KR970010566B1 - 5'-이노신산(5'-lnosinic Acid)을 생산하는 미생물 - Google Patents

5'-이노신산(5'-lnosinic Acid)을 생산하는 미생물 Download PDF

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Abstract

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Description

5'-이노신산(5'-Inosinic Acid)을 생산하는 미생물
본 발명은 5'-이노신산을 생산하는 미생물에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 브레비박테리움 암모니아 게네스(ATCC 6872)의 변이주로서 종래 5'-이노신산을 생산하는 아데닌(Adenine) 누출형 변이주[Agr. Bio. Chem., Vol; 45(5), p1035-1041, 1983, (KY 13102, KY 13171, KY 13184 등)] 또는 아데닌과 크산틴(Xanthine) 또는 구아닌(Guanine) 동시 요구성 균주와 달리 본 발명에 따른 미생물은 아데닌을 요구하는 반면 크산틴 또는 구아닌을 요구하지 않으나 이들을 첨가함으로써 생육이 촉진되며, 우레아(Urea)를 자화할 수 있는 우레아제(Urease)가 결손되고, 세포내에 생성된 다량의 5'-이노신산을 세포밖으로 잘 분비할 수 있도록 세포벽 분해효소인 라이소자임(Lysozyme)에 감소성이 높으며, 삼투압 내성형질이 부여된 미생물로서, 값싼 당질을 원료로 사용이 가능하며 질소원 제한 영양배지에서 호기적으로 배양하며 5'-이노신산을 고수율, 고농도로 배양액중에 직접 축적시키는 미생물에 관한 것이다.
5'-이노신산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있으며 특히 글루타민산 나트륨과 함께 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조리료중의 하나이다.
이하, 본 발명에 따른 미생물의 분리 획득방법을 구체적으로 설명한다.
브레비박테리움 암모니아게네스(ARCC 6872)를 친주로 하여 X-선, 자외선 등에 의해서 5'-이노신산 생성능이 있고 생육을 위해서 아덴닌을 요구하고 아데닌, 구아닌 첨가 최소배지(주4)에서 생육이 촉진되는 브레비박테리움 암모기아게네스 CS-101을 얻는다.
이때 변이주 분리배지로는 영양배지(주1), 최소배지(주2), 최소첨가배지(주3,4)를 사용하여 변이주를 분리한다.
브레비박테리움 암모니아게네스 CS-101를 모주로 하여 X-선, 자외선 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌, 디에틸 설페이드, 에틸아민 등 화학변이 유기제로 처리한 후 영양배지(주1)에 도말하여 콜로니(colony)를 순수분리한 후 라이소자임이 농도별로 첨가된 라이소자임 첨가배지(주5)를 사용하여 브레이박테리움 암모니아게네스 CS-101보다 라이소자임 감수성이 높은 브레비박테리움 암모니아게네스 CS-1019를 선별하였다. 변이주인 브레비박테이움 암모니아게네스 CS-1019를 다시 상술한 유리변이제로 처리한 후 영양배지(주1)에서 순수분리한 후 크리스텐센우레아 검사배지(주7)에서 우레아가 결손된 변이주는 브레비박테이움 암모니아게네스 CS-10197 선별하였다.
변이주인 브레비박테이움 암모니아게네스 CS-10197를 다시 같은 방법을 사용하여 3,4-디하이드로프폴린(3,4-dehydro-DL-proline)이 농도별로 첨가된 배지(주6)를 사용하여 브레비박테이움 암모니아게네스 CS-10195를 얻었다. 이때 대부분의 변이주들은 3,4-디하이드로프폴린의 농도가 높아 생육할 수 없으며 삼투압 내성이 높은 변이주는 생육이 가능하므로 3,4-디하이드로프폴린의 농도를 점차로 높여 3500㎍/㎖에서도 생육이 가능한 변이주를 얻고 여기에서 얻은 변이주를 원심분리하여 3,4-디하이드로프폴린이 3500㎍/㎖ 농도로 함유된 배지(주6)에 도말하여 발생한 콜로니를 순수분리하여 브레비박테리움 암모니아게네스 CS-1019753이라 명명하고, 1993. 12. 27.자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하였다(기탁번호 : KFCC 10814).
(주1) 영양배지 : 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 호모엑기스 1%, 한천 2%, PH 7.2
(주2) 최소배지 : 포도당 2%, 황산나트륨 0.3%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 100㎎/ℓ, 황산철 10㎎/ℓ, 황산아연 1㎎/ℓ, 황산망간 1㎎/ℓ, L-시스테인 20㎎/ℓ, 칼슘판토네이트 10㎎/ℓ, 티아민 염산염 5㎎/ℓ, 비오틴 30㎍/ℓ, 요소 0.2%, PH7.3.
(주3) 아네닌최소첨가배지 : (주2)배지에 아데닌을 10㎎/ℓ~500㎎/ℓ까지 농도별로 첨가한 배지.
(주4) 아데닌, 구아닌첨가배지 : 최소 배지에 아데닌, 구아닌(또는 크산틴)이 10㎎/ℓ~500㎎/ℓ가지 농도별로 첨가한 배지.
(주5) 라이소자임첨가배지 : (주1)배지에서 라이소자임 1.0㎍/ℓ~100㎍/ℓ까지 농도별로 첨가한 배지.
(주6) 3,4-디하이드로프폴린 첨가배지 : (주)배지에서 3,4-디하이드로프폴린 100㎍/ℓ~5000㎍/ℓ가지 농도별로 첨가한 배지.
(주7) 크리스텐우레아 검사배지 : 펩톤 1.0g, 포도당 1.0g, 염화나트륨 5.0g 인산 제1칼륨 2.0g, 페놀레드 0.012g, 한천 20g, 요소 20g, 증류수 11g.
상기와 같이 분리된 본 발명에 따른 미생물인 브레비박테리움 암모니아게네스 CS-1019753(KFCC 10814)의 생화학적 특성은 표 1, 표 2 그리고 표 3의 기재와 같다. 즉, 본 발명에 따른 미생물은 발효 배양액중에 직접 5'-이노신산을 축적시키고 5'-이노신산 생산능력이 있는 아데닌 요구성, 구아닌 누출형 변이주에 세포벽 외로의 특정 대사 산물이 분비기능이 증가된 라이소자임에 감수성이 높고 배양과정중 고농도의 탄소원이 배양에 존재하거나, 배양약중 5'-이노신산이 많이 생성될 경우 균체 외부의 고농도 용질에 의해 생성된 삼투압에 의한 정상적인 생리활성 저해 현상을 방지하기 위해 균체 내부에 특정 융질인 프롤린(L-proline)의 농도가 증대되고 삼투압에 의한 영향을 배제할 수 있는 형질인 3,4-디하이드로 프롤린에 내성이 높은 특수한 변이주라고 판단된다.
배양방법은 실시예에 기재된 바와 같이 25~35℃ PH 6.0~8.0로 유지하면서 호기적으로 3~4일간 5L-발효 시험조에서 배양하여 축적된 5'-이노신산을 상법에 따라 분리정제하였다.
다음에 실시예에서 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
사용균쥬 : CS-1019753(KFCC 10814)
종배지 : 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모액기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아네닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, PH 7.6.
발효배지 : 인산제1칼륨 1.5%, 인산제2칼륨 2.5%, 암모늄크로라이드 1%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 10mg/ℓ, 황산망간 10mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 옥수수침지여액 20%, 비오틴 30㎍/ℓ, 티아민염산 5mg/ℓ, 아데닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6%되게 첨가하여 사용.
발효방법 : 상기 종배기 3ml을 지름 18mm 시험관에 분주하고 상법에 따라 가압 살균 후 사용균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 40ml를 500ml 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 120℃에서 10분간 가압 살균하여 종배양액 3ml를 식균한 다음 3~4일간 배양하였다. 회전수분당 200회, 30℃, PH 7.0으로 조절하였다. 배지내 5'-이노신산 축적향은 15.2g/ℓ이었다.
[실시예 2]
사용균쥬 : CS-1019753(KFCC 10814)
종배지 : 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모액기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아네닌 100mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, PH 7.6.
발효배지 : 인산 2%, 수산화칼륨 2%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 10mg/ml, 황산망간 10mg/ml, 황산아연 10mg/ml, 옥수수침지여액 20%, 비오틴 30㎍/ml, 티아민염산 5mg/ℓ, 아데닌 200mg/ℓ, 구아닌 100mg/ℓ, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 18%되게 첨가하여 사용.
발효방법 : 상기 종배지 40ml를 500ml 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 상법에 따라 가압 살균 후 사용균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 1500ml를 5L-시험발효조에 사입하고 120℃에서 15분간 가압 살균하여 종배양액 200ml를 식균한 다음 3~4일간 배양하였다. 회전수 분당 900회, 28~34℃, PH 7.0으로 조절하였다. 또 발효시 당이 2%가 되었을 때, 1차 및 2차, 3차 추가당을 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 8% 되도록 첨가했다. 배지내 5'-이노신산 축적량은 58.4g/ℓ이었다.

Claims (1)

  1. 생육시 아데닌과 비오틴을 요구하며 구아닌 또는 크사틴 누출형 변이주로서 세포벽 분해 효소인 라이소자임에 감수성이 높고, 3,4-디히아드로프롤린의 농도가 3500㎍/ml 이상에서도 생육이 가능한 삼투압 내성을 갖음을 특징으로 하는 5'-이노신산의 생성능이 있는 브레비박테리움 암모니아게네스 KFCC 10814미생물.
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