JPH0468916B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〈産業上の利用分野〉 本発明は、発酵法によるＬ−スレオニンの製造
方法に関する。 Ｌ−スレオニンは、必須アミノ酸の１つであり、
医薬品、飼料添加物として重要であり、その安価
な製造方法が望まれている。 〈従来の技術〉 エシエリヒア属に属する微生物を用いた発酵法
によるＬ−スレオニンの製造方法としては、α−
アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性かつイソロ
イシン要求性株を用いる方法（特公昭45−26709
号公報）Ｌ−メチオニンおよびＬ−バリン要求性
株を用いる方法（特公昭46−33195号公報）や、
抗生物質ボレリジンに感受性を有し、かつＬ−メ
チオニンおよびＬ−バリン要求性を有する微生物
を用いる方法（特公昭51−6752号公報）が知られ
ている。 〈発明が解決しようとする問題点〉 しかし、これらの方法によるＬ−スレオニンの
生成濃度または、糖などの原料からのＬ−スレオ
ニン生成収率は、十分に満足できるものではなか
つた。 〈問題点を解決するための手段および作用〉 本発明者らは、さらに生産性の高いＬ−スレオ
ニンの製造方法について、鋭意研究した結果、エ
シエリヒア属に属し、Ｌ−スレオニン生産能を有
する微生物にＬ−イソロイシン代謝拮抗物質に耐
性を付与することによつて、Ｌ−スレオニンの蓄
積濃度、生成収率が著しく向上することを見出
し、本発明に到達した。本発明のごとく、エシエ
リヒア属に属する微生物にイソロイシン代謝拮抗
物質に対する耐性を付与することにより、Ｌ−ス
レオニンの生産量および収率が著しく向上するこ
とはまだ知られていない。 すなわち、本発明は、エシエリヒア属に属し、
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物のうち、イ
ソロイシン代謝拮抗物質に耐性を有する微生物を
培養して、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積
せしめ、該培養液からＬ−スレオニンを採取する
ことを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの
製造方法である。 次に本発明を詳細に説明する。 本発明で用いられる微生物は、エシエリヒア属
に属し、イソロイシン代謝拮抗物質に耐性を有す
る微生物である。 ここで、イソロイシン代謝拮抗物質とは、エシ
エリヒア属に属する微生物の１）生育を阻害し、
その生育阻害がＬ−イソロイシンの添加により回
復する物質、または２）Ｌ−イソロイシン生合成
系の酵素の抑制作用および阻害作用を示す物質の
ことである。 ここで、イソロイシン代謝拮抗物質としては、
例えば、イソロイシンハイドロキサメート、チア
イソロイシン、Ｏ−メチルスレオニン、β−メチ
ルスレオニンなどが挙げらる。かかる性質を有し
ていれば、他の要求性、他の薬剤抵抗性などの性
質を持つものでも本発明の範囲に含まれる。 本発明で用いられる微生物の代表的なものとし
ては、例えば、エシエリヒア・コリＭ−５
（FERMBP−1136）が挙げられる。 この変異株は、エシエリヒア・コリ
ATCC21248（メチオニン、バリン要求性）（特公
昭46−33195号公報参照）から得られたボレリジ
ン感受性のエシエリヒア・コリBS−58より誘導
されたもので、イソロイシン代謝拮抗物質のうち
チアイソロイシンに耐性な変異株である。 変異株の誘導は、通常の変異処理法によつて比
較的容易に行うことができる。すなわち、イソロ
イシン代謝拮抗物質に耐性を有する変異株を得る
には、親株を紫外線照射するか、あるいは変異誘
発剤（例えばＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸な
ど）で処理したのち、親株が十分に生育できない
ような量のイソロイシン代謝拮抗物質を含む培地
で、親株に比べて有意に生育良好な菌株を取得す
ればよい。 本発明におけるイソロイシン代謝拮抗物質耐性
株とは、その親株より強い耐性を有する菌株のこ
とであり、好ましくは親株の24時間後の相対生育
度が40％以下になるようなイソロイシン代謝拮抗
物質濃度を含む培地で培養した場合の相対生育度
が50％以上を示すようなものをいう。 例えば、チアイソロイシン耐性株の場合は、チ
アイソロイシン5mMとなるように添加した培地
で培養した時の24時間後の生育度が、無添加の場
合の50％以上のものをチアイソロイシン耐性株と
いう。ここで生育度は、培養液の660nmにおける
吸光度を測定し、各菌株のイソロイシン代謝拮抗
物質を添加していない培養液の吸光度を100％と
して表わした場合の相対吸光度で示すものとす
る。 本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地
は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応
じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地
である。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
でん粉およびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの
如き有機酸、グリセロールの如きアルコール類な
どを２〜15％、窒素源として、酢酸アンモニウム
の如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウムの如き無機アンモニウム塩、アンモニ
アガス、アンモニア水、尿素などを0.5〜40％、
有機微量栄養素としては、Ｌ−バリンなどの被要
求物質が0.001〜0.4％、または必要に応じてコー
ンステイープリカー、ペプトン、酵母エキスなど
０〜４％をそれぞれ適当量含有する培地が用いら
れる。これらの他に通常、リン酸カリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸第１鉄７水和物、硫酸第２鉄
６水和物、硫酸マンガン４〜６水和物などの微量
成分が少量添加される。 培養は好気的条件で行う。培養の間、培地のPH
は５〜９に、温度は24〜37℃に調節し、48〜120
時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が
得られる。 培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、通
常の方法を用いることができる。例えば菌体を除
去した培養液をPH２に塩酸で調製したのち、強
酸性カチオン交換樹脂に通液後、希アンモニア水
で吸着成分を溶出し、脱アンモニア後濃縮する。
これにアルコールを添加し、冷却保存下で生成し
た結晶を集め、Ｌ−スレオニンを得ることができ
る。 〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ Ａ （チアイソロイシン耐性株の分離） エシエリヒア・コリBS−51（Ｌ−メチオニン要
求性、Ｌ−バリン要求性、ボレリジン感受性）の
菌体に常法によりＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン処理（300μｇ／ml、30℃
で10分）したのち、この細胞をＤ，Ｌ−チアイソ
ロイシン1.5ｇ／、Ｌ−ロイシン２ｇ／、Ｌ
−バリン２ｇ／を添加した寒天培地（グルコー
ス0.5％、硫安0.1％、リン酸第１カリウム0.3％、
リン酸第２カリウム0.7％、硫酸マグネシウム７
水和物0.01％、を含む完全合成培地）に塗布し
た。次に30℃にて、５〜７日培養し、生じた大き
なコロニーを釣菌分離して、チアイソロイシン耐
性株（エシエリヒア・コリＭ−５）を取得した。 Ｂ （チアイソロイシン耐性株の耐性度） 第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用い
て30℃で16時間振とう培養し、生育した菌体を集
菌し生理食塩水でよく洗浄した。この菌体懸濁液
をチアイソロイシンを各々０，５，10mMの濃度
で含む最少培地（培地組成：グルコース0.5％、
硫安0.1％、リン酸第１カルウム0.3％、リン酸第
２カリウム0.7％、硫酸マグネシウム0.01％、Ｌ
−メチオニン0.01％、Ｌ−バリン0.01％）５mlに
植菌して、30℃にて24時間培養し、各菌株の生育
度を調べた。その結果は、第１表に示すとおりで
ある。 ただし、チアイソロイシンは市販のもの（シグ
マ社製）を用いた。 本発明方法で使用するチアイソロイシン耐性株
（Ｍ−５）では、親株のエシエリヒア・コリBS−
58と比較して、チアイソロイシンによつて生育が
阻害されず、チアイソロイシンに対する耐性を獲
得していることが明らかである。

【表】 実施例 ２ 第２表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培
地で30℃、16時間振とうして前培養したのち、あ
らかじめ115℃、10分間蒸気滅菌した下記組成の
主発酵用培地40mlを含む１容エーレンマイヤフ
ラスコに植菌し、30℃、110rpm、振幅５cmの条
件下で72時間培養した。 発酵用培地 グルコース（別滅菌） ５％ （NH₄）₂SO₄ １％ KH₂PO₄ 0.05％ K₂HPO₄ 0.05％ MgSO₄・7H₂Ｏ 0.05％ Fe₂（SO₄）₃・6H₂Ｏ 0.01％ DL−メチオニン 0.006％ Ｌ−バリン 0.04％ CaCO₃（別滅菌） １％ PH 6.8（KOHで調節） 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した
液中のＬ−スレオニン濃度を、自動アミノ酸分
析計（日本電子(株)社製JLC−200A）で定量した
ところ、第２表に示すような結果を得た。

【表】 スレオニン生成収率は、消費グルコースに対す
る生成スレオニンの重量収率で表わした。 本発明例のエシエリヒア・コリＭ−５は、Ｌ−
スレオニンの蓄積濃度、生成収率とも顕著に向上
している。 エーレンマイヤフラスコ６本で培養したエシエ
リヒア・コリＭ−５の培養液より菌体を除き、そ
の200mlを強力カチオン交換樹脂ダイヤイオン
SK・1B（Ｈ型）のカラムに通した。カラムを水
洗後、2Nアンモニア水でカラムの吸着成分を溶
出し、脱色後減圧濃縮した。これにエタノールを
加え、冷却し、生成した結晶を集めて乾燥した結
果、純度96％以上のＬ−スレオニンの結晶1.55ｇ
を得た。 〈発明の効果〉 本発明方法によれば、Ｌ−スレオニン蓄積量、
収率が向上し、より安価なＬ−スレオニンの生産
が可能になつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エシエリヒア（Escherichia）属に属し、イ
   ソロイシン代謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ−
   スレオニン生産能を有する微生物を培養して、培
   養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記
   培養液よりＬ−スレオニンを採取することを特徴
   とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造方法。 ２ イソロイシン代謝拮抗物質が、チアイソロイ
   シンである特許請求の範囲第１項記載の発酵法に
   よるＬ−スレオニンの製造方法。