JPS6244192A - 発酵法によるl−スレオニンの製造法 - Google Patents

発酵法によるl−スレオニンの製造法

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JPS6244192A
JPS6244192A JP18392485A JP18392485A JPS6244192A JP S6244192 A JPS6244192 A JP S6244192A JP 18392485 A JP18392485 A JP 18392485A JP 18392485 A JP18392485 A JP 18392485A JP S6244192 A JPS6244192 A JP S6244192A
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真 白井
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勝成 山田
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵法によるL−スレオニンの製造法に関する
ものである。
〔従来の技術〕
プロビデンシア属1こ属する微生物を用いる発酵法1コ
よるL−スレオニンの製造法はまだ知られていない。た
だし、パージ−のマニュアル・オプ・クステマテイック
・バクテリオロジー第1%(1984)で一部プロビデ
ンシア属に分類変更された一旧プロチウス属に属する微
生物を用いた発酵法tこよるL−スレオニンの製造方法
としては、L−インロイシン要求株を用いる方法(特公
昭43−4440号公報号公報−アミノ−β−ヒドロキ
ン吉草酸に1ilit性を有し、かつL−インロイシン
要求性を有する微生物を用いる方法(日法農芸化学会講
演要旨集p、 9(1970))が知られている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
しかし、これらの方法によるし一スレオニンの生成蓄積
鏝度、または糖などの原料からのし一スレオニン生成収
率は十分tこ満足できるものではなかった。
〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明者ら
はさらtこ生産性の高いし一スレオニンの製造方法につ
いて鋭意研究した結果、プロビデンシア属1こ属しL−
スレオニン生産能を有する微生物にアスパラギン酸代謝
拮抗物質tこ耐性を付与することにより、L−スレオニ
ン蓄積濃度、生成収率が著しく向上することを見い出し
本発明に到達した。
すなわち、本発明はプロビデンシア属に属し、アスパラ
ギン酸代謝才も抗物質cFtt性を有し、かつL−スレ
オニン生産能を有する微生物を培養して培養液中にL−
スレオニンを蓄積せしめ、該培養液よりL−スレオニン
を採取することを特徴とする発酵法tこよるし一スレオ
ニンの製造法である。
プロビデンシア属tこ属する微生物のアスパラギン酸代
謝拮抗物質に耐性を有する変異株は、これまで分離され
たことがない。また、コリネバクテリウム属Fr−属し
、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有する変異株を
用いてL−リジンを製造することは公知である(特公昭
57−9798号公報)が、本発明のごとく、プロビデ
ンシア属に属する微生物のアスパラギン酸代謝鰺抗物質
1こ1#性を有する変異株が、L−スレオニンを著量生
成蓄積せしめ得ることは、−まったく知られていない。
ここでアスパラギン酸代謝誌抗物質とは、プロビデンシ
ア属に属する微生物のl)生育を工害し、その生育阻害
がL−アスパラギン酸の添加tこより回復する物質また
は2)L−アスパラギン酸生合成系に関与する酵素の抑
制作用および阻害作用を示し、その抑制あるいは阻害が
L−アスパラギン酸の添加により回復する物質のことで
ある。
アスパラギン酸代謝拮抗物質としては、例えばアスパラ
ギン酸ヒドロキサメート、β−メチルアスパラギン酸、
β−メチルアスパラギン酸、ンステインスμフィン酸、
ジフルオロコハク酸、ハダンジン等が挙げられる。本発
明で用いられる微生物はプロビデンシア属1こ属しくバ
ージ−のマニュアル・オグ・システマテイツク・パクテ
リオロジーオ・1息、(1984)、第495〜496
頁に従う)、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有す
る微生物である。かかる性質を有していれば、他の要求
性、他の薬剤抵抗性をもつものでも本発明の範囲に含ま
れる。またL−イソロイシン1こ対する栄養要求性およ
びL−ロイ7ン1こ対する栄養要求性、α−アミノ−β
−ヒドロキシ吉吉草酸等スレオニンアナロート対する耐
性およびエチオニン等メチオニンアナローグに対する耐
性はL−スレオニン生成能tこ有効tこ作用するので、
これらのいくつかの特性ないしはすべての特性をあわせ
持つ微生物が親株としてより好ましく用いられる。また
これらの特性は通常の変異誘導操作tこより付与するこ
とが可能である。ここでいう栄養要求性とは広義の意味
であり、不完全欠失型(いわゆる1cal(Y型)も含
むものである。さらにその要求物質の生合成前駆物質で
要求性が満足される場合も含むものである。
本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては例え
ば以下のものがある。プロビデンシア ・ V ト ゲ
 リ  TP  5−2 5  (FERMP   −
8228)。
この変異株はプロビデンシア・レトゲリFPSS  2
 5  (FERLVIP−8227ン 、  (α 
−アミノ−β−ヒドロキシ吉草1i1fft性、L−イ
ソロイシン要求性、L−エチオニン耐性、L−ロイシン
要求性、ピルベートキナーゼ六イー2)を親株として、
通常の変異処理方法によって得られたもので、アスパラ
ギン酸ヒドロキサメートに耐性の変異株である。
変異株の誘導は親株を紫外線照射するか、あるいは変異
誘発剤(例えばN−メ千μ−N’ −ニトロ−N−ニト
ロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸等)で処理し
た後、親株が生育できないような濃度のアスパラギン酸
代謝拮抗物質を含む固体培地で生育可能な菌株を採取す
ればよい。
アスバフギン酸代謝祐抗阻害剤耐性変異株とは親株より
アスパラギン酸代謝Jも抗物質tこ強い耐性を有する株
のことであり、好ましくは親株の相対生育度が30−%
■下−ノを示すアスパラギン酸代謝峰抗物質の濃度範囲
において60%以上の相対生育度を示す変異株のことで
ある。ここで相対生育度は培養液の660 nmにおけ
る吸光度を測定し、各菌株のアスパラギン酸代!1撞抗
物質を添加していない培養液の吸光度を100%として
表わした場合の相対吸光度で示す。耐性を検定する場合
のアスパラギン酸代m粍抗物質は市販のものを用いた。
本発明において用いる菌株とその親株のDL−アスパラ
ギン酸ヒドロキサメートに対する耐性を検定した結果を
実施例1に示す。
本発明におけるL−スレオニア生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機
微量成分を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、フフクトース、でん粉お
よびセルロースの加水分解物、精密等の糖類、77−〜
酸、クエン酸、コハク酸等の如き有機酸、グリセロ−μ
の如きアルコール類等を2〜15%、窒素源として、酢
酸アンモニt ムノQo キ有機アンモニウム塩、硫酸
アンモニウム、塩化7ンモニウム、リン酸アンモニウム
、硝酸アンモニウムの如き無機アンモニウム塩、アンモ
ニアガス、アンモニア水、J素等ヲ0.5〜40 %、
有機微量栄養素としては、L−イソロイシン等の被要求
物質が0.001〜0.4%、または必要1こ応じてコ
ーンステイープリカー、ペプトン、酵母エキス等0〜4
%をそれぞれ適当量含有する培地が好適に用いられる。
これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第1鉄7水和物、硫酸マンガン4−6水和物等が微量成
分として少量添加される。
培養は、好気的条件’t゛h 、rコう、0培養の間、
培地のpHは5から9に、温度は24〜37℃に調節し
、48〜120時間振とぅまたは通気培養すれば好まし
い結果が得られる。
培養液よりL−スレオニンを採取するには、例えば菌体
を除去した培養P液をpH2に塩酸で調製したのち、強
酸性カチオンイオン交換樹脂に通液後、希アンモニア水
で吸着成分を溶出シ、脱アンモニアi、taする。これ
にアルコールを添加し、冷却保存下で生成した結晶を集
め、L−スレオニンを得ることができる。
〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的1こ説明する。
実施例1(DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性
株の分離) プロビデンシア・レトゲリFPSS 25(FERMP
−8827)(α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性
、L−インロイシン要求性、L−エチオニン耐性、L−
ロイシン要求性、 ヒμベートキナーゼウィー・クー)
の菌体に常法によりN−メチμmN′−二トローN−ニ
トロソグアニジン処理(300μg/mJ、30’Cで
10分りした後、この細胞をDL−アスパラギン酸ヒド
ロキサメート2g11m加した寒天培地(グ# :2−
 ス0.596 、 Wit 安0. l 96、リン
酸第1カリウふ0.3 % 、リン酸第2カリウム0,
7%、硫酸マグネシウム7水和物0.01%、L−イン
ロイシン0.005%、L−ロイシン0. O0596
を含む最少培地)tこ塗布した。次トこ30℃にて6〜
8日培養し、生じた大きなコロニーな釣菌分離して、D
L−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性株(プロビデ
ンシア・レト’7’ リTP 5−25(FER−25
(FERノンを取得した。
実施例2(DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性
株異株の耐性度) 下記第1表tこ示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて
30℃で16時間振とう培養し、生育した菌体を集菌し
生理食塩水で洗浄した。この菌体懸濁液をDL−アスパ
ラギン酸ヒドロキサメート0,0.5、Lo、2.0%
10 g/177:)濃度で含む最少培地(グリコース
0.5%、硫安0、1%、リン酸第1カリウム0.3%
、リン酸第2カリウム0.74%硫酸マグネシウム7水
和物0.01%、L−イソaイシン0.00596、L
−ロイyンo、005%)5rlc植菌して、30℃に
て培賛し各菌株の対数増殖中期の生育度を調べた。その
結果は第1表に示すとおりである。本発明方法で使用す
るDL−アスパラギン酸ヒドロキサメートに耐性な変A
株(プロビデンシア・レトゲリTP5−25 (FER
MP−8228))では、親株のプロビデンシア・レト
ゲリFPSS25(FERMP−8227)と比較して
、高濃度のDL−アスパラギン酸ヒドロキサメートによ
って生育が阻害されず、強いDL−アスバヲギン酸ヒド
ロキサメートtm性ヲ獲得していることを示している。
第  1  表 (注)培養液の660i′1mにおける吸光度を測定し
、各菌株のDL−Fスバラギン酸ヒドロキサソートを添
加していない培養液の吸光度を100%として表わした
実施例3(L−スレオニン生産菌の培養およびL−スレ
オニン生産〕 第2表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培地で30
℃、16時間振とうして前培養した後、あらかじめ11
5℃、10分間蒸気減菌した下記組成の主発酵培地40
 mlを含むll容三角フラスコに植え継ぎ30℃、l
 50 rpm。
振幅300Mの条件下で120時間培養した。
発酵用培地 グ/L/7−ス(別減M)      6  %(NH
4h S04          2  %KHI P
O40,196 Mg5O< ・7Hz 0         0.04
96Fe→に              2ppmM
n +6             2 ppmL−イ
ソロイシン    0.0025%L−ロイシン   
   0.0896CaCOs  C別減菌)   4
% pH7,0(KOHで中和) 培養終了後、菌体、炭酸力μシウムを除去したF液中の
L−スレオニン濃度を自動アミノ酸分析計(日本電子J
LC200A)で定量したところ第2表10示すような
結果を得た。
第  2  表 スレオニン生成収率は仕込みグルコース量に対する生成
スレオニンの重量収率で表わした。
L′″″スレオニンの生成収率は親株tこ比べ大幅に向
上した。
培養後、培養液より菌体を除き、その100m1を強力
チオン交換樹脂ダイヤイオン5KIB〔H型〕のカラム
1こ通した。カラムを水洗後、2Nアンモニア水でカラ
ムの吸着成分を溶出し、脱色後減圧濃縮した。これにエ
タノールを加え、冷却し、生成した結晶を集めて乾燥し
た結果、純度9696以上のし一スレオニン結晶15 
g カ得られた。
〔発明の効果〕
本発明法により高蓄積濃度、高収率でL−スレオニン生
成が可能となり、より安価なし一スレオニンの生産が可
能となる。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)プロビデンシア属に属し、アスパラギン酸代謝拮
    抗物質に耐性を有し、かつL−スレオニン生産能を有す
    る微生物を培養して培養液中にL−スレオニンを蓄積せ
    しめ、該培養液よりL−スレオニンを採取することを特
    徴とする発酵法によるL−スレオニンの製造法。
  2. (2)アスパラギン酸代謝拮抗物質がアスパラギン酸ヒ
    ドロキサメートである特許請求の範囲第一項記載の発酵
    法によるL−スレオニンの製造法。
JP18392485A 1985-08-23 1985-08-23 発酵法によるl−スレオニンの製造法 Granted JPS6244192A (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0270052A (ja) * 1988-09-02 1990-03-08 Sumitomo Metal Ind Ltd 溶射補修材料及び補修方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0270052A (ja) * 1988-09-02 1990-03-08 Sumitomo Metal Ind Ltd 溶射補修材料及び補修方法
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