JPS6374487A - 発酵法によるl−スレオニンの製造法 - Google Patents

発酵法によるl−スレオニンの製造法

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JPS6374487A
JPS6374487A JP21927886A JP21927886A JPS6374487A JP S6374487 A JPS6374487 A JP S6374487A JP 21927886 A JP21927886 A JP 21927886A JP 21927886 A JP21927886 A JP 21927886A JP S6374487 A JPS6374487 A JP S6374487A
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勝成 山田
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は発酵法によるL−スレオニンの製造法に関する
ものである。
[従来の技術] プロビデンシア属に属する微生物を用いる発酵法による
L−スレオニンの製造法としては、メチオニン代謝拮抗
物質に耐性を有し、かつスレオニン生産性を有する微生
物を用いる方法(特開昭60−180597号公報)が
知られている。
[発明が解決しようとする問題点] しかし、この方法によるL−スレオニンの生成蓄積濃度
、または、糖などの原料からの1−スレオニン生成収率
は十分に満足できるものではなかった。
[問題点を解決するための手段および作用]本発明者ら
は、ざらに生産性の高いL−スレオニンの製造方法につ
いて鋭意研究した結果、プロビデンシア属に属しL−ス
レオニン生産能を有する微生物にイソロイシン代謝拮抗
物質に対する耐性およびアスパラギン酸代謝拮抗物質に
対する耐性を付与することにより、L−スレオニン生産
性が向上すること、または、副生アミノ酸が減少するこ
とを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属しイソロイ
シン代謝拮抗物質に対する耐性およびアスパラギン酸代
謝拮抗物質に対する耐性を有し、かつL−スレオニン生
産能を有する微生物を培養して培養液中に1−スレオニ
ンを蓄積せしめ、該培養液よりL−スレオニンを採取す
ることを特徴とする発酵法によるL−スレオニンの製造
法である。
ここで、イソロイシン代謝拮抗物質とは、プロビデンシ
ア属に属する微生物の1)生育を阻害し、その生育阻害
が1−イソロイシンの添加により回復する物質、または
、2)L−イソロイシン生合成系に関与する酵素の抑制
作用および、阻害作用を示す物質のことである。イソロ
イシン代謝拮抗物質としては、例えばチアイソロイシン
、0−メチルスレオニン、イソロイシンヒドロキサメー
ト等が挙げられる。
また、アスパラギン酸代謝゛拮抗物質とは、プロビデン
シア属に属する微生物の1)生育を阻害し、その生育阻
害がL−アスパラギン酸の添加により回復する物質また
は2>1−アスパラギン酸生合成系に関与する酵素の抑
制作用および阻害作用を示し、その抑制あるいは阻害が
L−アスパラギン酸の添加により回復する物質のことで
ある。
アスパラギン酸代謝拮抗物質としては、例えばアスパラ
ギン酸ヒドロキサメート、α−メチルアスパラギン酸、
β−メチルアスパラギン酸、システィンスルフィン酸、
ジフルオロコハク酸、ハダシジン等が挙げられる。
本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属しく
バージ−のマニュアル◆オブ・システマティク・バクテ
リオロジー第一!(1984)、第495〜496真に
従う)、インロイシン代謝拮抗物質ならびにアスパラギ
ン酸代謝拮抗物質に耐性を有する微生物である。かかる
性質を有していれば、伯の栄養要求性、他の薬剤抵抗性
を持つもので本発明の範囲に含まれる。
また、L−イソロイシン要求性、L−ロイシン要求性、
α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等スレオニン代謝拮
抗物質に対する耐性およびエチオニン等メチオニン代謝
拮抗物質に対する耐性は、し−スレオニン生成能に有効
に作用するので、これらのいくつかの特性ないしはすべ
ての特性をあわせ持つ微生物が親株としてより好ましく
用いられる。また、これらの特性は通常の変異誘導操作
により付与することが可能である。ここでいう栄養要求
性とは広義の意味であり、不完全欠失型(いわゆるI 
eaky型)も含むものである。さらに、その要求物質
の生合成前駆物質で要求性が満足される場合も含′むも
のである。
本発明で用いられる変異株の代表なものとしては例えば
以下のものがある。プロビデンシア・レトゲリ AXR
2G−10(FERMBP−1’138)、プロビデン
シア・レトゲリTP7−55(FERM  BP−11
37)。
これらの変異株は、それぞれ、プロビデンシア・レトゲ
リ TP3−105 (α−アミノ−β−ヒドロキシ古
草酸耐性、L−イソロイシン要求性、し−エチオニン耐
性、L−ロイシン要求性)を親株として、通常の変異処
理方法によって得られたもので、チアイソロイシンおよ
びアスパラギン酸ヒドロキサメートに耐性を有する変異
株である。
変異株の誘導は、親株を紫外線照射するか、あるいは、
変異誘発剤(例えば、N−メチル−N′−二トローN−
ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸等)で処
理した後、親株が生育できないような濃度のイソロイシ
ン代謝拮抗物質を含む固体培地で生育可能な菌株を取得
すればよい。さらに、得られた変異株を変異処理し、親
株が生育できないような濃度のアスパラギン酸代謝拮抗
物質を含む固体培地で生育可能な菌株を取得すればよい
。 また、先に、アスパラギン酸代謝拮抗物質に対する
耐性株を分離したのちに、イソロイシン代謝拮抗物質に
対する耐性株を分離することもでき、この変異株も本発
明において、用いることができる。
本発明におけるイソロイシン代謝拮抗物質耐性株とは、
その親株より強い耐性を有する菌株のことであり、好ま
しくは、親株の24時間後の相対生育度が40%以下に
なるような濃度のイソロイシン代謝拮抗物質を含む培地
で培養した場合の相対生育度が50%以上を示すような
ものを言う。
例えば、チアイソロイシン耐性株の場合は、チアイソロ
イシン5mMとなるように添加した培地で培養した時の
24時間後の生育度が、無添加の場合の50%以上のも
のをチアイソロイシン耐性株という。
また、アスパラギン酸代謝拮抗物質耐性変異株とは親株
よりアスパラギン酸代謝拮抗物質に強い耐性を有する株
のことであり、好ましくは親株の相対生育度が30%以
下を示すアスパラギン酸代謝拮抗物質の濃度範囲におい
て60%以上の相対生育度を示す変異株のことでおる。
ここで、相対生育度は培養液の660nmにおける吸光
度を測定し、各菌株のイソロイシン代謝拮抗物質、また
、アスパラギン酸代謝拮抗物質を添加していない培養液
の吸光度を100%として表わした場合の相対吸光度で
示す。本発明において用いる菌株とその親株のデアイソ
ロイシンおよびDL−アスパラギン酸ヒドロキサメート
に対する耐性を検定した結果を実施例2に示す。
本発明におけるL−スレオニン生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機
微量成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、でん粉お
よびセルロースの加水分解物、糖蜜等の糖類、フマール
酸、クエン酸、コハク酸等の如き有機酸、グリセロール
の如きアルコール類等を2〜15%、窒素源として、酢
酸アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸
アンモニウムの如き無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニウム、尿素等を0゜5〜4.0%、有機微
量栄養素としては、L−イソロイシン等の被要求物質が
0.001〜0゜4%、または必要に応じてコーンステ
イープリカー、ペプトン、酵母エキス等O〜4%をそれ
ぞれ適当量含有する培地が好適に用いられる。
これらの仙リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、5M酸
第1鉄7水和物、硫酸マンガン4−6水和物等が微量成
分として少量添加される。
培養は、好気的条件で行なう。培養の間、培地のpI(
は5から9に、温度は24〜37℃に調節し、48〜1
20時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得
られる。
培養液よりL−スレオニンを採取するには、通常の方法
を用いることができる。例えば、菌体を除去した培養ン
戸液を112に塩酸で調製したのち、強酸性カチオンイ
オン交換樹脂に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶
出し、脱アンモニア後、濃縮する。これにアルコールを
添加し、冷却保存下で生成した結晶を集め、L−スレオ
ニンを得ることができる。
〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例1 A、(チアイソロイシン耐性株の分離)プロビデンシア
・レトゲリTP3−105(α−アミノ−β−ハイドロ
キシ吉草酸耐性、L−イソロイシン要求性ないしは L
eaky型要求性、L−エチオニン耐性、L−aイシン
要求性)あるいは、プロどデンシア・レトゲリ AHX
R7665(α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性
、L−イソロイシン要求性ないしは、Leaky型要求
性、L−エチオニン耐性、L−ロイシン要求性、DL−
アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性)の菌体に、常法
によりN−メチル−N′−二トローN−二トロソグアニ
ジン処理(300tly/d、30℃で20分)したの
ち、この細胞を、D。
L−チアイソロイシン1.5’J/1、L−ロイシン2
 g/j2、L−バリン2g/(添加した寒天培地(グ
ルコース0.5%、硫安0.1%、リン酸第1カリウム
0.3%、リン酸第2カリウム0.7%、硫酸マグネシ
ウム7水和物0.01%を含む完全合成培地)に塗布し
た。次に30’Cにて、5〜7日培養し、生じた大きな
コロニーを釣菌分離して、チアイソロイシン耐性株(親
株をプロビデンシア・レトゲリ TP3−105とした
ものからはプロビデンシア・レトゲリ TP6−28、
親株をプロビデンシア・レトゲリ AI−IXR766
5としたものからはプロビデンシア・レトゲリTP7−
55>を取得した。
B、(DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性株の
分離) プロビデンシア・レトゲリ TP6−28(α−アミノ
−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、1−イソロイシン要求性
ないしはLeaky型要求性、L−エチオニン耐性、L
−ロイシン要求性、チアイソロイシン耐性)あるいはプ
ロビデンシア・レトゲリ TP3−105(α−アミノ
−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、L−イソロイシン要求性
ないしはLeaky型要求性、L−エチオニン耐性、し
−ロイシン要求性)の菌体に常法によりN−メチル−N
−一二トローN−二トロソグアニジン処理(300μg
/d、30℃で10分)した後、この細胞をDL−アス
パラギン酸ヒドロキサメート2 g/J添加した寒天培
地(グリコース0.5%、硫安0.1%、リン酸第1カ
リウム0.3%、リン酸第2カリウム0.7%、硫酸マ
グネシウム7水和物0.01%、L−イソロイシン0.
005%、L−ロイシン0゜005%を含む最少培地)
に塗布した。次に30℃にて6〜8日培養し、生じた大
きなコロニーを釣菌分離して、Dし一アスパラギン酸ヒ
ドロキサメート耐性株(親株をプロビデンシア・レトゲ
リ TP6−28としたものからはプロビデンシア・レ
トゲリ AXR2G−10,親株をプロビデンシア・レ
トゲリ TP3−105としたものからはAHXR76
65)を取得した。
最終的に、チアイソロイシン耐性およびDL−アスパラ
ギン酸ヒドロキサメート耐性をもつ、プロビデンシア・
レトゲリ AXR2G−10およびプロビデンシア・−
レトゲリ TP7−55を取得した。
実施例2 A、(チアイソロイシン耐性株の耐性度)下記第1表に
示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて30℃で16時
間振どう培養し、生育した菌体を集菌し生理食塩水でよ
く洗浄した。この菌体懸濁液を、デアイソロイシン0,
2.5.5.0.107Fl11.Mの濃度で含む最少
培地(培地組成ニゲルコース0.5%、硫安0.1%、
リン酸第1カリウム0.3%、リン酸第2カリウム0゜
7%、硫酸マグネシウム7水和物0.01%、L−イソ
ロイシン0.001%、L−ロイシン0.05%、L−
バリン0.05%)5dに植菌して、30°Cにて24
時間培養し、各菌株の生育度を調べた。その結果は、第
1表に示すとおりである。ただし、チアイソロイシンは
、市販のもの(シグマ社製)を用いた。
本発明方法で使用するチアイソロイシン耐性株(AXR
2G−10eよ(F  TP7−55>では、親株のプ
ロビデンシア・レトゲリ TP3−105と比較して、
チアイソロイシンによって生育が阻害されず、チアイソ
ロイシンに対する耐性を獲得していることが明らかであ
る。
第  1  表 (注)培養液の660%mにおける吸光度を測定し、各
菌株のチアイソロイシンを添加していない培養液の吸光
度を100%として表わした。
B、(DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性変異
株の耐性度〉 下記第2表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて3
0℃で16時間振とう培養し、生育した菌体を集菌し生
理食塩水で洗浄した。この菌体懸濁液をDL−アスパラ
ギン酸ヒドロキサメート0,0.25.0゜5.1.0
,2.0g/lの濃度で含む最少培地(グルコース0.
5%、硫安0.1%、リン酸第1カリウム0.3%、リ
ン酸第2カリウム0.7%、硫酸マグネシウム7水和物
0.01%、L−イソロイシン0゜005%、L−ロイ
シン0.005%)5dに植菌して、30℃にて培養し
各菌株の24時間後の生育度を調べた。その結果は第2
表に示すとおりである。本発明方法で使用するDL−ア
スパラギン酸ヒドロキサメートに耐性な変異株(プロビ
デンシア・レトゲリAXR2G−10およびTP7−5
5では、親株のプロビデンシア・レトゲリ TP3−1
05と比較して、高濃度のDし一アスパラギン酸ヒドロ
キサメートによって生育が阻害されず、強いDL−アス
パラギン酸ヒドロキサメート耐性を獲得していることを
示している。
第  2  表 □□了]■ (注)培養液の660%mにおける吸光度を測定し、各
菌株のDL−アスパラギン酸ヒドロキサメートを添加し
ていない培養液の吸光度を100%として表わした。
寅施例3 (L−レスニオン生産菌の培養およびL−スレオニンの
生産) 第3表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培地で30
℃、16時間振とうして前培養したのち、115℃、1
0分間オートクレーブで滅菌した下記組成の発酵培地4
0dを含む11容三角フラスコに接種し、30℃、15
0 r pm、振幅3cmの条件下で74時間培養した
発酵用培地 グルコース(別滅菌)     8 %(NH4) 2
804      3  %K1−12PO40,1% MgSO4・71−120  0.04  %Fe” 
            21)l)mMn++29D
m L−イソロイシン   0.005  %L−ロイシン
      0.06  %CaC03(別滅菌)  
   4 %p)−17(にOHで中和) 培養終了後、培養液から菌体、炭酸カルシウムを除去し
、その炉液中のL−スレオニンを自動アミノ酸分析計(
日本電子JLC,20OA>で定量したところ、第3表
に示す結果を得た。
第  3  表 スレオニン生成収率は、消費グルコースに対する生成ス
レオニン重量収率で表わした。
本発明例のプロビデンシア・レトゲリ AXR2G−1
0,TP7−55は、それぞれその親株のプロビデンシ
ア・レトゲリTP3−105と比較して、蓄積量、生成
数率とも、顕著に高いL−スレオニンを生産した。
実施例4 第4表に示す各菌株を、液体ブイヨン培地で30℃、1
6時間、振どう培養し、これを実施例3の発酵用培地の
うち、(NH4)2SO4を0.5%、グルコースを4
.0%とした以外は同様の培地800mを分注したガラ
ス製小型ジャーファーメンタ−へ、接種サイズ10%と
なるように接種した。30℃、aoorpm。
通気量1vvmにて、通気攪拌培養を開始した。
1)H調節および窒素源の供給は、25%アンモニア水
で行ない、pHは、6.5〜8.0に維持した。グルコ
ース、KH2PO4、vchso−4・7H20、L−
ロイシンおよびL−イソロイシンを断続的に添加しなが
ら、64時間培養したところ第4表に示すような結果を
得た。
プロビデンシア・レトゲリTP7−55の培養液より菌
体を除き、そのン戸液500dを強力チオン交換樹脂ダ
イヤイオン5K−IB (H型)のカラムを通した。カ
ラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラムの吸着成分を
溶出し、脱色後減圧濃縮した。
これにエタノールを加え、冷却し、生成した結晶を集め
て乾燥した結果、純度96%以上のL−スレオニン31
.99が得られ、安価なL−スレオニンの生産が可能と
なる。
また、本発明法により、バリンの副生を抑制し、高純度
のL−スレオニン生産が可能となり、精製工程を簡略化
でき、工業的実用化が有利となる。
特許出願大東し株式会社

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)プロビデンシア属に属し、イソロイシン代謝拮抗
    物質に対する耐性およびアスパラギン酸代謝拮抗物質に
    対する耐性を有し、かつL−スレオニン生産能を有する
    微生物を培養して培養液中にL−スレオニンを生成蓄積
    せしめ、前記培養液よりL−スレオニンを採取すること
    を特徴とする発酵法によるL−スレオニンの製造法。
  2. (2)イソロイシン代謝拮抗物質がチアイソロイシンで
    ある特許請求の範囲第1項記載の発酵法によるL−スレ
    オニンの製造法。
  3. (3)アスパラギン酸代謝拮抗物質がアスパラギン酸ヒ
    ドロキサメートである特許請求の範囲第1項記載の発酵
    法によるL−スレオニンの製造法。
  4. (4)微生物がプロビデンシア属レトゲリ種に属するも
    のである特許請求の範囲第1項記載の発酵法によるL−
    スレオニンの製造法。
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