WO2017160042A1 - Ｌ-히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 ｌ-히스티딘의 생산방법 - Google Patents

Ｌ-히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 ｌ-히스티딘의 생산방법 Download PDF

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histidine
producing
corynebacterium glutamicum
medium
strain
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권나라
박명근
백민지
곽영현
최재완
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씨제이제일제당(주)
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    • C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present application relates to a novel mutant that produces L-histidine and a method for producing L-histidine using the same.
  • L-histidine is classified as one of the twenty standard amino acids and an essential amino acid for growing children. L-histidine is involved in important physiological processes such as antioxidant and immune regulation, and is used in the medical industry such as gastrointestinal ulcer drugs, circulatory drugs, and amino acid solutions.
  • L-histidine is abundant in hemoglobin, and is produced mainly through proteolytic extraction methods based on blood powder. However, this has disadvantages such as low efficiency and environmental pollution. Meanwhile, L-histidine can be produced through microbial fermentation, but large-scale industrialization has not been achieved yet. This is because the biosynthesis of L-histidine competes with PRPP, a nucleotide synthesis precursor, and has complex biosynthetic processes and regulatory mechanisms that require high energy.
  • L-histidine production ability of the microorganism used in the fermentation method can be improved by the method of mutagenesis and mutant selection, as well as by controlling the metabolism of the strain through genetic improvement.
  • One aspect of the present application is to provide a Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11795P producing L-histidine.
  • Another aspect of the present application is the step of culturing Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11795P in the medium; And recovering L-histidine from the medium or mutant strain.
  • Another aspect of the present application is to provide a composition for producing L-histitin comprising Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11795P.
  • One aspect of the present application provides a Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11795P producing L-histidine.
  • L-histidine as used in the present application means an amino acid having imidazole as a side chain and showing basicity consisting of a chemical formula of C 6 H 9 N 3 O 2 .
  • L-histidine is an amino acid that promotes hemoglobin and leukocyte production in the body, is used as an essential component of histamine synthesis, and is involved in tissue regeneration and growth.
  • L-histidine begins with the condensation of 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate (PRPP) and ATP, and passes nitrogen from glutamine through several steps. L-histidinol can be produced and finally biosynthesized by histidinol dehydronase.
  • PRPP 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate
  • the biosynthetic pathway is not only complicated compared to other amino acids, but also has a problem in mass production of high concentrations of L-histidine due to feedback inhibition to L-histidine or a derivative thereof.
  • the inhibition of feedback of L-histidine or its derivatives is released, so that it is possible to grow even at high concentrations of L-histidine, thereby inducing mutations resistant to L-histidine derivatives to find microorganisms producing L-histidine in high yield. Can be.
  • the variant strain of the present application is resistant to L-histidine derivatives.
  • the term “derived of L-histidine” is a term that collectively refers to the combination of another amino acid, a substituent, or a functional group to L-histidine.
  • L-histidine is meant to include a substance that can cause feedback inhibition in relation to the biosynthesis of L- histidine, 1,2,4-triazole-3-alanine (1,2,4-triazole-3-alanine) and the like It may be, but is not limited thereto.
  • the derivative of L-histidine can be used to determine whether the mutation inhibits the feedback inhibition of L-histidine or derivatives thereof in the process of selecting the variant strain producing L- histidine.
  • mutant strain producing L- histidine refers to a microorganism mutated to produce a high concentration of L- histidine compared to the parent strain.
  • the mutagenesis of the microorganism may be performed by various means well known in the art, and may use one of physical or chemical mutagenesis methods.
  • chemical mutagens suitable for the present application include N-Methyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine (NTG), diepoxybutane, ethyl Methane sulfonate, mustard compounds, hydrazine and nitrous acid may be used, but are not limited to these compounds.
  • the physical mutagenesis factor may use ultraviolet rays and gamma radiation, but is not limited thereto.
  • the parent strain is affected by mutagenesis at a concentration sufficient to leave a certain size of surviving population.
  • the size varies with the type of mutagenesis and is dependent on the amount of mutation that the mutagenesis causes in the living population at a constant killing rate. For example, for NTG, the killing rate may leave approximately 10% to 50% of the starting population.
  • Mutagenesis by nitrous acid may leave approximately 0.01% to 0.1% of the starting group, and mutations caused by ultraviolet light may leave approximately 1.0%, but is not limited thereto.
  • any microorganism that can be mutated in the above can be any strain that produces L- histidine without limitation, specifically, Escherichia sp., Enterobacter sp. ( Yersinia sp.), Genus Klebsiella sp., Genus Erwinia sp., Genus Corynebacterium sp., Genus Brevibacterium sp., Genus Lactobacillus It may be a microorganism belonging to ( Lactobacillus sp.) And the like, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the present application is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium or microorganism of the genus Escherichia, and more specifically Corynebacterium glutamicum, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application is the step of culturing Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11795P in the medium.
  • It provides a method for producing L- histidine comprising recovering L- histidine from the medium or mutant strain.
  • culture in the present application means to grow microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • the method for culturing the microorganism of the present application is well known in the art Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ) can be performed using the culture method.
  • examples of the culture method include, but are not limited to, batch culture, continuous culture, and fed-batch culture.
  • Various such methods are disclosed, for example, in "Biochemical Engineering” (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176, 1991).
  • the term "medium” is used for the cultivation of bacteria, in particular, Corynebacterium glutamicum parent strains or mutant strains, and a medium comprising a carbon source, a nitrogen source, and an inorganic salt so that the strain can produce L-histidine.
  • the medium may include various substances discharged into the medium during the growth of the microorganism together with the medium component prepared for culturing the mutant strain, and specifically, may include a target substance L-histidine.
  • the medium used for cultivation must meet the requirements of the particular strain in an appropriate manner.
  • Culture media for Corynebacteria strains are known (eg, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology.Washington D.C., USA, 1981).
  • Carbon sources in the medium include, for example, sugars and carbohydrates such as glucose, sugar, sodium citrate, fructose, lactose or maltose, soybean oil, sunflower oil, Oils such as castor oil, coconut oil and the like, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, organic acids such as acetic acid, but are not limited thereto. These materials can be used individually or as a mixture.
  • the nitrogen source in the medium for example, compounds containing peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn steep liquor, soybean cake, urea, thiourea, ammonium salt, nitrate and other organic or inorganic nitrogen may be used.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the inorganic salts included in the medium may be a compound including magnesium, manganese, potassium, calcium, iron, zinc, cobalt, and the like, but is not limited thereto.
  • Personnel that can be used in the medium may include, but are not limited to, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or a corresponding sodium-containing salt.
  • the culture medium may include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth.
  • the compounds may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • nitrogen source and inorganic salts amino acids, vitamins, nucleic acids and related compounds may be additionally added to the medium of the present application.
  • the above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously by a suitable method for the medium in the culture process.
  • the pH of the medium can be adjusted by using a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid in an appropriate manner.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • Oxygen or an oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture may usually be 20 to 45, but is not limited thereto. Incubation is continued until the desired amount of L-histidine production is achieved. For this purpose it can usually be achieved in 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the resulting L-histidine may be released into the culture medium or may be contained in the microorganism.
  • Recovering the L-histidine from the culture medium or mutant strain cultured the mutant strain may be used in a variety of methods well known in the art, such as centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC, but these examples It is not limited to.
  • composition for the production of L-histitin comprising Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11795P.
  • the composition for producing L-histidine may further comprise a culture of the strain in addition to Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11795P.
  • the term "culture” is interpreted as a concept including a culture obtained by culturing a medium or strain including a strain obtained by culturing for a predetermined period of time in the above-described medium, its metabolites, extra nutrients, and the like, and then removing the strain. do.
  • Methynebacterium of the present application Tommy Com (Corynebacterium Since glutamicum ) mutant KCCM11795P is a strain producing L-histidine at a high concentration, L-histidine can be produced by recovering L-histidine from various compositions well known in the art from the composition including the strain and culture.
  • 1 is a chromatogram showing the results of quantitative analysis of L-histidine produced from (a) Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 and (b) Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11795P.
  • the following microorganisms were induced using the following method. Specifically, the parent strain glutamic acid producing Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ) After activating ATCC 13032 for 16 hours in an activation medium, the activated strain was inoculated in a sterilized seed medium at 121 ° C. for 15 minutes, incubated for 14 hours, and 5 ml of the culture was recovered.
  • N-nitrosoguanidine N-Methyl-N'-nitro- was added for 20 minutes and washed with 100 mM phosphate buffer. The death rate was calculated by smearing NTG-treated strains on a minimum medium, and the killing rate was 85%.
  • Corynebacterium glutamicum HCJ-86 which is resistant to L-histidine and 1,2,4-triazole-3-alanine, results in feedback inhibition of histidine or its derivatives to wild-type strains. Compared with the relative release, it was confirmed that L-histidine can be produced with high efficiency and high yield.
  • composition of the medium used in Examples 1 and 2 is shown in Table 3 below.

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Abstract

본 출원은 Ｌ-히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용하여 Ｌ-히스티딘을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 Ｌ-히스티딘의 생산방법
본 출원은 Ｌ-히스티딘을 생산하는 신규 변이주 및 이를 이용한 Ｌ-히스티딘의 생산 방법에 관한 것이다.
L-히스티딘은 20 개의 표준 아미노산들 가운데 하나의 아미노산으로, 성장기 어린이들에게는 필수 아미노산으로 분류된다. L-히스티딘은 항산화와 면역 조절 등 중요한 생리적 과정에 관여하여 위장 궤양 치료제, 순환기계 치료제의 원료 및 아미노산 수액제 등 의학 산업에 사용된다.
L-히스티딘은 헤모글로빈에 많이 들어 있어서, 혈분을 원료로 하는 단백질 가수 분해 추출법을 통해 주로 생산된다. 그러나 이는 낮은 효율과 환경 오염 등의 단점을 지니고 있다. 한편, 미생물 발효법을 통하여 L-히스티딘을 생산 가능하나, 대규모 공업화는 아직 이루어 지지 않았다. 이는 L-히스티딘의 생합성이 뉴클레오티드 합성 전구체인 PRPP와 경쟁 관계를 가지며, 고 에너지를 요구하는 복잡한 생합성 과정 및 조절 메커니즘을 가지고 있기 때문이다.
발효법에 사용되는 미생물의 L-히스티딘 생산능은 돌연변이 유발 및 돌연변이체 선발의 방법뿐 아니라 유전자 개량을 통한 균주의 신진대사를 조절하는 방법으로 개선될 수 있다.
이에 미생물을 이용한 발효법으로 생산하기 위해서, L-히스티딘을 안정적이고 고농도로 생산할 수 있는 균주 및 L-히스티딘 생산 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 출원의 일 양상은 L-히스티딘(L-histidine)을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11795P를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 양상은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11795P를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배지 또는 변이주로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는 L-히스티딘의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 양상은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11795P를 포함하는 L-히스티틴 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 일 양상은 L-히스티딘(L-histidine)을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11795P를 제공한다.
본 출원에서 사용된 용어 "L-히스티딘"은 이미다졸(imidazole)을 곁사슬로 가지고, C6H9N3O2의 화학식으로 이루어진 염기성을 나타내는 아미노산을 의미한다. L-히스티딘은 체내에서 헤모글로빈 및 백혈구 생성을 촉진하고, 히스타민(histamine) 합성의 필수 성분으로 사용되며, 조직의 재생 및 성장에 관여하는 아미노산이다.
한편, 미생물에 있어서 L-히스티딘은 5-포스포리보실-1-파이로포스페이트(5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, PRPP)와 ATP의 축합으로 시작되어, 여러 단계를 거쳐 글루타민(glutamine)으로부터 질소를 제공받아 L-히스티디놀(L-histidinol)이 생성되고, 최종적으로 히스티디놀 디하이드로나제(histidinol dehydronase)에 의해 생합성될 수 있다. 상기 생합성 경로는 타 아미노산에 비하여 복잡할 뿐 아니라, L-히스티딘 또는 이의 유도체에 대한 피드백 저해로 인하여 고농도의 L-히스티딘을 대량 제조하는데 문제점이 있어 왔다. 이에, L-히스티딘 또는 이의 유도체에 대한 피드백 저해가 해제되어 고농도의 L-히스티딘에서도 생장 가능하도록, L-히스티딘 유도체에 내성을 가지는 돌연변이를 유도함으로써 L-히스티딘을 높은 수율로 생산하는 미생물을 발굴할 수 있다. 따라서, 본 출원의 상기 변이주는 L-히스티딘 유도체에 대하여 내성을 가진다.
본 출원에서 사용된 용어 "L-히스티딘의 유도체"는 L-히스티딘에 다른 아미노산, 치환기 또는 작용기가 결합한 것을 총칭하는 용어이다. 본 출원에서는 L-히스티딘의 생합성에 관련하여 피드백 저해를 유발할 수 있는 물질을 포함하는 의미이며, 1,2,4-트리아졸-3-알라닌(1,2,4-triazole-3-alanine)등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 L-히스티딘의 유도체는 L-히스티딘을 생산하는 변이주를 선별하는 과정에서 상기 변이주가 L-히스티딘 또는 이의 유도체에 대한 피드백 저해가 해제되었는지 여부를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 출원에서, "L-히스티딘을 생산하는 변이주"는 모균주에 비하여 L-히스티딘을 고농도로 생산할 수 있도록 돌연변이 시킨 미생물을 의미한다. 이때, 미생물의 돌연변이 유발은 해당 분야에서 널리 알려진 다양한 수단에 의해 수행될 수 있으며, 물리적 혹은 화학적 돌연변이 유발 방법 중 하나의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 적합한 화학적 돌연변이 유발 요인으로 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine,NTG), 디에폭시부탄(diepoxybutane), 에틸메탄 설폰에이트(ethylmethane sulfonate), 머스타드(mustard) 화합물, 히드라진(hydrazine) 및 아질산(nitrous acid)을 사용할 수 있으나, 이러한 화합물들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 물리적 돌연변이 유발 요인은 자외선 및 감마 방사선을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 돌연변이 유발 시에 모균주는 특정 크기의 생존 개체군을 남겨둘 정도의 농도에서 돌연변이 유발 인자에 의해 영향을 받는다. 상기 크기는 돌연변이 유발 인자들 종류에 따라 변화하며, 돌연변이 인자가 일정한 살생율로 생존 개체군내에 유발하는 돌연변이의 양에 의존한다. 예를 들어, NTG의 경우 살생율은 출발 개체군의 10% 내지 50%를 대략적으로 남겨둘 수 있다. 아질산에 의한 돌연변이 발생은 출발개체군의 0.01% 내지 0.1%를 대략적으로 남겨둘 수 있으며, 자외선에 의한 돌연변이 발생은 대략 1.0%를 남겨둘 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기에서 돌연변이될 수 있는 미생물이면 제한없이 어느 미생물이나 L-히스티딘을 생산하는 변이주가 될 수 있으나, 구체적으로 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 등에 속하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로는 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 미생물 또는 에스케리치아 속 미생물이며, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미컴이나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 양상은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11795P를 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배지 또는 변이주로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는 L-히스티딘의 생산 방법을 제공한다.
본 출원의 일 구체예에 따른 L-히스티딘의 생산 방법을 이하 상세히 설명한다.
본 출원의 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)의 배양 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양방법의 예에는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batchculture)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 다양한 방법은, 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991) 등에 개시되어 있다.
본 출원에서 용어 "배지"는 박테리아, 특히, 코리네박테리움 글루타미컴 모균주 또는 변이주의 배양에 사용되는 것으로서, 상기 균주가 L-히스티딘을 생산할 수 있도록 탄소원, 질소원 및 무기염류를 포함하는 배지를 의미한다. 상기 배지는 상기 변이주의 배양을 위해 조성된 배지 성분과 함께 미생물이 생육 중에 배지 내로 배출시킨 다양한 물질을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 목적 물질인 L-히스티딘이 포함된 것일 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 상기 배지에서 탄소원은 예를 들어, 포도당(glucose), 설탕(sucrose), 구연산염(sodium citrate), 과당(fructose), 젖당(lactose) 또는 엿당(maltose)과 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
상기 배지에서 질소원은 예를 들어, 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 옥수수 침지액, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 질산염 및 기타 유기 또는 무기 질소를 포함하는 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 배지에 포함되는 무기염류는 마그네슘, 망간, 칼륨, 칼슘, 철, 아연, 코발트 등을 포함하는 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 배지에 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 상기 화합물들은 개별적으로 또는 혼합물로써 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 탄소원, 질소원 및 무기염류의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 본 출원의 배지에 추가적으로 첨가될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배지에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
한편, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배지의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배지 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20 내지 45일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양은 원하는 L-히스티딘의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생성된 L-히스티딘은 배양 배지 중으로 배출되거나, 미생물 중에 포함되어 있을 수 있다.
상기 변이주를 배양한 배지 또는 변이주로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법, 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 양상은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11795P를 포함하는 L-히스티틴 생산용 조성물을 제공한다.
일 구체예에 따르면, 상기 L-히스티딘 생산용 조성물은 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11795P 이외에 상기 균주의 배양물을 더 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "배양물"은 상기 설명한 배지에서 일정 기간 동안 배양하여 수득한 균주, 그의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 배지 또는 균주를 배양한 후 균주를 제거한 배양액을 포함하는 개념으로 해석된다. 본 출원의 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11795P는 L-히스티딘을 고농도로 생산하는 균주이므로, 상기 균주 및 배양물을 포함하는 조성물로부터 당업계에 널리 알려진 다양한 방법을 통해 L-히스티딘을 회수하여 L-히스티딘을 생산할 수 있다.
본 출원의 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11795P는 L-히스티딘 및 이의 유도체에 대한 내성을 가짐으로써, 이로부터 발생하는 피드백 저해가 해제되어서 코리네박테리움 글루타미컴 모균주에 비해 고농도의 L-히스티딘을 안정적으로 발효 방법에 의해 생산할 수 있다.
도 1은 (a) 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 및 (b) 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 KCCM11795P로부터 생산된 L-히스티딘의 정량적 분석 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. L-히스티딘의 생산능 보유 변이주의 선별
L-히스티딘의 생산능을 가지는 미생물 변이주를 수득하기 위하여, 하기와 같은 방법을 사용하여 미생물의 변이를 유도하였다. 구체적으로, 모균주인 글루타민산 생산 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032를 활성화 배지에서 16시간 동안 배양하여 활성화시킨 후, 활성화된 균주를 121℃에서 15분간 멸균한 종배지에 접종하여 14시간 동안 배양하고, 배양액 5㎖를 회수하였다. 상기 회수한 배양액을 100mM 시트르산 완충용액(citric buffer)으로 세척한 후, 최종농도 200 mg/L가 되도록 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG)를 첨가하여 20분 동안 처리하고, 100mM 인산 완충용액(phosphate buffer)으로 세척하였다. NTG로 처리된 균주를 최소배지에 도말하여 사멸율을 계산해본 결과, 사멸율은 85%였다.
L-히스티딘의 유도체인 1,2,4-트리아졸-3-알라닌(1,2,4-triazole-3-alanine)에 대한 내성 변이주를 구하기 위하여, NTG가 처리된 균주를 1,2,4-트리아졸-3-알라닌의 최종농도가 각각 20mM, 30mM, 40mM 및 50mM인 최소배지에 도말하고, 30℃에서 5일간 배양하였다. 상기 4가지 농도에서 찾은 변이주 중, 1,2,4-트리아졸-3-알라닌 내성 변이주 3종을 획득하였다.
실시예 2. 코리네박테리움 글루타미컴 HCJ -86 선별 및 L-히스티딘 생산능 확인
상기 실시예 1에서 얻어진 고농도 1,2,4-트리아졸-3-알라닌 내성 변이주 3종의 L-히스티딘 생산능을 하기와 같은 방법을 통하여 확인하였다.
종배지 25㎖를 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에, 모균주인 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032), 및 상기 변이주 3종을 각각 접종한 후, 30℃에서 20시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하여 종 배양액을 얻었다. 그 후, 생산배지 24㎖를 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에, 1㎖의 종 배양액을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안 200rpm으로 배양하여 L-히스티딘을 생산하도록 하였다. 배양 종료 후, 액체 고속 크로마토그래피를 이용하여 L-히스티딘의 생산량을 측정하였다. 자세한 분석 방법 및 농도는 아래 표 1, 표 2와 같다.
분석 항목 Histidine
STD 농도 STD 1 : 0.011 g/LSTD 2 : 0.033 g/LSTD 3 : 0.100 g/L
이동상 A: 25mM-KH2PO4 + 12mM-Octane sulfonic acid sodium salt pH 2.5 (by H3PO4)B: 25mM-KH2PO4 + 12mM-Octane sulfonic acid sodium salt : Acetonitrile = 50 : 50 pH 2.5 (by H3PO4) A : B = 80 : 20
분석조건 시스템 HPLC
시료주입량 5㎕
flow rate 1.0 ㎖/min
컬럼 CAP CELL PAK C18 (ACR) 3 ㎛ 4.6 x 150 mm
컬럼 온도 40℃
디텍터 UV 210㎚
Run time 12min
L-히스티딘 농도(g/L)
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 0
변이주 1 1.2
변이주 2 1.0
변이주 3 (HCJ-86) 1.6
그 결과, 야생형 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032는 L-히스티딘을 생산하지 못하였으나, 변이주 3은 1.6g/L의 농도로 L-히스티딘을 생산하는 것을 확인하였다(표 2 및 도 1 참조). 이에 변이주 3을 코리네박테리움 글루타미컴 HCJ-86 (Corynebacterium glutamicum HCJ-86)라 명명하였고, 2015년 12월 22일자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11795P를 부여 받았다. 이러한 결과로부터 L-히스티딘 및 1,2,4-트리아졸-3-알라닌에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미컴 HCJ-86가 결과적으로 히스티딘 또는 이의 유도체들에 대한 피드백 저해가 야생형 균주에 비하여 상대적으로 해제되어, L-히스티딘을 고효율 및 고수율로 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편, 실시예 1 및 2에서 사용한 배지의 조성은 하기 표 3와 같다.
종류 배지의 조성 및 pH
활성화배지 육즙 1%, 폴리펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.5%, 효모엑기스 1%, 한천 2%, pH 7.2
종배지 포도당 5%, 박토펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.25%, 효모엑기스 1%, 요소 0.4%, pH 7.2
최소배지 포도당 1.0%, 황산암모늄 0.4%, 황산마그네슘 0.04%, 인산제1칼륨 0.1%, 요소 0.1%, 티아민 0.001%, 비오틴 200 ㎍/L, 한천 2%, pH 7.0
생산배지 포도당 5%, 황산암모늄 2%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.05%, CSL(옥수수 침지액) 2.0%, 비오틴 200 ㎍/L, 탄산칼슘 30g, pH 7.2
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 제한적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2017002702-appb-I000001

Claims (4)

  1. L-히스티딘 유도체에 대하여 내성을 가지며, L-히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주 KCCM11795P.
  2. 제1항에 있어서, 상기 L-히스티딘 유도체는 1,2,4-트리아졸-3-알라닌(1,2,4-triazole-3-alanine)인, 변이주 KCCM11795P.
  3. 제1항 또는 제2항의 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 변이주 또는 배지로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는, L-히스티딘의 생산 방법.
  4. 제1항 또는 제2항의 변이주를 포함하는 L-히스티틴 생산용 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3954776A4 (en) * 2019-04-22 2022-04-20 CJ Cheiljedang Corporation MICROORGANISM WITH IMPROVED ACTIVITY OF L-HISTIDINE PRODUCTION AND METHOD OF PRODUCTION OF HISTIDINE USING THEREOF

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4927758A (en) * 1983-02-17 1990-05-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing histidine
US5236831A (en) * 1981-12-29 1993-08-17 Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984003301A1 (en) * 1983-02-17 1984-08-30 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for preparing amino acid

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5236831A (en) * 1981-12-29 1993-08-17 Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes
US4927758A (en) * 1983-02-17 1990-05-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing histidine

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARAKI, KAZUMI ET AL.: "Feedback-resistant Phosphoribosyl-ATP Pyrophosphorylase in L-Histidine-producing Mutants of Corynebacterinm Glutarnicum", AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 38, no. 11, 1974, pages 2209 - 2218 *
ARAKI, KAZUMI ET AL.: "Histidine Production by Auxotrophic Histidine Analog-resistant Mutants of Corynebacterium Glutamicum", AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 38, no. 1, 1974, pages 189 - 194, XP055421764 *
ARAKI, KAZUMI ET AL.: "Histidine Production by Corynebacterium Glutamicum Mutants, Multiresistant to Analogs of Histidine, Tryptophan, Purine and Pyrimidine", AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 38, no. 4, 1974, pages 837 - 846, XP055420636 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3954776A4 (en) * 2019-04-22 2022-04-20 CJ Cheiljedang Corporation MICROORGANISM WITH IMPROVED ACTIVITY OF L-HISTIDINE PRODUCTION AND METHOD OF PRODUCTION OF HISTIDINE USING THEREOF
CN114502735A (zh) * 2019-04-22 2022-05-13 Cj第一制糖株式会社 L-组氨酸产生能力增强的微生物和用其产生组氨酸的方法

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