SU1719433A1

SU1719433A1 - Способ получени L-аланина

Info

Publication number: SU1719433A1
Application number: SU884408234A
Authority: SU
Inventors: Асмик Геворковна Азизян; Марица Ананиковна Ананикян; Шаварш Микаелович Кочарян
Original assignee: Научно-Исследовательский Технологический Институт Аминокислот
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1988-04-26
Publication date: 1992-03-15
Also published as: HU894784D0; EP0369029A1; FI896231A0; JPH03500486A; WO1989010408A1; HUT53940A; CN1038669A; EP0369029A4; YU85489A; HU205389B; US5124257A

Abstract

Изобретение относитс к микробиологической промышленности и касаетс получени аминокислоты 1 -аланина, который может быть использован в сельском хоз йстве , химической, фармацевтической и пищевой промышленности. Целью изобретени вл етс повышение выхода L-аланина. Способ заключаетс в использовании в качестве продуцентов L-аланина штаммов Brevlbacterium flavum ВКПМ В-3991 и B.flavum ВКПМ В-3992 (лабораторные номера АА5 и АА6 соответственно), недостаточных по D-аланину и одновременно устойчивых к D.-L- а- аминомасл ной кислоте. На среде с саза розой, аммонийным азотом, минеральными сол ми и растовыми веществами после 96 ч ферментации выход L-аланина достигает 43.82 г/л.

Description

Изобретение относитс к микробиологической промышленности и касаетс получени аминокислоты L-аланина, который может быть использован в сельском хоз йстве , химической, фармацевтической и пищевой промышленности.

Целью .изобретени - вл етс повышение выхода L-аланина. .

Способ заключаетс в следующем. В качестве продуцентов используют му- тантные штаммы Bravibacterium flavum, обладающие нар ду с потребностью в D-аланине устойчивостью к D,L- о -амино- масл ной кислоте..

Примерами штаммов продуцентов L- аланина, недостаточных по D-аланину, обладающих устойчивостью к D.L- сс- -аминомасл ной кислоте, вл ютс следующие мутанты бактерий вида Brevibacterium flavum: штаммы B.flavum AA5 и АА6, депонированные во Всесоюзной, коллекции промышленных микроорганизмов под номерами ВКПМ В-3991 и ВКПМ В-3992 соответственно .

Штаммы получены генетико-селекцион- ными приемами из штамма B.flavum ATCC 14067 (коллекционный номер ВКПМ В-42).

Мутации устойчивости к D,L- а- амино- масл ной кислоте могут быть либо спонтанными , либо индуцированными в результате обработки микроорганизмов любым химическим (например, М-метил-М1-нитро-М-нитро- зогуанидин) или физическим (например, ультрафиолетовые лучи) мутагеном. Совмещение в геноме микроорганизмов мутации устойчивости к D,L- «-аминсмасл ной кислоте и мутации осуксотрофности по D-аланину может быть осуществлено в любой последовательности .

Получение штамма B.flavum ВКПМ В- 3991.

ч

«А

ю

4 ы

СлЭ

Штамм B.flavum ВКПМ В-42 выращивают в м сопептонном бульоне (МГ1Б) при 30°С с аэрацией до достижени титра 109 клеток/мл, клетки отмывают от МПБ центрифугированием и ресуспендируют в цит- ратном буфере (рН 5,5). К полученной суспензии добавл ют М-метил-М1-нитро М- нитро зогуанидин (НГ)до конечной концентрации 300 мкг/мл и инкубируют в услови х аэрировани в течение 20 мин при 30°С. Затем клетки отмывают от мутагена охлажденным МПБ, перенос т в пробирки 6 10 мл МПБ, инкубируют в течение 18 ч при 30°С и рассеивают на поверхности среды следующего состава, мг/мл воды: глюкоза 20; N32S04 2; К2НР04 1; NH4CI з; NhUNOs 1; MgS04 х 7МаО 0,1; MnS04 х 5Н20 1 х FeS04 х 7НаО 1 х биотин 5 х ,- тио- мина хлорид 1 х агар-агар 20; D,L- a- аминомасл на кислота 30; рН 7,4.

Колонии, выросшие на этой среде после 4-5 сут инкубировани при 30°С, выдел ют и провер ют их алолзинпродуцирующую способность. Один из отобранных.таким способом мутантов, продуцирующий повышенные количества D.L-аланина, вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, нуждающиес дл роста в D-аланине, известным методом. Штамм B.favum ВКПМ В- 3991 вл етс одним из отобранных таким способом мутантов.

Получение штамма B.flavum ВКПМ В-- 3992..

Штамм B.flavum ВКПМ В-42 обрабатывают НГ и отбирают мутант, нуждающийс в D-аланине. Полученный мутант вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, устойчивые к 0,-а--аминомасл ной кислоте, как это описано при получении штамма B.flavum ВКПМ В-3991, но с той разницей, что в состав среды внос т также D-аланин в концентрации 0,1 мг/мл, Один из отобранных таким образом мутантов, продуцирующих повышенные количества -аланина обозначен B.flavum ВКПМ В-3992,

Штаммы-продуценты L-аланина B.flavum ВКПМ В-3991 и ВКПМ В-3992 по своим культурально-биохимическим признакам не отличаютс от исходного штамма B.flavum ВКПМ R-42, за исключением признаков устойчивости к DL- а-амино- масл ной кислоте, ауксотрофности по D- аланину и L-аланинпродуцирующей способности.

Штаммы имеют следующую характеристику .

Культураль,но-морфологические признаки .

Клетки овальные, слегка выт нутые, длиной 1,7-2,5 мкм, бесспоровые, неподвижные , грамположительные.

На м сопептонном агаре (МПА) на 2 сут роста при 30°С образуют колонии диаметром 2 мм, круглые, гладкие, окрашенные в желтоватый цвет. .

Штрих на МПА: на 2 сут рост умеренный, край гладкий, поверхность блест ща , плот- 0 на , цвет желтовато-кремовый.

Рост по уколу в МПА: умеренный, в основном на поверхности среды.

Минеральна среда Гловера с глюкозой: дл роста необходим биотин, тиамин и 5 D-аланин. 2 сут роста при 30°С колонии ди- . аметром 1 мм, цвет светло-кремовый. Рост штриха на 2 сут умеренный, плотный, цвет светло-кремовый. На картофере рост и образование пигмента с желтым оттенком. 0 Желатину на разжижают.

Физико-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода: ассимилирует глюкозу, сахарозу, маннозу, фруктозу, мальтозу; слабее - галантозу, 5 рамнозу, сорбозу, сорбит, ацетат, этанол; не ассимилирует лактозу.

Отношение к источникам азота: ассимилирует аммонийный азот, мочевину.

Факультативные аэробы.

0 Оптимум роста при 30-32°С и рН 7,2- 7,8.

Отношение к антибиотикам: чувствительны к канамицмну, тетрациклину, ампициллину , левомицитину (хлорамфениколу) и 5 стрептомицину,

Отношение к фагам: чувствительны к представител м всех известных на сегодн шний день 7 групп бактериофагов, лизи- рующих B.flavum, которые выделены на 0 производстве лизина (группам ФВ, Нф, Еф, Тф, Лф и Кф). Эти группы охватывают около 10 независимых фагочых изол торов.

Услови хранени : в лиофилицирован- 5 ном состо нии; в пробирках с 0,7% МПА после посева уколом под слоем вазелинового масла; срок хранени - 2 года; на поверхности скошенного 1,5%-ного МПА в холодильнике при 4°С; пересевы через 1,5 мес.

0 Посевной материал штаммов-продуцентов дл поступающей ферментации может быть приготовлен любым известным способом, таким как выращивание на поверхности питательных сред или в жидких 5 питательных средах, содержащих усво е- мые источники углерода, азота, неорганические соли и органические: вещества, обеспечивающие рост штаммов.

К органическим веществам относ тс витамины (биотин, тиамин), а также другие

соединени , в том числе аминокислоты, если они необходимы дл роста штаммов-продуцентов . Так, в состав посевных сред дл выращивани штаммов ВКПМ В-3991 и ВКПМ В-3992 необходимо вносить D или D.L-аланин в концентрации не менее 80 мг/л.

В качестве питательной ферментационной среды дл культивировани штаммов B.flavum ВКПМ В-3991 и ВКПМ В-3992 мо- гут быть применены питательные среды, со- держащие усво емые источники углерода, ацетона, минеральные соли и органические вещества, стимулирующие рост и накопление L-аланина. В качестве усво емых источ- никое углерода могут быть использованы такие углероды, как сахароза, глюкоза, фруктоза/мальтоза, маниоза, Крахмал, гид- ролизат крахмала и меласса; многоатомные спирты, такие как глицерин и сорбит; орга- нические кислоты, такие как уксусна , молочна , фумарова , малеинова ; спирты, такие как метанол и этанол. Указанные источники углерода могут быть использованы как в отдельности, так и в сочетании друг с другом в различных массовых соотношени х . Общее количество источника углерода может быть введено в начале ферментации либо порци ми в процессе ферментации.

В качестве усво емого источника азота могут быть использованы как органические, так и неорганические соли аммони , например сульфат аммони , хлорид аммони , карбонат аммони , ацетат аммони , нитрат аммони , фосфат аммони , лактат аммони и аммиак; мочевина; различные природные азотсодержащие соединени , например пептон, гидролизат дрожжей, м сной экстракт и гидролизаты растительных белков.

В качестве минеральных солей могут быть использованы фосфорнокислый калий, фосфорнокислый натрий, сернокислый магний , хлористый натрий, соли железа, марганца , цинка, карбонат кальци .

Накопление L-аланина имеет место при культивиро вании в аэробных услови х в диапазоне температур 20-37°С и значений рН 6,5-9,0.

По вление L-аланина наблюдаетс чё-. рез 6-10 ч после начала ферментации. Мак- симальный уровень накоплени L-аланина в культуральной жидкости достигаетс в результате полного потреблени источника углерода через 32 ч и более (в зависимости от использовани концентрации источника уг- лерода). Степень конверсии источника углерода в целевой продукт колеблетс от 0,17 до 0,29.

Весь аланин в культуральной жидкости находитс в L-форме.

Содержание L-аланина определ ют методом бумажной хроматографии и окрашивание нингидрином или с помощью аминокислотного анализатора.

Накопленный L-аланин может быть выделен из культуральной жидкости любым известным способом, таким как удаление клеток микроорганизмов и других нерастворимых частиц центрифугированием или фильтрацией, адсорбцией L-аланина на ионообменнике смолы с последующим элю- ированием, концентрированием и кристаллизацией . .

П р и м е р 1. Посевной материал выращивают на посевной среде следующего состава , г/л воды: сахароза 30; сульфат аммони 30; калий фосфорнокислый одно- замещенный 3; сульфат магни х 7Н20 1,-сульфат железа х 7Н20 0,01; сульфат марганца х 5НаО 0,01; биотин 0,0001; тиамина бромид 0,0001; D-аланин 0,25; мел 30; рН 7,2. . - ., . .. . .. . .

Инокул т с концентрацией микроорганизмов 10 клеток /мл, полученный с одно- суточного посева с МПА, внос т в посевную среду в количестве 5%. Культивирование осуществл ют в колбах на качалках при 30°С. Продолжительность процесса выращивани посевного материала 16-18.4, при этом концентраци микроорганизмов достигает 2-5 х 1 О9 клеток /мл.

В колбы объемом 250 мл асептически разливают по 10 мл простерилизованной ферментационной среды следующего состава; г/л воды: сахароза 150; (МНфЗСм 55; КН2РСМ 3; MgS04 х 7Н2О 1; D-аланин 0.1; FeSCM х 7Н20 0,01; МпЗСм x 5HaO 0,01; биотин 0,0002; тиамина бромид 0,00005; СаСоз 50; рН 7,5. Каждую колбу инокулируют одним из следующих штаммов: B.flavum ВКПМ В-3991, ВКПМ В-3992 и известный штамм ВКПМ В-3061, нуждающийс в D- аланине, но не обладающий устойчивостью к D, L-a- -аминомасл ной кислоте. Выращивание осуществл ют на качалке при 30°С в течение 96 ч. Содержание L-аланина в культуральной жидкости штаммов приведено ниже:

П р и м е р 2. Процесс провод т аналогично примеру 1 с той разницей, что концентраци сахарозы в ферментационной среде 120 г/л, а продолжительность ферментации 72 ч.

Содержание L-аланина в культуральнзй жидкости штаммов-продуцентов приведено ниже.

Ф О р.мул а изобретен и Способ получени L-аланина, предусматривающий выращивание продуцирующего его штамма Brevibacterlum flavum,

нуждающегос в D-аланмне, в услови х аэрировани в питательной среде, содержащей сахарозу, аммоний сернокислый, калий фосфорнокислый, минеральные соли,О-алз йин,биотин, тиамин, мел и воду, до макси мального накоплени целевого продукта с последующим его выделением и очисткой, о тли чающийс тем, что, с целью повышени выхода L-аланина, в качестве продуцента используют штаммы

Brevlbacterlum fiavum ВКПМ В-3991 или Brevibacterium fiavura ВКПМ В- 3992, дополнительно устойчивые к D,L- Gf-аминомасл ной кислоте.

Claims

Формула изобретения

Способ получения L-аланина, предусматривающий выращивание продуцирующего его штамма Brevlbacterlum flavum, 5 нуждающегося в D-аланине, в условиях аэрирования в питательной среде, содержащей сахарозу, аммоний сернокислый, калий фосфорнокислый, минеральные соли, D-ала» йин,биотин, тиамин, мел и воду, до макси10 мального накопления целевого продукта с последующим его выделением и очисткой, о тли чающийся тем, что, с целью повышения выхода L-аланина, в качестве продуцента используют штаммы 15 Brevlbacterlum flavum ВКПМ В-3991 или Brevlbacterlum flavum ВКПМ В3992, дополнительно устойчивые к D.Lα-аминомасляной кислоте, . Составитель Л.А.Минеева