JPH074265B2 - 発酵法によるd−アラニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるd−アラニンの製造法Info
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- JPH074265B2 JPH074265B2 JP62253127A JP25312787A JPH074265B2 JP H074265 B2 JPH074265 B2 JP H074265B2 JP 62253127 A JP62253127 A JP 62253127A JP 25312787 A JP25312787 A JP 25312787A JP H074265 B2 JPH074265 B2 JP H074265B2
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 <産業上の利用分野> 本発明は、工業的に有利なD−アラニンの製造法に関す
る。
る。
D−アラニンは、非天然型アミノ酸であるが、それ自体
試薬としてあるいはペプチドなどの合成原料として有用
な化合物であり近年その需要も増加している。
試薬としてあるいはペプチドなどの合成原料として有用
な化合物であり近年その需要も増加している。
<従来の技術> 従来より、ブレビバクテリウム属に属する微生物により
発酵法によってDL−アラニンを製造する方法は数多く知
られている〔アミノ酸発酵(下巻)第119頁、共立出版
(昭和47年出版)〕。また、ブレビバクテリウム属に属
し、スレオニンおよびメチオニンに感受性を有する微生
物を用いてDL−アラニンを製造する改良法も知られてい
る(J.Gen.Appl.Microbiol.,1971、17(2)、169−7
2)。
発酵法によってDL−アラニンを製造する方法は数多く知
られている〔アミノ酸発酵(下巻)第119頁、共立出版
(昭和47年出版)〕。また、ブレビバクテリウム属に属
し、スレオニンおよびメチオニンに感受性を有する微生
物を用いてDL−アラニンを製造する改良法も知られてい
る(J.Gen.Appl.Microbiol.,1971、17(2)、169−7
2)。
<発明が解決しようとする問題点> しかしながら、これらの方法によれば、L−アラニンも
同時に生成するため、D−アラニンのみを取得するため
には何らかの光学分割操作が不可避であった。
同時に生成するため、D−アラニンのみを取得するため
には何らかの光学分割操作が不可避であった。
そこで本発明者らは、発酵法により選択的にD−アラニ
ンのみを生成蓄積させることにより光学分割操作を必要
とせず、さらに安価で簡便なD−アラニンの製造法を提
供することを目的として鋭意研究した。
ンのみを生成蓄積させることにより光学分割操作を必要
とせず、さらに安価で簡便なD−アラニンの製造法を提
供することを目的として鋭意研究した。
<問題点を解決するための手段および作用> その結果本発明者らは、ブレビバクテリウム属に属する
微生物であって、特別な耐性を有する微生物が著量のD
−アラニンを選択的に生成蓄積することを見出し本発明
を完成した。
微生物であって、特別な耐性を有する微生物が著量のD
−アラニンを選択的に生成蓄積することを見出し本発明
を完成した。
すなわち本発明は、D−アラニン生産能を有し、かつD
−シクロセリンに対して耐性を有するブレビバクテリウ
ム属に属する微生物を培養して培養液中にD−アラニン
を生成蓄積せしめ、前記培養液中よりD−アラニンを採
取することを特徴とする発酵法によるD−アラニンの製
造法である。
−シクロセリンに対して耐性を有するブレビバクテリウ
ム属に属する微生物を培養して培養液中にD−アラニン
を生成蓄積せしめ、前記培養液中よりD−アラニンを採
取することを特徴とする発酵法によるD−アラニンの製
造法である。
次に、本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる微生物はD−アラニン生産能を有
し、かつD−シクロセリンに対して耐性を有するブレビ
バクテリウム属に属する微生物である。かかる性質を有
していれば、他の要求性、薬剤抵抗性の性質を持つもの
でも本発明の範囲に含まれる。
し、かつD−シクロセリンに対して耐性を有するブレビ
バクテリウム属に属する微生物である。かかる性質を有
していれば、他の要求性、薬剤抵抗性の性質を持つもの
でも本発明の範囲に含まれる。
本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては、例
えば、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムDCSR
−26(微工研菌寄第2023号)が挙げられる。この変異株
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13
869(ビオチン要求性)より誘導されたもので、D−シ
クロセリンに対して耐性を有する変異株である。
えば、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムDCSR
−26(微工研菌寄第2023号)が挙げられる。この変異株
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13
869(ビオチン要求性)より誘導されたもので、D−シ
クロセリンに対して耐性を有する変異株である。
変異株の誘導は、通常の変異処理法によって比較的容易
にできる。すなわち、D−シクロセリンに耐性を有する
変異株を得るには、親株を紫外線照射するかあるいは変
異誘発剤(例えば、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸など)で処
理したのち、親株が十分に生育できないような量のD−
シクロセリンを含む培地で親株に比べて有位に生育可能
な菌株を取得すればよい。
にできる。すなわち、D−シクロセリンに耐性を有する
変異株を得るには、親株を紫外線照射するかあるいは変
異誘発剤(例えば、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸など)で処
理したのち、親株が十分に生育できないような量のD−
シクロセリンを含む培地で親株に比べて有位に生育可能
な菌株を取得すればよい。
本発明におけるD−シクロセリン耐性株とは、その親株
より強い耐性を有する菌株のことであり、好ましくは親
株の64時間後の相対生育度が40%以下になるようなD−
シクロセリン濃度を含む培地で培養した場合の相対生育
度が50%以上を示すようなものをいう。ここで生育度
は、培養液の660nmにおける吸光度を測定し、各菌株の
D−シクロセリンを添加していない培養液の吸光度を10
0%として表わした場合の相対吸光度で示すものとす
る。
より強い耐性を有する菌株のことであり、好ましくは親
株の64時間後の相対生育度が40%以下になるようなD−
シクロセリン濃度を含む培地で培養した場合の相対生育
度が50%以上を示すようなものをいう。ここで生育度
は、培養液の660nmにおける吸光度を測定し、各菌株の
D−シクロセリンを添加していない培養液の吸光度を10
0%として表わした場合の相対吸光度で示すものとす
る。
本発明方法で使用する培養液培地としては、通常微生物
の培養に汎用される各種栄養源を使用できる。例えば炭
素源としてはグルコース、糖蜜、デンプン加水分解液な
どの糖類、酢酸などの有機酸、エタノールなどのアルコ
ール類、安息香酸などの有機化合物、窒素源としては、
硫安、硝安、塩安、リン安、尿素、アンモニア、その他
を利用でき、無機アンモニウム塩の種類によっては例え
ばリン酸塩、炭酸カルシウムなどの無機塩を必要とする
場合もある。また、上記培地には微生物の生育をよく
し、D−アラニンを著量蓄積させるために例えば有機窒
素源、ビタミン、微量の金属イオンなどを添加するのが
好ましいが通常安価な味液、コーンスチープリカーなど
の添加によって十分それらの目的を達成することができ
る。
の培養に汎用される各種栄養源を使用できる。例えば炭
素源としてはグルコース、糖蜜、デンプン加水分解液な
どの糖類、酢酸などの有機酸、エタノールなどのアルコ
ール類、安息香酸などの有機化合物、窒素源としては、
硫安、硝安、塩安、リン安、尿素、アンモニア、その他
を利用でき、無機アンモニウム塩の種類によっては例え
ばリン酸塩、炭酸カルシウムなどの無機塩を必要とする
場合もある。また、上記培地には微生物の生育をよく
し、D−アラニンを著量蓄積させるために例えば有機窒
素源、ビタミン、微量の金属イオンなどを添加するのが
好ましいが通常安価な味液、コーンスチープリカーなど
の添加によって十分それらの目的を達成することができ
る。
本発明において、上記微生物の培養は、培地を振盪もし
くは通気攪拌するごとき好気的条件下に実施するのが好
ましい。培養温度は通常20〜40℃、とりわけ30℃付近に
あることが好ましい。また、培地のpHは通常5〜9であ
り、好ましくは、中性付近に維持することが高収率を得
るために望ましい。かくして数日間培養すれば培地中に
著量のD−アラニンが生成蓄積する。培養終了後、生成
したD−アラニンは、例えばイオン交換法、吸着法、沈
澱法などの公知の単離精製操作を組合せて用いることに
より容易に摂取することができる。
くは通気攪拌するごとき好気的条件下に実施するのが好
ましい。培養温度は通常20〜40℃、とりわけ30℃付近に
あることが好ましい。また、培地のpHは通常5〜9であ
り、好ましくは、中性付近に維持することが高収率を得
るために望ましい。かくして数日間培養すれば培地中に
著量のD−アラニンが生成蓄積する。培養終了後、生成
したD−アラニンは、例えばイオン交換法、吸着法、沈
澱法などの公知の単離精製操作を組合せて用いることに
より容易に摂取することができる。
<実施例> 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例1 A.(D−シクロセリン耐性株の分離) ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
(ビオチン要求性)の菌体に常法によりN−メチル−
N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン処理(300μg/m
l、30℃で10分)したのち、この細胞をD−シクロセリ
ン50mg/を添加した寒天培地(グルコース2%、硫安
1%、リン酸第1カリウム0.1%、硫酸マグネシウム・
7水和物0.04%、塩化ナトリルム0.05%、尿素0.25%、
硫酸第1鉄・7水和物10mg/、硫酸マンガン・4水和
物10mg/、ビオチン50μg/を含む完全合成培地)に
塗布した。次に30℃で5〜7日培養し、生じた大きなコ
ロニーを釣菌分離して、D−シクロセリン耐性株(ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムDCSR−26)を取
得した。
(ビオチン要求性)の菌体に常法によりN−メチル−
N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン処理(300μg/m
l、30℃で10分)したのち、この細胞をD−シクロセリ
ン50mg/を添加した寒天培地(グルコース2%、硫安
1%、リン酸第1カリウム0.1%、硫酸マグネシウム・
7水和物0.04%、塩化ナトリルム0.05%、尿素0.25%、
硫酸第1鉄・7水和物10mg/、硫酸マンガン・4水和
物10mg/、ビオチン50μg/を含む完全合成培地)に
塗布した。次に30℃で5〜7日培養し、生じた大きなコ
ロニーを釣菌分離して、D−シクロセリン耐性株(ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムDCSR−26)を取
得した。
B.(D−シクロセリン耐性株の耐性度) 第1表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて30℃で
16時間振盪培養し、生育した菌株を集菌し生理食塩水で
よく洗浄した。この菌体懸濁液をD−シクロセリンを各
々0、10、50mg/の濃度で含む最少培地(培地組成:
グルコース2%、硫安1%、リン酸第1カリウム0.1
%、硫酸マグネシウム・7水和物0.04%、塩化ナトリウ
ム0.05%、尿素0.25%、硫酸第1鉄・7水和物10mg/
、硫酸マンガン・4水和物10mg/、ビオチン50μg/
を含む完全合成培地)5mlに植菌して30℃で64時間培
養し、各菌株の生育度を調べた。その結果は第1表に示
すとおりである。
16時間振盪培養し、生育した菌株を集菌し生理食塩水で
よく洗浄した。この菌体懸濁液をD−シクロセリンを各
々0、10、50mg/の濃度で含む最少培地(培地組成:
グルコース2%、硫安1%、リン酸第1カリウム0.1
%、硫酸マグネシウム・7水和物0.04%、塩化ナトリウ
ム0.05%、尿素0.25%、硫酸第1鉄・7水和物10mg/
、硫酸マンガン・4水和物10mg/、ビオチン50μg/
を含む完全合成培地)5mlに植菌して30℃で64時間培
養し、各菌株の生育度を調べた。その結果は第1表に示
すとおりである。
本発明方法で使用するD−シクロセリン耐性株(DCSR−
26)では、親株のブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムATCC13869と比較して、D−シクロセリンによっ
て生成が阻害されず、D−シクロセリンに対する耐性を
獲得していることが明らかである。
26)では、親株のブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムATCC13869と比較して、D−シクロセリンによっ
て生成が阻害されず、D−シクロセリンに対する耐性を
獲得していることが明らかである。
実施例2 グルコース10%、硫安1.8%、リン酸第1カリウム0.05
%、リン酸第2カリウム0.05%、硫酸マグネシウム・7
水和物0.025%、塩化亜鉛0.001%、塩化ニッケル・6水
和物0.005%、味液2%、炭酸カルシウム3%、ビオチ
ン30μg/を含む培地(pH7.25)40mlを1エルレンマ
イヤーフラスコに分注し、120℃、10分間オートクレー
ブ滅菌して発酵培地とした。あらかじめブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムDCSR−26およびその親株で
あるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13
869をそれぞれ液体ブイヨン培地に植菌し、30℃で16時
間振盪培養せる前培養液を前記発酵培地に対し1%接種
した。30℃で5日間振盪した結果、下記第2表のごとく
培養液注にD−アラニンが生成した。発酵液注の総アラ
ニン量はアミノ酸分析計により、またD−アラニンの分
析は市販のD−アミノ酸オキシダーゼを用いる酵素法に
より、および住友化学OA−1000光学分割用カラムを用い
てHPLC測定した。
%、リン酸第2カリウム0.05%、硫酸マグネシウム・7
水和物0.025%、塩化亜鉛0.001%、塩化ニッケル・6水
和物0.005%、味液2%、炭酸カルシウム3%、ビオチ
ン30μg/を含む培地(pH7.25)40mlを1エルレンマ
イヤーフラスコに分注し、120℃、10分間オートクレー
ブ滅菌して発酵培地とした。あらかじめブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムDCSR−26およびその親株で
あるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13
869をそれぞれ液体ブイヨン培地に植菌し、30℃で16時
間振盪培養せる前培養液を前記発酵培地に対し1%接種
した。30℃で5日間振盪した結果、下記第2表のごとく
培養液注にD−アラニンが生成した。発酵液注の総アラ
ニン量はアミノ酸分析計により、またD−アラニンの分
析は市販のD−アミノ酸オキシダーゼを用いる酵素法に
より、および住友化学OA−1000光学分割用カラムを用い
てHPLC測定した。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムDCSR−26の
培養液1から、菌体を遠心分離して除去し得られる上
澄液を脱色炭処理した。この脱色炭処理液を強力カチオ
ン交換樹脂ダイヤイオンSK−1B(H+型)を充填したカラ
ムに通塔してD−アラニンを吸着させ、水洗後2Nアンモ
ニア水で溶出し、D−アラニンの分画を濃縮し、得られ
た濃縮液にエタノールを加え析出する結晶を口取した。
この結晶をエタノールにより再結晶することによりD−
アラニンの結晶9.5gを得た。
培養液1から、菌体を遠心分離して除去し得られる上
澄液を脱色炭処理した。この脱色炭処理液を強力カチオ
ン交換樹脂ダイヤイオンSK−1B(H+型)を充填したカラ
ムに通塔してD−アラニンを吸着させ、水洗後2Nアンモ
ニア水で溶出し、D−アラニンの分画を濃縮し、得られ
た濃縮液にエタノールを加え析出する結晶を口取した。
この結晶をエタノールにより再結晶することによりD−
アラニンの結晶9.5gを得た。
比旋光度〔α▲〕25 D▼=−14.2゜(C=6,1N-HCl) <発明の効果> 本発明によれば、発酵法により選択的にD−アラニンの
みを生成蓄積させることが可能になった。そのため、培
養液の光学分割が不要となり、安価かつ簡便にD−アラ
ニンを取得することができるようになりその工業的価値
は大きい。
みを生成蓄積させることが可能になった。そのため、培
養液の光学分割が不要となり、安価かつ簡便にD−アラ
ニンを取得することができるようになりその工業的価値
は大きい。
Claims (1)
- 【請求項1】D−アラニン生産能を有し、かつD−シク
ロセリンに対して耐性を有するブレビバクテリウム(Br
evibacterium)属に属する微生物を培養して、培養液中
にD−アラニンを生成蓄積せしめ、前記培養液よりD−
アラニンを採取することを特徴とする発酵法によるD−
アラニンの製造法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62253127A JPH074265B2 (ja) | 1987-10-07 | 1987-10-07 | 発酵法によるd−アラニンの製造法 |
DE8888116110T DE3878379T2 (de) | 1987-10-07 | 1988-09-29 | Verfahren zur herstellung von d-alanin. |
EP88116110A EP0310949B1 (en) | 1987-10-07 | 1988-09-29 | Process for producing d-alanine |
KR1019880013109A KR950009200B1 (ko) | 1987-10-07 | 1988-10-07 | D-알라닌의 제조방법 |
US07/742,147 US5254464A (en) | 1987-10-07 | 1991-08-01 | Process for producing D-alanine |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62253127A JPH074265B2 (ja) | 1987-10-07 | 1987-10-07 | 発酵法によるd−アラニンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01187091A JPH01187091A (ja) | 1989-07-26 |
JPH074265B2 true JPH074265B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=17246876
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62253127A Expired - Fee Related JPH074265B2 (ja) | 1987-10-07 | 1987-10-07 | 発酵法によるd−アラニンの製造法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0310949B1 (ja) |
JP (1) | JPH074265B2 (ja) |
KR (1) | KR950009200B1 (ja) |
DE (1) | DE3878379T2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1719433A1 (ru) * | 1988-04-26 | 1992-03-15 | Научно-Исследовательский Технологический Институт Аминокислот | Способ получени L-аланина |
DE60025799T2 (de) * | 1999-04-05 | 2006-10-19 | Sumitomo Chemical Co., Ltd. | Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Aminosäuren |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5121076B2 (ja) * | 1972-07-28 | 1976-06-30 | ||
JPS59113893A (ja) * | 1982-12-21 | 1984-06-30 | Nippon Carbide Ind Co Ltd | アラニンの新規な生産方法 |
-
1987
- 1987-10-07 JP JP62253127A patent/JPH074265B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-09-29 EP EP88116110A patent/EP0310949B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-29 DE DE8888116110T patent/DE3878379T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-07 KR KR1019880013109A patent/KR950009200B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0310949A2 (en) | 1989-04-12 |
EP0310949B1 (en) | 1993-02-10 |
JPH01187091A (ja) | 1989-07-26 |
DE3878379D1 (de) | 1993-03-25 |
DE3878379T2 (de) | 1993-06-03 |
KR890006825A (ko) | 1989-06-16 |
KR950009200B1 (ko) | 1995-08-16 |
EP0310949A3 (en) | 1989-11-02 |
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