KR930001389B1

KR930001389B1 - 고 인산에너지 생산 세포융합주에 의한 l-아르기닌의 제조방법.

Info

Publication number: KR930001389B1
Application number: KR1019910004990A
Authority: KR
Inventors: 청 박; 최옥윤; 조진만; 옥치영
Original assignee: 주식회사 미원; 김채방
Priority date: 1991-03-29
Filing date: 1991-03-29
Publication date: 1993-02-27
Also published as: KR920018225A

Abstract

내용 없음.

Description

고 인산에너지 생산 세포융합주에 의한 L-아르기닌의 제조방법

본 발명은 브레비박테리움(Breviabacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속하는 미생물을 세포융합하여 얻은 특수한 고 인산에너지 생산 세포융합주를 탄소원, 질소원 기타 미생물에 유용한 유기 및 무기영양원을 함유하는 배지에서 호기적인 배양을 하여 L-아르기닌을 배지중에 고농도로 축적시키는 L-아르기닌의 제조방법에 관한 것이다.

L-아르기닌은 천연 아미노산의 일종으로 의약품 원료, 조미료, 사료등의 첨가제 혹은 건강음료의 원료로 사용되는 물질이다.

종래 L-아르기닌의 발효법에 의한 제조방법은 탄소원, 질소원으로부터 직접 L-아르기닌을 생산하는 방법으로써 글루탐산 생산균주인 브레비박테리움 혹은 코리네박테리움속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법(일본특허공개 57-163487, 60-83593, 62-265988), 세포융합으로 생육개선된 아미노산 생산균주를 이용하는 방법(일본특허공개 58-158185), 재조합 유전자가 형질전환된 균주를 이용하는 방법(일본특허공개 63-79597, 미국특허 4,775,623)등이 알려져 있다.

종래의 세포융합에 의한 L-아르기닌 생산균주 개량은, 균주생육을 개선시킴으로써 발효시간을 단축시키고 단위시간당 생산성을 높혀주는 방법이었다. 그러나, 최근 L-아르기닌의 필요가 증가함에 따라 보다 개량된 제조방법이 요구되고 있다.

본 발명자들은 L-아르기닌 생산용 균주의 개량을 위해 대사물생성능을 높혀줌으로써 L-아르기닌 생산성을 획기적으로 증가시킨 새로운 세포융합균주를 발명하였다.

글루탐산 계열의 아미노산 생합성에는 많은 에너지를 필요로 하며, 특히 L-아르기닌의 생합성과정에는 많은 에너지가 소모된다(J.Ferment. Technol 57,321-327, 1979).

본 발명에서는 많은 에너지를 소모하는 아르기닌 생합성과정에 에너지를 공급하기 위하여 브레비박테리움 암모니아게네스 균주를 이용하고, L-아르기닌 생산균주로서 코리네박테리움속에 속하는 미생물에서 변이 유도된 균주를 이용하여 두 균주를 세포융합함으로써 높은 효율로 L-아르기닌을 효과적으로 생산하는 새로운 세포융합 균주를 발명하였다.

브레비박테리움 암모니아게네스는 살베지합성효소 활성도 높아 여러 헥산 관련 물질의 살베지 합성에도 이용되고 있으며 생체에 있어 에너지 전달체로서 여러 에너지 대사에 관계하여 에너지 획득 및 이용에 중요한 ATP를 축적하는 균주이다(Agric Biol Chem 32,721(1968) ; J. Ferment, Technol 61,261(1983)).

이미 글루탐산계열의 아미노산 생산성 증대에 있어서 세포내 ATP의 증가가 매우 효과적이라는 것은 많이 보고되고 있다(Agric. Biol. chem 51, 2089(1987) ; Agric. Biol. Chem 50,2001(1986)). 본 발명의 특징은 L-아르기닌 생산용 균주를 육종할 목적으로 세포내 ATP양을 증가시키는데 있어서, 코리네형 아르기닌 생산균주와, 아르기닌은 생산하지 않으나 ATP 생산이 우수한 코리네형 세균을 세포융합시킴으로써 직접 ATP 고 인산에너지를 공급할 수 있는 세포융합주를 높은 빈도로 얻는 것이다.

코리네형 세균의 세포융합은 이미 공지되어 이용되고 있는 방법에 따라 실시할 수 있다(Agric Biol Chem, 43,1007(1979)). 브레비박테리움 암모니아게네스와 융합시킬 수 있는 균주로는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움에 속하는 미생물로써 아미노산 유사체에 내성을 갖는 균주나 기타 공지의 변이주와 같은 L-아르기닌 생산용 균주가 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용한 L-아르기닌 생산균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서 변이유도된 아미노산 유사체 내성변이주이다.

변이주의 선별은 통상의 변이유도 조작으로 예를들면, X선 조사, 자외선 조사, 또는 화학변이 유기제로 수차례 처리한후 균 현탁액을 L-아르기닌 유사체를 함유한 하기 조성의 평판배지에서 2-4일간 배양한후, 나타나는 콜로니를 순수분리하여 실시하였다. L-아르기닌 유사체로는 카나바닌, 아르기닌하이드록사메이트, 2-티아졸 알라닌, 호모아르기닌, 에티오닌등의 사용될 수 있다.

＜평판 배지 조성＞

포도당 2%, 유안 2%, 요소 0.3%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.04%, 황산철 10㎎/ℓ, 황산망간 ㎎/ℓ, pH 7.2조절, 120℃에서 20분간 멸균, 30℃ 배양.

이렇게 선별된 변이주들의 L-아르기닌 생산시험을 수행한 결과는 표1과 같다.

[표 1]

^*실시예 1의 방법으로 각 균주의 L-아르기닌 생산성을 조사함.

세포융합주는 항생물질 저항성등의 표지유전인자를 이용하여 선택배지 상에서 쉽게 선별할 수 있지만, 세포의 형태적비교, DNA 함량비교, 핵수의 세포학적분석, 탄수화물의 자화능 조사등의 방법이 이용될 수 있다(FEMS Microbiolgy Letters 2,203(1977) ; J. Gen, Microbiol, 109,169(1978)).

세포융합주의 선별을 위한 선별표지로써 코리네박테리움 글루타미쿰에서 얻은 변이주는 라팜피신 내성에 스트렙토마이신 감수성으로 이용하였고 브레비박테리움 암모니아게네스 균주는 스트렙토마이신 내성에 리팜피신 감수성 주를 분리사용하였다. 내성 항생제의 최고농도는 200㎍/㎖ 이며 상대항생제의 최소저해농도는 10㎍/㎖ 이었다.

본 발명을 상세히 설명하면, 코리네박테리움 글루타미쿰 MW 236과 브레비박테리움 암모니아 게네스 ATCC 6872 균주간의 세포융합을 다음과 같이 실시하였다. 즉, 각 균주를 완전영양배지(1ℓ의 물에 폴리펩톤 10g, 효모엑기스 5g, 육즙 5g, NaCl 5g을 함유하여 pH 7.0으로 조절된 배지)에 접종하고 30℃에서 진탕배양하면서 세포수가 10⁸개/㎖이 되었을때 페니실린 G을 0.5-1.0OUnit/㎖로 처리하고 2-3시간 배양을 계속하였다. 이것을 균체를 분리하고, 라이소자임 함유액(설탕 0.4M, 마그네슘 0.01M, 라이소자임 1㎎)10㎖에 현탁시켜 30℃에서 정치배양하면서 원형질체를 조제하였다.

융합하려는 각 균주의 원형질체를 동일한 숫자가 되도록 혼합한 후 융합을 위한 고장액(설탕 0.25M, 숙신산나트륨 0.25M, 이디티에이 0.5mM, 제1인산칼륨 0.11M, 제2인산칼륨 0.02M, 염화마그네슘 0.01M, 염화칼슘 0.01M, pH 8.0-10.5)0.4㎖에 현탁하고 30-50% 폴리에틸렌 글리콜 6000으로 5-10분간 융합시킨 후 각종 아미노산 유사체와 항생제가 첨가된 한천재생배지에 도말하여 생성되는 콜로니를 분리하였다.

분리된 콜로니중 융합균주 MWF 0081, MWF 0184 및 MWF 0427의 L-아르기닌 생산성을 하기 방법에 따라 실험하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.

본 발명에 따른 융합균주 MWF 0427은 1991년 3월 28일자로 한국종균협회(KFCC)에 KFCC 10723의 수탁번호로 기탁되어 있다.

본 발명에 사용되는 세포융합주의 발효배지로서는 통상의 탄소원, 질소원, 무기염류 및 유기영양물질을 함유하고 있는데 탄소원으로서는 포도당, 당밀등을 사용하였다. 질소원으로서는 유안, 요소등의 무기암모니움을 사용했으며 무기염류로서는 인산카리, 황산마그네슘등을 소량 첨가하고 유기영양물질로서 펩톤, 효모 엑기스, 콘스팁리카등을 사용했다. 발효방법은 온도 30-32℃, pH 7.0-7.2로 유지하면서 호기적으로 3일간 진탕배양하였다. L-아르기닌이 축적된 발효액을 통상의 방법에 따라 이온교환수지를 사용하여 분리하고 채취한다.

[표 2]

^*실시예 1의 방법으로 조사함.

본 발명의 새로운 세포융합균주들의 세포내 ATP 함량을 친주와 비교하였다. ATP 함량은 루시퍼라제-루시퍼린 키트를 이용하여 공지의 방법으로 측정할 수 있다. 결과는 표 3에 나타내었다.

[표 3]

상기의 결과로부터, 세포융합주 MWF 0427에 의한 L-아르기닌 생산성 향상에 세포내 ATP양의 증가가 매우 중요한 것임을 알 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에서 보다 상세히 설명되고 있으나, 본원이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

종배지(포도당 5%, 효모엑기스 1%, 요소 0.3%, 콘스팁리카 0.5%, 펩톤 0.1%, 염화나트륨 0.25%, pH 7.2) 200㎖를 2000㎖ 진탕플라스크에 분주하여 120℃에서 20분간 가압멸균한 후 본 발명의 융합균주 MW 0427을 접종하고 30℃에서 진탕배양하여 종균배양액으로 한다. 발효배지(포도당 15%, 유안 6%, 염화암모니움 2%, 요소 0.5%, 제1인산칼륨 0.2%, 제2인산칼륨 0.2%, 황산마그네슘 0.025%, 비오틴 100㎍/ℓ, pH 7.2)를 5ℓ 발효조에 2ℓ 사입하여 120℃에서 20분간 가압멸균한 후 종균배양액을 접종하고 600RPM, 1VVM 조건에서 32℃로 64시간 배양한다. 배양중의 pH는 7.0으로 암모니아수를 사용하여 조절하였으며 pH 7.0으로 조절한 추가당액을 잔당 1%일때 2회 추가하였다. 발효에 사용된 총당량은 550g이었으며 이때 L-아르기닌의 생성량은 69.1g/ℓ 이었다.

배양액 1ℓ를 통상의 방법에 따라 이온교환수지에 흡착분리한 후 용리액을 농축하여 L-아르기닌 조결정 66.2g/ℓ을 얻었다.

[실시예 2]

실시예 1의 발효배지에 미트엑기스 1.0%를 첨가하여 실시예 1의 균주인 MWF 0427를 종균배양하여 접종하고 이하 실시예 1과 동일하게 배양한 결과 배양액중 L-아르기닌의 생성량은 74.8g/ℓ 였다.

[실시예 3]

실시예 1의 종배지에 본 발명의 균주 MWF 0427을 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종균배양액으로 한다.

실시예 1의 발효배지에서 탄소원으로 포도당 : 당밀을 1 : 1의 비율로 하고 이하 실시예 1과 동일하게 배양한 결과 배양액중 아르기닌의 생성량은 71.8g/ℓ 였다.

Claims

L-아르기닌 생성능 및 아미노산 유사체에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움(Corynebacterium)속 균주와 ATP를 축적할 수 있는 브레비박테리움(Brevibacterium)속 균주를 세포융합하여 얻은 고 인산에너지 생산 세포융합주를 발효배지에서 배양하여 배양액중에 L-아르기닌을 축적시키고, 배양약으로부터 L-아르기닌을 회수함을 특징으로 하는 L-아르기닌의 제조방법.
제1항에 있어서, L-아르기닌 생성능 및 아미노산 유사체에 대한 내성을 갖는 균주가 코리네박테리움 글루타미쿰 균주임을 특징으로 하는 L-아르기닌의 제조방법.
제1항에 있어서, ATP를 축적할 수 있는 균주가 브레비박테리움 암모니아게네스 균주임을 특징으로 하는 L-아르기닌의 제조방법.
높은 L-아르기닌 생산능을 갖는 세포융합주 MWF 0427(KFCC 10723).