JPS63254990A - 発酵法によるl−スレオニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるl−スレオニンの製造法Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は発酵法によるL−スレオニンの製造法に関する
ものである。
ものである。
〈従来の技術〉
プロビデンシア属に属する微生物を用いる発酵法による
L−スレオニンの製造法としては、メチオニン代謝拮抗
物質に耐性を有し、かつ、L−スレオニン生産性を有す
る微生物を用いる方法(特開昭61−216698号公
報)や、生育のためにL−ロイシンを必要とし、かつL
−iレオニン生産能を有する微生物を用いる方法(特開
昭61−260891号公報)が知られている。
L−スレオニンの製造法としては、メチオニン代謝拮抗
物質に耐性を有し、かつ、L−スレオニン生産性を有す
る微生物を用いる方法(特開昭61−216698号公
報)や、生育のためにL−ロイシンを必要とし、かつL
−iレオニン生産能を有する微生物を用いる方法(特開
昭61−260891号公報)が知られている。
〈発明が解決しようとする問題点〉
しかし、これらの方法によるL−スレオニンの生成蓄積
濃度、または、糖などの原料からのし一スレ・オニン生
成収率は十分に満足できるものではなかっな。
濃度、または、糖などの原料からのし一スレ・オニン生
成収率は十分に満足できるものではなかっな。
く問題点を解決するための手段および作用〉本発明者ら
は、さらに生産性の高いし−スレオニンの製造方法につ
いて鋭意研究した結果、プロビデンシア属に属しL〜ス
レオニン生産能を有する微生物に、ピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ阻害剤に対する耐性を付与することにより、し
−スレオニン生産性が向上することを見出し本発明に到
達した。
は、さらに生産性の高いし−スレオニンの製造方法につ
いて鋭意研究した結果、プロビデンシア属に属しL〜ス
レオニン生産能を有する微生物に、ピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ阻害剤に対する耐性を付与することにより、し
−スレオニン生産性が向上することを見出し本発明に到
達した。
すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属し、ピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対する耐性を有し、かつ
L−スレオニン生産能を有する微生物を培養して、培養
液中にL−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培養液よ
りL−スレオニンを採取することを特徴とする発酵法に
よるL−スレオニンの製造法である。
ン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対する耐性を有し、かつ
L−スレオニン生産能を有する微生物を培養して、培養
液中にL−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培養液よ
りL−スレオニンを採取することを特徴とする発酵法に
よるL−スレオニンの製造法である。
ここで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤とは、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼによるピルビン酸からアセチル
CoAを生成する反応を阻害し、その結果微生物の生育
を抑制する物質のことである。
ビン酸デヒドロゲナーゼによるピルビン酸からアセチル
CoAを生成する反応を阻害し、その結果微生物の生育
を抑制する物質のことである。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤としては、例えばフ
ルオロピルビン酸、ブロモピルビン酸、グリオキシル酸
、チアミンアナローグなどが挙げられ、好ましくはチア
ミンアナローグが用いられる。好ましく使用できるチア
ミンアナローグとしてはたとえばオキシチアミン、デア
ミノチアミン、チアミンチアゾール、とリチアミンなど
が挙げられ、このうちオキシチアミンが特に好ましく用
いられる。
ルオロピルビン酸、ブロモピルビン酸、グリオキシル酸
、チアミンアナローグなどが挙げられ、好ましくはチア
ミンアナローグが用いられる。好ましく使用できるチア
ミンアナローグとしてはたとえばオキシチアミン、デア
ミノチアミン、チアミンチアゾール、とリチアミンなど
が挙げられ、このうちオキシチアミンが特に好ましく用
いられる。
本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属しく
バージ−のマニュアル・オブ・システマティク・バクテ
リオロジー第−巻(1984)、第495〜496頁に
従う)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対して耐
性を有する微生物である。
バージ−のマニュアル・オブ・システマティク・バクテ
リオロジー第−巻(1984)、第495〜496頁に
従う)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対して耐
性を有する微生物である。
かかる性質を有していれば、池の栄養要求性、他の薬剤
抵抗性を持つものでも本発明の範囲に含まれる。特に、
上記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤耐性に加え1、
L−イソロイシンまたは、L−ロイシンに対する栄養要
求性ないしl e aky型要求性、α−アミノ−β−
ヒドロキシ吉草酸なとスレオニン代謝拮抗物質に対する
耐性およびエチオニンなどメチオニン代謝拮抗物質に対
する耐性は、L−スレオニン生成能に有効に作用するの
で、これらのいくつかの特性ないしはすべての特性をあ
わせ持つ微生物がより好ましく用いられる。
抵抗性を持つものでも本発明の範囲に含まれる。特に、
上記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤耐性に加え1、
L−イソロイシンまたは、L−ロイシンに対する栄養要
求性ないしl e aky型要求性、α−アミノ−β−
ヒドロキシ吉草酸なとスレオニン代謝拮抗物質に対する
耐性およびエチオニンなどメチオニン代謝拮抗物質に対
する耐性は、L−スレオニン生成能に有効に作用するの
で、これらのいくつかの特性ないしはすべての特性をあ
わせ持つ微生物がより好ましく用いられる。
本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては、例
えば、プロビデンシア・レトゲリOTR28−70(F
ERM P−9193)が挙げられる。
えば、プロビデンシア・レトゲリOTR28−70(F
ERM P−9193)が挙げられる。
この変異株は、プロビデンシア・レトゲリTP6−28
(α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、L−エチ
オニン耐性、チアイソロイシン耐性、し−イソロイシン
要求性、L−ロイシン要求性)を親株として、通常の変
異処理方法によって得られたもので、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼ阻害剤のうち、チアミンアナローグから選ば
れたオキシチアミンに耐性を有する変異株である。
(α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、L−エチ
オニン耐性、チアイソロイシン耐性、し−イソロイシン
要求性、L−ロイシン要求性)を親株として、通常の変
異処理方法によって得られたもので、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼ阻害剤のうち、チアミンアナローグから選ば
れたオキシチアミンに耐性を有する変異株である。
変異株の誘導は、通常の変異処理法によって行うことが
できる。
できる。
すなわち、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に耐性を
有する変異株を得るには親株を紫外線照射するか、ある
いは、変異誘発剤(例えば、N−メチル−N−m:トロ
ーN−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸な
ど)で処理した後、親株が十分生育できないような濃度
のピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を含む固体培地で
親株より有意に生育可能な菌株を取得すればよい。
有する変異株を得るには親株を紫外線照射するか、ある
いは、変異誘発剤(例えば、N−メチル−N−m:トロ
ーN−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸な
ど)で処理した後、親株が十分生育できないような濃度
のピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を含む固体培地で
親株より有意に生育可能な菌株を取得すればよい。
本発明におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤耐性
株とは、その親株より強い耐性を有する菌株のことであ
り、好ましくは、親株の24時間後の相対生育度が40
%以下になるような濃度のピルビン酸デヒドロゲナーゼ
阻害剤を含む培地で培養した場合の相対生育度か50%
以上を示すようなものをいう。
株とは、その親株より強い耐性を有する菌株のことであ
り、好ましくは、親株の24時間後の相対生育度が40
%以下になるような濃度のピルビン酸デヒドロゲナーゼ
阻害剤を含む培地で培養した場合の相対生育度か50%
以上を示すようなものをいう。
例えば、オキシチアミン耐性株の場合は、オキシチアミ
ン10mMとなるように添加した培地で培養した時の2
4時間後の相対生育度が、無添加の場合の50%以上の
ものをオキシチアミン百(性株という。
ン10mMとなるように添加した培地で培養した時の2
4時間後の相対生育度が、無添加の場合の50%以上の
ものをオキシチアミン百(性株という。
ここで、相対生育度は培養液の660 nmにおける吸
光度を測定し、各菌株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻
害剤を添加していない培養液の吸光度を100%として
表わした場合の相対吸光度で示す。
光度を測定し、各菌株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻
害剤を添加していない培養液の吸光度を100%として
表わした場合の相対吸光度で示す。
本発明におけるL−スレオニン生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその曲の有機
微量成分を含有する通常の培地である。
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその曲の有機
微量成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、でん粉お
よびセルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、フマー
ル酸、クエン酸、コハク酸などのごとき有n酸、グリセ
ロールのごときアルコール頚などを2〜15%、窒素源
として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウムのごときg(3アンモニウム
塩、アンモニアガス、アニモニア水、尿素などを0.5
〜4.0%、有機微量栄養素としては、L−インロイシ
ン、L−ロイシンなどの被要求物質が0.001〜0.
4%、または必要に応じてコーンステイープリカー、ペ
プトン、酵母エキスなど0〜4%をそれぞれ適当量含有
する培地が好適に用いられる。これらの他に、リン酸カ
リウム、硫酸マグネシウム、硫酸第1鉄7水相物、硫酸
マンガン4−6水和物などが微量成分として少量添加さ
れる。
よびセルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、フマー
ル酸、クエン酸、コハク酸などのごとき有n酸、グリセ
ロールのごときアルコール頚などを2〜15%、窒素源
として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウムのごときg(3アンモニウム
塩、アンモニアガス、アニモニア水、尿素などを0.5
〜4.0%、有機微量栄養素としては、L−インロイシ
ン、L−ロイシンなどの被要求物質が0.001〜0.
4%、または必要に応じてコーンステイープリカー、ペ
プトン、酵母エキスなど0〜4%をそれぞれ適当量含有
する培地が好適に用いられる。これらの他に、リン酸カ
リウム、硫酸マグネシウム、硫酸第1鉄7水相物、硫酸
マンガン4−6水和物などが微量成分として少量添加さ
れる。
培養は、好気的条件で行なう。培養の間、培地のpHは
5から9に、温度は24〜37°Cに調節し、48〜1
20時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得
られる。
5から9に、温度は24〜37°Cに調節し、48〜1
20時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得
られる。
培!e液よりL−スレオニンを採取するには、通常の方
法を用いることができる。例えば、菌体を除去した培養
液をpH2に塩酸で調製したのち、強酸性カチオンイ
オン交換樹脂に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶
出し、脱アンモニア後、濃縮する。これにアルコールを
添加し、冷却保存下で生成した結晶を集め、L−スレオ
ニンを得ることができる。
法を用いることができる。例えば、菌体を除去した培養
液をpH2に塩酸で調製したのち、強酸性カチオンイ
オン交換樹脂に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶
出し、脱アンモニア後、濃縮する。これにアルコールを
添加し、冷却保存下で生成した結晶を集め、L−スレオ
ニンを得ることができる。
〈実施例〉
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例I
A、(オキシチアミン耐性株の分離)
プロビデンシア・レトゲリTP6−28(α−アミノ−
β−bドロキシ吉草酸耐性、L−エチオニン耐性、チア
イソロイシン耐性、L−インロイシン要求性ないしはL
eaky型要求性、L−ロイシン要求性)の菌体に常法
によりN−メチル−N−一二トローN−二トロングアニ
ジン処理(300μg / ml、30°Cで20分)
したのち、この細胞をオキシチアミン−HC130mM
、L−ロイシン50 rut / fl添加した寒天培
地(コハク酸ナトリウム0.8%、硫安0.1%、リン
酸第1カリウム0.3%、リン酸第2カリウム0.7%
、硫酸マグネシウム7水和物0.01%を含む完全合成
培地)に塗布した6次に30℃にて、5〜7日培養し、
生じた大きなコロニーを釣菌分離して、オキシチアミン
耐性株グロビデンシア・レトゲリ0TR28−70を取
得した。
β−bドロキシ吉草酸耐性、L−エチオニン耐性、チア
イソロイシン耐性、L−インロイシン要求性ないしはL
eaky型要求性、L−ロイシン要求性)の菌体に常法
によりN−メチル−N−一二トローN−二トロングアニ
ジン処理(300μg / ml、30°Cで20分)
したのち、この細胞をオキシチアミン−HC130mM
、L−ロイシン50 rut / fl添加した寒天培
地(コハク酸ナトリウム0.8%、硫安0.1%、リン
酸第1カリウム0.3%、リン酸第2カリウム0.7%
、硫酸マグネシウム7水和物0.01%を含む完全合成
培地)に塗布した6次に30℃にて、5〜7日培養し、
生じた大きなコロニーを釣菌分離して、オキシチアミン
耐性株グロビデンシア・レトゲリ0TR28−70を取
得した。
B、(オキシチアミン耐性株の耐性度)下記第1表に示
す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて30℃で6時間振
どう培養し、生育した菌体を集菌し生理食塩水でよく洗
浄した。この菌体懸濁液を、オキシチアミン0.1.5
.10mMの濃度でそれぞれ含む最少培地(培地組成:
コハク酸ナトリウム0.8%、硫安0.1%、リン酸第
1カリウム0゜3%、リン酸第2カリウム0.7%、硫
酸マグネシウム7水和物0.01%、L−インロイシン
0.005%、L−oイレン0.005%)5mlに植
菌して、30’Cにて14時間培養し、各菌株の生育度
を調べた。その結果は、第1表に示すとおりである。た
だし、オキシチアミンは、市販のもの(シグマ社製)を
用いた。
す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて30℃で6時間振
どう培養し、生育した菌体を集菌し生理食塩水でよく洗
浄した。この菌体懸濁液を、オキシチアミン0.1.5
.10mMの濃度でそれぞれ含む最少培地(培地組成:
コハク酸ナトリウム0.8%、硫安0.1%、リン酸第
1カリウム0゜3%、リン酸第2カリウム0.7%、硫
酸マグネシウム7水和物0.01%、L−インロイシン
0.005%、L−oイレン0.005%)5mlに植
菌して、30’Cにて14時間培養し、各菌株の生育度
を調べた。その結果は、第1表に示すとおりである。た
だし、オキシチアミンは、市販のもの(シグマ社製)を
用いた。
本発明方法で使用するオキシチアミン耐性株プロビデン
シア・レトゲリ0TR28−70では、親株のプロビデ
ンシア・レトゲリTP6−28と比較して、オキシチア
ミンによって生育が阻害されず、オキシチアミンに対す
る耐性を獲得していることが明らかである。
シア・レトゲリ0TR28−70では、親株のプロビデ
ンシア・レトゲリTP6−28と比較して、オキシチア
ミンによって生育が阻害されず、オキシチアミンに対す
る耐性を獲得していることが明らかである。
実線例2
(し−スレオニン生産菌の培養およびL−スレオニンの
生産) 第2表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて30″
C116時間振とうして前培養したのち、115’C1
10分間オートクレーブで滅菌した下記組成の発酵培地
40の1を含むIL容三角フラスコに接種し、30°C
1150rpI、振幅3■の条件下で74時間培養した
。
生産) 第2表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて30″
C116時間振とうして前培養したのち、115’C1
10分間オートクレーブで滅菌した下記組成の発酵培地
40の1を含むIL容三角フラスコに接種し、30°C
1150rpI、振幅3■の条件下で74時間培養した
。
発 酵 用 培 地
グルコース(別滅菌) 8 %(NH< )2
304 3 %Kl(□PO20,1% MgSO4・7H200,04% Fe 2plul1M n
2 pl)I’し一イ
ソロイシン 0.005 %L−ロイシン
0.06 %CaC0,(別滅菌) 4
%pH7(に011で中和) 培養終了後、培養液から菌体、炭酸カルシウムを除去し
、その 液中のL−スレオニンを自動アミノ酸分析計(
日本電子JLC,200A)で定量したところ、第2表
に示す結果を得た。
304 3 %Kl(□PO20,1% MgSO4・7H200,04% Fe 2plul1M n
2 pl)I’し一イ
ソロイシン 0.005 %L−ロイシン
0.06 %CaC0,(別滅菌) 4
%pH7(に011で中和) 培養終了後、培養液から菌体、炭酸カルシウムを除去し
、その 液中のL−スレオニンを自動アミノ酸分析計(
日本電子JLC,200A)で定量したところ、第2表
に示す結果を得た。
スレオニン生成敗率は、消費グルコースに対する生成ス
レオニン重量収率で表わした。
レオニン重量収率で表わした。
本発明例のグロビデンシア・レトゲリ0TR28−70
は、親株のグロビデンシア・レトゲリTP6−28と比
較して、蓄積量、生成収率とも、閉著に高いL−スレオ
ニンを生産した。
は、親株のグロビデンシア・レトゲリTP6−28と比
較して、蓄積量、生成収率とも、閉著に高いL−スレオ
ニンを生産した。
実施例3
第3表に示す各菌株を、液体ブイヨン培地で30℃、1
6時間、振どう培養し、これを実施例2の発酵用培地の
うち、(NH4)2 SO4を0.5%、グルコースを
4.0%とした以外は同様の培地800m1を分注した
ガラス製小型ジャーファーメンタ−へ、接種サイズ10
%となるように接種した。30°C1800rpn、通
気量I VVIIにて、通気撹拌培養を開始した。PH
調節および窒素源の供給は、25%アンモニア水で行な
い、pHは、6.5〜8.0に維持した。グルコース、
KH2PO4、MgSO4・7H,01L−ロイシンお
よびL−インロイシンをl!yr続的に添加しながら、
64時間培養したところ第3表に示すような結果を得た
。
6時間、振どう培養し、これを実施例2の発酵用培地の
うち、(NH4)2 SO4を0.5%、グルコースを
4.0%とした以外は同様の培地800m1を分注した
ガラス製小型ジャーファーメンタ−へ、接種サイズ10
%となるように接種した。30°C1800rpn、通
気量I VVIIにて、通気撹拌培養を開始した。PH
調節および窒素源の供給は、25%アンモニア水で行な
い、pHは、6.5〜8.0に維持した。グルコース、
KH2PO4、MgSO4・7H,01L−ロイシンお
よびL−インロイシンをl!yr続的に添加しながら、
64時間培養したところ第3表に示すような結果を得た
。
プロビデンシア・レトゲリ0TR28−70の培養液よ
り菌体を除き、そのP液500m1を強力チオン交換樹
脂ダイヤイオン5K−IB(H型)のカラムを通した。
り菌体を除き、そのP液500m1を強力チオン交換樹
脂ダイヤイオン5K−IB(H型)のカラムを通した。
カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラムの吸着成分
を溶出し、脱色後減圧濃縮した。
を溶出し、脱色後減圧濃縮した。
これにエタノールを加え、冷却し、生成した結晶を集め
て乾燥した結果、純度96%以上のL−スレオニン32
.4gを得た。
て乾燥した結果、純度96%以上のL−スレオニン32
.4gを得た。
〈発明の効果〉
本発明法により、高い収率および高い蓄積濃度でL−ス
レオニン生成が可能となり、より安価なL−スレオニン
の生産が可能となる。
レオニン生成が可能となり、より安価なL−スレオニン
の生産が可能となる。
Claims (3)
- (1)プロビデンシア(Prividencia)属に
属し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対する耐性
を有し、かつL−スレオニン生産能を有する微生物を培
養して、培養液中にL−スレオニンを生成蓄積せしめ、
前記培養液よりL−スレオニンを採取することを特徴と
する発酵法によるL−スレオニンの製造法。 - (2)ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤が、チアミン
アナローグである特許請求の範囲第1項記載の発酵法に
よるL−スレオニンの製造法。 - (3)チアミンアナローグがオキシチアミンである特許
請求の範囲第2項記載の発酵法によるL−スレオニンの
製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8813287A JPS63254990A (ja) | 1987-04-10 | 1987-04-10 | 発酵法によるl−スレオニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8813287A JPS63254990A (ja) | 1987-04-10 | 1987-04-10 | 発酵法によるl−スレオニンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63254990A true JPS63254990A (ja) | 1988-10-21 |
JPH0346111B2 JPH0346111B2 (ja) | 1991-07-15 |
Family
ID=13934398
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8813287A Granted JPS63254990A (ja) | 1987-04-10 | 1987-04-10 | 発酵法によるl−スレオニンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63254990A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003076635A1 (en) * | 2002-03-13 | 2003-09-18 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae |
-
1987
- 1987-04-10 JP JP8813287A patent/JPS63254990A/ja active Granted
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003076635A1 (en) * | 2002-03-13 | 2003-09-18 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0346111B2 (ja) | 1991-07-15 |
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JPS6324679B2 (ja) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
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