KR920002894B1 - 신규 세포융합주 및 이를 이용한 l-아르기닌의 제조방법 - Google Patents

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Description

신규 세포융합주 및 이를 이용한 L-아르기닌의 제조방법

제1도는 본원 발명의 균주 MWF 0824의 L-아르기닌 생산안정성을 나타낸 것이다.

본 발명은 브레비박테리움과 코리네박테리움속 미생물을 세포융합하여 얻은 특수한 변이주를 탄소원, 질소원, 기타 미생물에 유용한 유기 및 무기영양원을 함유하는 배지에서 호기적인 배양을 하여 L-아르기닌을 배지중에 고농도로 축정시키는 L-아르기닌의 공업적 제조방법에 관한 것이다.

L-아르기닌은 천연 아미노산의 일종으로 의약품원료, 조미료, 사료등의 첨가제, 혹은 건강음료의 원료로 사용되는 물질이다.

종래 L-아르기닌의 발효법에 의한 제조방법은 탄소원, 질소원으로부터 직접 L-아르기닌을 생산하는 방법으로써 글루탄산 생산균주인 브레비박테리움 혹은 코리네박테리움속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법(일본공개 57-163487, 60-83593, 62-265988), 세포융합으로 생육개선된 아미노산 생산균주를 이용하는 방법(일본공개 58-158185), 재조합 유전자가 형질전환된 균주를 이용하는 방법(일본공개 63-79597, 미국특허 4,775,623) 등이 알려져 있다.

생산용 균주를 개량하는 방안으로는 대사 생성능을 높혀주거나 발효시간을 단축시켜 단위 시간당의 생산성물 높혀주어야 한다. 종래의 세포융합에 의한 아르기닌 생산 균주개량은 균주 생육이 개선된 방법이었으나, 본 발명에서는 L-아르기닌 발효에 사용되는 미생물이 아미노산 아날로그, 썰파제 및 퓨린염기 아날로그 물질등에 내성을 가져 L-아르기닌에 대해 대사조절이 해제된 대사조절 변이주로써 이들 변이주간의 세포융합을 통하여 L-아르기닌의 대사 생성능과 단위시간당 생산성을 모두 개량하였다. 즉, 본 발명자들은 직접 토양으로부터 분리한 코리네형 세균을 변이처리하여 상기 물질들의 내성 변이주를 분리하고, 이 균주를 L-아르기닌 생성능이 있는 브레비박테리움 프라붐 ATCC 14067로부터 얻은 변이주 MWE 2234와 세포융합 시킴으로써, 발효시간을 단축시키고 L-아르기닌 생산성이 획기적으로 증가된 새로운 융합균주 MWF-0824 (KCTC 8484P:1990년 5월 22일 한국과학기술 연구원에 기탁)를 만들어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 사용된 토양으로부터 분리한 코리네형 세균 MWE 85는 버기스매뉴얼(Bergey's Manuel of Detarminetive Becteriology) 미생물의 분류와 동정 및 세균학 실험제요에 의해 코리네박테리움 구루타미쿰으로 확인하고 이로부터 내성변이주 MWE 1301를 유도하였다. 여러 종류의 내성변이주의 선별은 통상의 변이유도 조작으로, 예를 들면 자외선 조사 또는 화학변이 유기제로 처리한 후 이균 현탁액을 아미노산 아날로그, 썰파제 및 피리미딘염기 아날로그 물질이 1종류 또는 수종류 복합으로 함유된 평판배지에서 2-4일간 배양한 후 나타나는 코로니를 순수 분리하여 내성주로 선별하였다. 여기에서 사용한 평판배지의 조성은 다음과 같다.

포도당 2%, 유인 2%, 요소 0.3%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.04%, 황산제1철 10mg, 황산망간 10mg, pH 7.2조절하여 120℃에서 20분간 멸균.

다음은 코리네형 세균 MWE 85로부터 변이주 MWE 1301을 얻기까지의 과정과 아르기닌 생산성을 나타낸 것이다.

코리네박테리움 구루타미쿰 MW 85

(아르기닌 생산성 0mg/ml)

↓ 화학변이 유기체 처리(NTG처리)

MEW 85-121(카나바닌, 아르기닌 하이드록사메이트 내성)

(아르기닌 생산성 2.8mg/ml)

↓ 순수분리

MWE 121-603(아르기닌 생산성 3.3mg/ml)

↓ 자외선 조사

MWE 603-1214(카나바닌, 아르기닌 하이드록사메이트, 2-티아졸릴알라닌, 6-아자우라실 내성)

(아르기닌 생산성 8.4mg/ml)

↓ 순수분리(아르기닌 생산성 및 균주생육 향상주 분리)

MWE 1214-108(아르기닌 생산성 10.9mg/ml)

↓ 자외선조사(아르기닌 생산성 및 균주생육 향상주 분리)

MWE 108-24(카나바닌, 아르기닌 하이드록사메이트, 2-티아졸릴 알라닌, 6-아자우라실, 호모아르기닌, 썰파구아니딘 내성)

(아르기닌 생산성 13.1mg)

↓ 순수분리(아르기닌 생산성 및 균주생육 향상주 분리)

MWE 1301(아르기닌 생산성 15.8mg)

상기에서 각 균주의 아르기닌 생상성은 실시예 1의 방법으로 조사하였다.

균주 MWE 2234D와 MWE 1301의 아미노산 아날로그 내성 및 L-아르기닌 생산성 조사결과는 다음표의 결과와 같다.

[표 1]

아미노산 아날로그 물질 내성 비교

표 1은 배지에 각종 아날로그 물질을 농도별로 첨가한 한천배지상에 시험균주를 도말하여 30℃에서 2-4일 배양한 후의 생육여부를 비교한 것이다.

[표 2]

L-아르기닌 생산성 비교

표 2에서 아르기닌 생산성은 실시예 1의 방법으로 조사하였다. 본원 발명에서 사용한 변이주 브레비박테리움 프라붐 MWE 2234와 코리네박테리움 구루타미쿰 MWE 1301가의 이속간 세포융합은 공지의 방법(Agr.Biol.Chem.43(5).1007-1013, 1979)에 의하여 실시하였는 바, 세포융합주의 선별을 위한 선별 표지로 항생제 내성 및 감수성을 이용하였다. 본 균주들의 항생제 표시 내용은 다음과 같다.

[표 3]

변이주 항생제 표지

(주) 내성 항생제 농도는 최고 200γ/ml이며 상대 항생제의 최소 저해 농도는 10γ/ml이다.

브레비박테리움 프라붐 MWE 2234와 코리네박테리움 구루타미쿰 MWE 1301간의 이속간 원형질체 융합을 다음과 같이 실시하였다.

즉, 각 균주를 완전 영양배지에 접종하고 30℃에서 진탕 배양하면서 세포수가 10⁸/ml이 되었을때 페니시린 G0.3-1.0U/ml을 처리하고 2-3시간 배양물 계속 하였다. 이것을 균체를 분리하고 라이소자임 함유액(설탕 0.4M, 마그네슘 0.01M, 라이소자임 0.3mg) 10ml에 현탁시켜 30℃에서 정치 배양하면서 원형질체를 조제한바, 두균주 모두 99.9% 이상의 원형질체가 형성되었다. 각 균주의 원형질체를 동일한 숫자가 되도록 혼합한 후 융합을 위한 고장액(설탕 0.25M, 숙신산타트륨 0.25M, 이디티에이 5mM, 제1인산칼륨 0.11M, 제2인산칼륨 0.02M, 염화마그네슘 0.01M, 염화칼슘 0.01M, pH 8.0-10.5) 0.4ml에 현탁하고 30-50% 폴리에틸렌 글리콜 6000으로 5-10분간 융합시킨 후 아미노산 아날로그, 썰파제, 피리미딘염기 아날로그 물질과 항생제가 (스트렙토마이신, 암피시린) 첨가된 한천재생 배지에 도말하여 생성되는 코로니를 분리하였다. 브레비박테리움 프라붐 MWE 2234와 코리네박테리움 구루타미쿰 MWE 1301간의 이속간 세포융합에 의하여 세포생육이 향상되고 L-아르기닌 생산성이 획기적으로 증가된 새로운 L-아르기닌 생산균주 MWF-0824(KCTC 8484P)을 발명하였다. 새로운 새포융합주 MWF-0824 및 기타 융합주들의 항생제 내성 및 L-아르기닌 생산성 조사결과는 다음표와 같았다.

[표 4]

세포융합주의 항생제 내성 및 L-아르기닌 생산성

(주)* 상기표와 같이 항생제를 첨가한 한천배지상에 융합주를 도말하여 2-3일 배양후 생육조사.

** L-아르기닌 생산성은 실시예 1의 방법으로 조사하였음.

본원 균주 MWF 0824의 생리적 성질 및 L-아르기닌 생산성은 50세대 배양후에도 안정하게 유지되었다. (도면참조)

본 발명에 사용되는 융합주의 발효 배지로서는 통상의 탄소원, 질소원, 무기염류 및 유기 영양물질을 함유하고 있는데 탄소원으로서는 포도당, 당밀등을 사용했다. 질소원으로서는 유안, 요소등의 무기암모니움을 사용했으며 무기염류로서는 인산카리, 황산마그네슘등을 소량 첨가하고 유기 영양물질로서는 팹톤, 효모엑키스, 콘스팁리카등을 사용했다. 발효방법은 온도 30-32℃, pH 7.0-7.2로 유지하면서 호기적으로 2일간 진탕 배양했다. L-아르기닌이 축적된 발효액을 통상의 방법에 따라 이온교환 수지를 사용하여 분리하고 채취한다.

본 발명의 상세한 설명은 실시예에서 기재하고 있으나, 본원발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

사용균주 : MWF-0824

종배지 : 포도당 5%, 효모엑기스 1%, 요소 0.3%, 콘스팁리카 0.5%, 팹톤 1%, 염화나트륨 0.25%, pH 7.2

발효배지 : 포도당 5%, 당밀 5%, 유안 5%, 요소 0.5%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.025%, 비오틴 50/ℓ, 탄산칼슘 2.5%, pH 7.2

배양방법 : 상기 종배지 50ml을 500ml 진탕 플라스크에 분주하여 120℃에서 20분간 가압 멸균한 후 본 발명의 균주 MWF 0824을 접종하고, 30℃에서 20시간 진탕 배양하여 종균 배양액으로 한다. 발효 배지를 500ml 진탕 플라스크에 30ml 분주하고 120℃에서 20분간 가압 멸균한 후 미리 준비한 종균 배양액 1ml을 접종하여 30℃에서 40시간 진탕 배양하였다. 이때 탄산칼슘은 별도로 살균하여 첨가한다. 배양 완료후 배양액의 L-아르기닌 축적량은 39.2mg/ml였다.

[실시예 2]

실시예 1의 발효배지에 미트엑키스 1.5%를 첨가하여 실시예 1의 균주인 MWF 0824를 1백금이 접종한다. 이하 실시예 1과 동일하게 배양한 결과 배양액중 L-아르기닌의 생성량은 45.3mg/ml였다.

[실시예 3]

실시예 1의 발효배지에 티아민 100γ/ℓ을 첨가하여 미리 준비한 MWF 0824 종균배양액 1ml을 접종하고 30℃에서 43시간 진탕배양 하였다. 배양액중 L-아르기닌의 생성량은 41.5mg/ml였다.

Claims (2)

1. 브레비박테리움 프라붐 및 코리네박테리움 구루타미쿰에 속하는 미생물로서 아미노산 아날로그, 썰파제, 피리미딘염기 아날로그 물질들에 고농도 내성을 가지는 변이주를 세포 융합하여 얻은 L-아르기닌 생산능이 우수한 신규 세포융합주 MWF 0824.
2. 신규 세포융합주 MWF 0824를 배양하여 배지중에 L-아르기닌을 대량생산 축적시켜 채취하는 것을 특징으로 하는 L-아르기닌의 제조방법.

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