積せしめ、前記培養液よりＬ−スレオニンを採
   取することを特徴とする発酵法によるＬ−スレオ
   ニンの製造法。 ２ ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤が、チア
   ミンアナローグである特許請求の範囲第１項記載
   の発酵法によるＬ−スレオニンの製造法。 ３ チアミンアナローグがオキシチアミンである
   特許請求の範囲第２項記載の発酵法によるＬ−ス
   レオニンの製造法。