KR100671081B1 - 이노신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법 - Google Patents

이노신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJTP-17(KCCM-10702P)의 변이주로서, 직접발효법에 의해 이노신을 고농도 및 고수율로 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTPI-7(KCCM-10699P) 및 이러한 미생물을 이용하여 고농도 및 고수율로 이노신을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미생물은 이노신에 대한 내성을 추가로 갖는 것을 특징으로 한다.
코리네박테리움 암모니아게네스, 이노신

Description

이노신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산 방법{Microorganism producing inosine and process of preparing 5'-inosinic acid using same}
본 발명은 이노신(inosine)을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) [종래 브레비박테리움(Brevibacterium)] CJTP-17(KCCM-10702P)의 변이주로서, 직접발효법에 의해 이노신을 고농도 및 고수율로 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTPI-7(KCCM-10699P) 및 이러한 미생물을 이용하여 고농도 및 고수율로 이노신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
이노신은 정미성 조미료로 각광 받고 있는 이노신산(5'-inosinic acid)의 화학적 합성 및 효소전이 반응에 의한 합성에 있어서 중요한 기질이다. 또한 이노신은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에서 이용되고 있다. 이러한 이노신을 생산하기 위하여 종래에는 바실러스(Agric. Biol. Chem., 46, 2347 (1982); 대한민국 등록특허 제27280호) 또는 코리네박테리움 암모니아게네스(Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)) 등의 미생물을 이용한 직접 발효법이나 5'-이노신산의 열분해법(일특공소 제43-3320호) 등을 이용하여 제조하였다. 그러나, 열분해법의 경우 5'-이노신산을 분해하는데 대량의 열 소비가 요구되어 실용성이 문제되며, 직접 발효에 의한 제조방법은 이노신 생산균주의 역가가 낮아 생산원가가 높아지며 발효시간도 장시간이 소요되어 생산성이 낮다는 단점이 있었다.
따라서, 직접 발효법의 단점을 극복하고 이노신을 고농도/고수율로 생산하기 위한 다양한 방법이 연구되고 있으며, 이들 방법 중의 하나로 배양액 중에 이노신을 고농도로 축적시킬 수 있는 균주의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 미생물을 이용한 직접 발효법에 의해 이노신을 고농도/고수율로 생산하기 위하여 지속적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 직접 발효법으로 보다 더 고농도 및 고수율의 이노신을 생산하는 미생물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 이노신에 대한 내성이 증가되어 이노신 생성능이 향상된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 그 배양물로부터 이노신을 얻는 것을 포함하는 이노신의 제조 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 이노신(inosine)에 대한 내성이 증가되어 이노신 생성능이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJTP-17(KCCM-10702P)의 변이주 CJTPI-7(KCCM-10699P)에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미생물 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJTPI-7(KCCM-10699P)은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTP-17(KCCM-10702P)의 변이주이다. 본 발명에서 친주(parent strain)로 사용된 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTP-17은 2005년 11월 11일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 수탁번호 KCCM-10702P로 기탁된 이노신을 생산하는 미생물이다.
따라서, 본 발명에 따른 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTP-17(KCCM-10702P)의 하기 주요 특성 및 효과를 공유한다. 즉,
i) 아데닌(adenine)및 바이오틴(biotin) 요구성 특성;
ii) 크산틴(xanthine) 및 구아닌(guanine)을 요구하지 않으나 이들을 첨가시 생육이 촉진되는 크산틴 및 구아닌 누출형 변이주(leaky mutant)의 특성;
iii) 우레아(urea)를 자화할 수 있는 우레아제(urease) 결손 특성;
iv) 세포벽 분해효소인 라이소자임(lysozyme)에 대해 최저 생육억제 농도가 8 ㎍/㎖인 높은 감수성을 가짐으로써 세포 내에서 생성된 다량의 이노신을 세포 밖으로 잘 분비할 수 있도록 세포벽 합성 능력이 부분적으로 결손된 특성;
v) 배양과정에서 첨가된 고농도의 포도당 및 여러 탄소원에 의해, 또는 배양 후반에 배양액 내에 축적되는 이노신에 의해 균체 외부의 삼투압이 증가하여 이노신 생산 세포의 정상적인 생리활성이 저해됨으로 인해 균체 성장이 둔화되고 이노신 생성이 저해되는 것을 방지할 수 있는, 삼투압 내성 형질이 부여된, 디하이드로프롤린 (3,4-dihydro-DL-proline) 3500 ㎍/㎖에서 생육 가능한 특성;
vi) 퓨린(purine)계 생합성 시스템에서 필수적으로 요구되는 글루타민(L-glutamine)의 유사체 (analogue)인 아자세린(azaserine) 150 ㎍/㎖에서 생육 가능한 특성;
vii) 구아닌 유사체인 머캅토구아닌(6-mercaptoguanine) 600 ㎍/㎖에서 생육 가능한 특성;
viii) 퓨린 유사체인 머갑토퓨린(6-mercaptopurine) 1200 ㎍/㎖에서 생육 가능한 특성;
ix) 아데닌 유사체인 아자아데닌(8-azaadenine) 300 ㎍/㎖에서 생육 가능한 특성; 및
x) 삼투압 내성이 보다 강화되어 프롤린(proline) 유도체인 티아프롤린(thiaproline) 200 ㎍/㎖에서 성장 가능한 특성을 갖고 있다.
또한, 본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTPI-7(KCCM-10699P)은 상기 특성들 외에, 고농도 이노신에 대한 내성을 추가로 가짐으로써 이노신을 보다 고농도 및 고수율로 배양액 중에 직접 축적시킬 수 있다.
본 발명의 상세한 설명 및 실시예에서 언급되는 바와 같이, 본 발명에서 미생물의 배양을 위해 사용되는 영양배지('주1'로 표시됨), 최소배지('주2'로 표시됨), 종배지('주3'으로 표시됨), 플라스크 발효배지('주4'로 표시됨), 발효조 종배지('주5'로 표시됨), 발효조 본배지('주6'으로 표시됨)는 각각 표 1에서 나타낸 바와 같은 조성으로 이루어진 배지를 의미한다. 그러나, 배지 조성은 표 1에 제시된 것으로 제한되지는 않으며, 코리네박테리움 암모니아게네스의 배양에 적합한 모든 배양 배지를 사용할 수 있다.
Figure 112005069864293-pat00001
본 발명에 따른 미생물을 수득하기 위하여, 배양 배지 중 고농도의 포도당 및 그 밖의 다양한 탄소원이나 배양 중 생산된 이노신의 배양액내 축적에 의해 야기된 균체 외부의 삼투압으로 인해 미생물의 정상적인 생리활성이 저해되어 균체 성장이 둔화되고 결과적으로 이노신 생산이 저하되는 현상을 방지하고, 이노신 생성 퓨린 생합성 경로의 주요 효소들에서 나타나는 다양한 퓨린 유도체들에 의한 효소 활성 억제 기작으로 퓨린 물질의 과량 생산이 조절받고 이로 인해 이노신 고생산이 제한되는 현상을 해제하고자, 배양 초기에 높은 삼투압을 제공함과 동시에 다양한 퓨린 유도체로 전환될 수 있는 전구 물질로써 이용될 수 있도록 고농도의 이노신을 배지에 첨가하고 이에 대한 내성을 증가시킴으로써 기존 균주의 형질을 개량하였고, 이러한 균주들 중 이노신 생산성이 향상되도록 새로운 형질이 부여된 변이주를 최종 선별하였다.
본 발명에 따른 미생물을 수득하기 위한 구체적인 실시로서, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTP-17(KCCM-10702P) 균주를 X선, 자외선 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanine), 디에틸설파이드(diethylsulfide), 에틸아민(ethylamine) 등의 화학적 변이 유도제로 처리하였다. 이후 이를 최소배지(주2)에 이노신 농도가 10 내지 60㎎/㎖ 첨가된 배지에 적절히 희석한 후 도말하여 콜로니(colony)를 수득하였다. 이노신 농도별로 수득된 각각의 콜로니를 영양배지(주1)에서 배양하고, 종배지(주3)에서 24시간 배양한 후 발효배지(주4)에서 5 내지 6일씩 배양한 결과, 발효 배양액에 축적되는 이노신 생산량이 가장 우수한 균주를 선별하였다.
이러한 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJTPI-7로 명명하였으며, 이를 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2005년 11월 11일자로 수탁번호 KCCM-10699P호로 기탁하였다.
본 발명에 따라 선별된 신규 변이주 CJTPI-7(KCCM-10699P)에 대한 생화학적 특성을 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTP-17(KCCM-10702P) 균주와 비교하여 표 2에 기재하였다.
Figure 112005069864293-pat00002
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTPI-7(KCCM-10699P) 균주를 배양하여 그 배양물로부터 이노신을 채취하는 것을 포함하는 이노신의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTPI-7(KCCM-10699P) 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.
이때 탄소원으로는 글루코오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다.
무기화합물로는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.
배양은 호기적 조건 하에서, 예를 들면 진탕 배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 28 내지 36℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하다. 배양은 5 내지 6일 동안 지속하였으며, 직접 발효에 의해 축적된 이노신을 HPLC를 이용하여 통상의 방법으로 분석하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 어떤 형태로든 실시예에 의해 제한되는 것을 의미하지는 않는다.
실시예 1: 이노신 내성주 CJTPI -7 균주의 선별
코리네박테리움 암모니아게네스 CJTP-17(KCCM-10702P)을 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 107 내지 108 세포/㎖로 현탁시킨 후, N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 10 내지 50㎍/㎖가 되도록 첨가하여 실온 혹은 30 내지 32℃에서 40 내지 90분 동안 처리함으로써 돌연변이를 유발하였다. 원심분리 후 수득된 균주를 3회에 걸쳐서 0.85% 식염수로 세척한 후, 티아프롤린을 각각 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 150㎍/㎖, 200㎍/㎖, 250㎍/㎖ 및 300㎍/㎖ 농도가 되도록 첨가한 최소배지(주2)에 적절히 희석하여 도말한 후, 온도 30 내지 34℃에서 4 내지 5일간 배양하면서 성장하는 콜로니들을 수득하였다. 본 발명에서 CJTP-17(KCCM-10702P) 균주는 40㎎/㎖ 농도의 이노신 첨가에서도 생육 가능한 균임을 알 수 있었다. 표 3은 본 발명에 따른 미생물의 친주인 CJTP-17(KCCM-10702P) 균주와 새로운 개발균주인 CJTPI-7(KCCM-10699P) 균주와의 이노신에 대한 내성 정도를 나타낸다.
Figure 112005069864293-pat00003
실시예 2: 삼각플라스크 발효역가 실험
종배지(표 1, 주3) 3 ㎖를 지름 18mm 시험관에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균 후 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTP-17(KCCM-10702P) 균주와 40㎎/㎖ 이노신에 내성이 있는 균주 수십개를 각각 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 27㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균 후 종배양액 3㎖를 접종한 다음 5 내지 6일 동안 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도 32℃, pH 7.2로 조절하였다. 배양 결과, 배지내 이노신 축적량은 친주인 CJTP-17(KCCM-10702P) 균주의 경우 10.4g/L 이었으며, 내성 균주 중 수종의 이노신 생산량이 친주보다 증가하였다. 이 중 가장 이노신 생산성이 우수한 균주를 영양배지(주1)에서 배양하고 적절한 농도로 희석하여 고체배지에 도말한 후, 순수분리하여 단일 균체들을 얻은 후, 이 중 수십개의 콜로니들을 종배지(주3)에서 24시간 배양하고 발효배지(주4)에서 4 내지 5일간 배양한 결과 발효 배양액에 축적되는 이노신 생산량이 가장 우수한 11.1g/L의 이노신을 생산하는 CJTPI-7을 선별할 수 있었다. 결과적으로, 이 균주는 친주 대비 6.7%의 생산성 증가를 나타내었다.
실시예 3: 5-L 발효조에서의 발효역가 실험
종배지(주3) 50㎖를 500㎖ 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10분간 가압살균 후, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTP-17(KCCM-10702P) 균주와 CJTPI-7(KCCM-10699P) 균주를 각각 접종하고 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효조 종배지(주5) 1000㎖를 2.5L-발효조에 넣고 120℃ 온도에서 15분간 가압살균 후, 종배양액 50㎖를 접종한 다음 1 내지 2일 동안 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 28 내지 34℃, pH 7.2로 조절하였다. 또한, 발효조 본배지(주6) 1250㎖를 5L-발효조에 넣고 120℃ 온도에서 15분간 가압살균 후 발효조 종배양액 250㎖를 접종하여 배양하면서, 배양액 내에 잔류 환원당이 2%가 되었을 때, 발효조 본배지(주6)의 제조방법에 따라 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 만든 추가당을 최종 환원당으로 각각 32%가 되도록 첨가하며, 이를 1차, 2차, 3차 및 4차에 걸쳐 총 4회 반복 첨가하면서 5 내지 6일간 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 30℃, pH 7.2으로 조절하였다. 발효 결과, 친주 CJTP-17(KCCM-10702P)를 배양한 결과는 38.3g/L의 이노신을 생산하였고, CJTPI-7(KCCM-10699P) 균주를 배양한 결과는 41.2g/L의 이노신을 생산하여 약 7.6%의 생산성 향상을 나타내었다.
본 발명에 따른 코리네박테리움 암모니아게네스 CJTPI-7(KCCM-10699P) 균주를 이용하여 이노신을 생산하는 경우, 직접 발효법에 의해 기존 균주대비 이노신을 보다 고농도 및 고수율로 생산할 수 있다. 또한 상기의 균주에 의하여 생성된 이노신으로부터 효소 전이반응을 통하여 직접 발효법보다 고농도/고수율로 이노신산을 경제적으로 제조할 수 있다.

Claims (2)

  1. 이노신(inosine)에 대한 내성이 증가되어 이노신 생성능이 향상된 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) CJTP-17(KCCM-10702P)의 변이주 CJTPI-7(KCCM-10699P).
  2. 제1항의 균주를 배양하여 그 배양물로부터 이노신을 채취하는 것을 포함하는 이노신의 생산 방법.
KR1020050115421A 2005-11-30 2005-11-30 이노신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법 KR100671081B1 (ko)

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KR100977440B1 (ko) 2008-01-09 2010-08-24 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리움속 미생물로부터 분리된 신규한 유전자,이에 의해 형질전환된 이노신을 생산하는 코리네박테리움속미생물 및 이를 이용한 이노신의 생산방법

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