KR880002417B1 - 구아노신의 제조법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

구아노신의 제조법

본 발명은 미생물을 이용하는 구아노신의 제조법에 관한 것이다.

구아노신은 조미료로서 식품분야에서 중요한 위치를 차지하고 있는 5'-구아닐산의 제조 원료로서 유용하다. 발효법에 의하여 구아노신을 제조하는 방법으로서는 몇가지 방법이 알려져 있는데 예를 들면, 바실러스.푸미러스(Bacillus Pumillus)라든가 바실러스.리케니포미스(Bacillus Licheniformis)를 사용하는 방법(일본 특공소 48-33392), 바실러스.서브틸리스(Bacillus Subtilis)를 사용는 방법(일본 특공소 55-2955)등이 있다. 그렇지만 이들 공지의 방법에 있어서는 배양액중의 구아노신의 축적은 겨우 8∼10g/1에 불과하므로, 공업적인 견지에서는 그다지 유리한 방법이라고 할 수가 없다.

본 발명자들은 배양액중의 구아노신 축적량을 늘릴 목적으로 예의 연구를 거듭한 결과 아데닌 요구성이 있으며 구아노신을 생산하는 능력을 가진 미생물을 배양하여 구아노신을 생성시킴에 있어서 미생물의 생육에 필수적인 아데닌 함유 물질을, 미생물의 생육 상황등을 감안하면서 배양의 진행중에 소량씩 간헐적으로 또는 연속적으로 첨가함으로써 구아노신의 생성량을 현저하에 증대시킬 수가 있음을 발견하고 이에 의하여 더 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 아데닌 요구성 및 구아노신 생산 능력을 가진 미생물을 배지에서 배양하여 구아노신을 배양물중에 생성 축적시켜서 배양물로 부터 구아노신을 채취하는 방법에 있어서, 아데닌 함유물질의 소요량의 약 50% 이하를 함유하는 배지로 배양을 개시하고, 배지중의 아데닌 함유물질의 거의 소비된 시점에서 그 소요량의 나머지를 간헐적으로 또는 연속적으로 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 구아노신의 제조법이다.

본 발명에 있어 사용되는 아데닌 함유 물질로서는 아데닌, 아데노신, 5'-아데노신 모노인산, 3'-아데노신 모노인산, 5-'아데노신 디인산, 5'-아데노신 트리인산, 리보핵산, 디옥시리보핵산은 물론 그것들을 함유하는 미생물 균체라든가 그 추출물, 육엑기스, 어육 엑기스등의 천연유기물이나 아데닐 호박산 등의 아데닌 유도체 등을 들수 잇다.

종래, 아데닌 요구성 미생물의 배양에 있어서는 아데닌 함유 물질의 소요량의 전량을 초발 배지에 첨가하는 방법에 취해졌지만 본 발명에 있어서는 초발 배지에 첨가되는 아데닌 함유 물질의 양을 소요량의 50% 이하로 제한하고, 배양이 개시되고 나서 초발 배지에 첨가된 아데닌 함유 물질이 거의 소비된 시점에서 그 소요량의 나머지를 간헐적 또는 연속적으로 첨가하는 방법이 이용된다.

본 발명에서 말하는[아데닌 함유물질의 소요량]이란 배지에 첨가되는 아테닌 함유 물질의 양으로서, 구아노신의 생성 축적이 가장 크게되는 양을 말한다. 이 양은 제공된 시험 균주의 종류라든가 배양 조건에 따라서 다르지만 통상은 아데닌으로 환산하여 약 0.001∼0.002mo1/1 정도이다. [아데닌 함유 물질의 거의 소비된 시점]이란 배지중의 아데닌 함유 물질의 양이 아데닌으로서 약 0.01mmol/1 이하로된 시점을 의미한다.

본 발명의 아데닌 함유 물질의 첨가 방법의 구체 예로서는 예를 들면, ① 미리 정해진 타임 스케줄에 따라서 아데닌 함유 물질의 첨가량을 등분하고 또는 시간적으로 변화 시키면서 간헐적 또는 연속적으로 첨가 하는 방법, ② 배양액중의 미생물 균체의 증식량의 변화에 따라서 아데닌 함유 물질의 첨가량을 변화시키면서 간헐적 또는 연속적으로 첨가하는 방법, ③ 배양액중의 용존 산소농도의 변화나 배양액의 산소 소비량을 비롯하여 배양액의 발열량등 미생물의 생육 상황을 각종 측정기나 검출기기류로 검지하여 미리 정해진 양의 아데닌 함유 물질을 간헐적 또는 연속적으로 첨가하는 방법등을 들수 있으며 어느 방법도 가능하다. 그 중에서도 배양 시간의 경과와 함께 아데닌 함유 물질의 첨가량을 지수적(指數的)으로 늘려가는 방법은 짧은 시간내에 다량의 구아노신을 생성 축적 시킬 수가 있는 등의 점에서 더욱 유리하다. 이 경우, 아데닌 함유 물질의 첨가 개시후의 시간 t에 있어서 단위 시간당의 아데닌 함유 물질 첨가량(이하[공급속도]라 부른다) F(t)는 다음 식과 같이 표현할 수가 있다.

F(t)=F(o) exp(Kt) (K≠ 0)

여기서 F(o)는 첨가 개시때에 있어서의 공급속도, K는 정수(이하 비(比)[공급속도]라 부른다)이다.

이 방법에 의하면 시간 t_END까지에 첨가된 아데닌 함유 물질량 Ad_TOTAL은 다음식으로 표시된다.

(단,Ad_IN은 초발 배지에 첨가된 아데닌 함유 물질의 양.)

아데닌 함유 물질의 첨가 개시시기, 첨가하는 아데닌 함유 물질량(Ad_TOTAL-Ad_IN=Ad_ADD로 한다.), 초발 공급속도F(o), 비공급속도 K는 사용하는 미생물의 종류나 배지, 배양 조건등에 의하여 다르지만 아데닌 함유 물질의 첨가 개시시기로서는 그 균의 증식량이 최종도달 증식량의 0%∼약 75% 특히 약 5%-50%에 도달한 시점으로 부터가 Ad_ADD로서는 그 균의 생육에 필요한 양(보통 아데닌으로서 약 0.001∼0.002 mol/1)의 약 25%-100% 특히 약 50%∼95%가, F(o)로서는 단위 시간당 Ad_ADD의 약 0.1∼50% 특히 약 1∼20%가, K로서는 약 0.0lhr^-1∼5hr^-1, 더 바람직하기는 약 0.05hr^-1∼0.2hr^-1특히 약 0.075hr^-1∼0.15hr^-1이 바람직 하다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 아데닌 요구성을 갖고 또한 구아노신 생산 능력을 가진 미생물이면 어느 것이든 다 좋다. 그 미생물의 구체예로서는 예를 들면, 바실러스(Bacillus)속균, 브레비 박테리움(Brevibacterium)속균, 코리네박테리움(Corynebacterium)속균 등을 들수 있다. 그 바실러스 속균으로서는 예를 들면, 바실러스.푸미러스(Bacillus Pumilus). 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtillis) 등의 종류를 들수 있으며 구체적으로는 바실러스.푸미러스 No.148-S-16(한국 과학기술원 미생물 수탁번호 820426-02210, FERM BP-6, IFO 12483), 바실러스, 서브틸리스 ATCC 19221(IFO 14123)등을 들수 있다. 상기 FERM BP번호는 부다페스트 조약에 의한 일본 공업 기술원 미생물 공업기술 연구소의 기탁번호를, ATCC번호는 더 아메리칸 타이프 컬취컬렉션(The Aamerican Type Culture Collection 미국)의 기탁 번호를, IFO 번호는 일본 재단법인, 발효연구소의 기탁번호를 각각 표시한다. 그리고 상기 IFO 12483주는 일본 특공소 48-33392호 공보에 기재되어 있다. 또 상기 ATCC 19221주는 더 아메리칸 타이프 컬취 컬렉션 발행의 카탈로그 오브 스트레인즈 I 제14판 1980년(The American Type Culture Collection Catalogue or Strains I Fourteenth Edition 1980)에 수록되어 있다.

본 발명에 사용되는 미생물을 배양하는 배지로서는 본 발명에서 사용되는 미생물이 자라는 배지가 이용된다. 예를 들면, 배지에 첨가되는 탄소원으로서는 전분, 포도당,저당 등의 당류외에 글리세린, 메타놀, 에타놀, 솔비톨 등의 1가 내지 다가의 알콜류, 초산, 푸로피온산, 스테아린산, 올레인산등의 지방산류, 대두유, 올리브유, 어유, 고래기름, 면실유, 파마유, 라아드 등의 유지류, 노난, 데칸, 운데칸, 헥사데칸, 에이코산, 벤다코산 등의 n-파라핀류 외에 케로센, 가스오일, 베비가스오일 등의 탄화수소류 등와 각각 단독 또는 혼합하여 사용된다. 질소원으로서는 펩톤, 대두분, 콘스팁리커, 효모, 육엑기스 등의 유기질소원 외에 황산, 초산, 염산, 탄산등의 암모늄염, 암모니아가스, 암모니아수나 요소등의 무기질소원이 각각 단독으로 또는 혼합하여 사용된다. 그 외에 그 균의 생육에 필요한 각종의 무기염류 예를 들면, 칼슘, 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 망간, 철, 등, 아연 등의 황산염, 염산염. 탄산염, 초산(硝酸)염, 인산염, 초산(醋酸)염등을, 또 그 균의 생육에 필요한 아미노산류, 비타민류 등을 적의 선택하여 그것들을 단독 또는 혼합 시켜서 첨가하여 사용된다. 또 필요에 다라서 실리콘 오일, 폴리알킬렌 글리콜 에데르 등의 소포제나 계면활성제 등을 첨가해도 무방하다.

배양은 진탕 또는 통기 교반심부 배양등의 호기적 조건하에서 실시된다. 배지의 pH는 통상 약 5∼8의 범위에서 선정되는데 바람직하기는 PH 약 5.5∼7.5의 범위에서 배양된다. 배양중에 배지의 pH의 변동이 관측되면 이것을 바람직한 범위로 보정하기 위하여 예를 들면, 수산화알칼리(예; 수산화나트륨등), 탄산칼슘, 암모니아 등의 수용액, 현탁액 또는 암모니아 가스등을 적의 보첨하면서 배양해도 무방하다. 배양의 온도는 사용되는 미생물의 생육에 적합한 온도를 선택하면 되며 통상 20∼60℃, 바람직하기는 약 25∼45℃에서 배양하는게 유리하다. 배양의 시간은 구아노신의 축적량이 최대에 달할 때까지 배양하면 되며, 통상 약 24∼144시간 배양하면 그 목적을 달성할 수가 있다.

본 발명에서 발효액중에 생성된 구아노신은 이미 공지되어 있는 통상의 수단 예를 들면, 이온 교환수지나 활성탄에 의한 크로마토 그래피, 침전법 또는 용매 추출법 등의 분리정제수단을 단독 또는 조합하여 적용함으로써 채취할 수가 있다.

본 발명의 방법에 의하면, 종래의 아데닌 함유 물질을 일괄하여 배지에 첨가하는 방법에 비해서 거의 2배에 가까운 양의 구아노신을 배양액중에 축적시킬 수가 있다. 따라서 본 발명 방법을 사용하면 일정량의 설비를 사용하는 경우에도 목적물 구아노신의 생산량이 증대되며 또 배양액중의 목적물인 구아노신의 함유량이 많으므로 목적물 구아노신의 채취가 용이한 점등에서 본 발명은 공업적 생산상 유리한 방법이다.

다음에 실시예를 들어서 본 발명을 더 구체적으로 설명한다. 그리고 다음의 실시예에 있어서 배지의 첨가물의 백분율(%)은 특별히 한정하지 않는 한 중량/용량 백분율(W/V, %)을 을 표시한다.

[실시예 1]

아데닌 100mg/1를 함유하는 영양 한천 배지상에 생육한 바실러스.푸미러스 No.148-S-16(한국 과학기술원 미생물 수탁번호 820426-02210. FERM BP-6.IFO 12483)을 글루코오스 4%, 요소 0.2%, L-글루타민 산나트륨 0.5%, 황산마그네슘(7수염)0.2%, 염화칼륨 0.1%, 황산망간(약 4수염) 0.003%, 염화칼슘(2수염)0.2%, 콘스팁 리커 2%, 리보핵산 0.25%, 히스티딘 0.03%, 비오틴 200μg/1로써 된 멸균 시드배지 20ml를 함유하는 200m1들이 삼각 플라스크 5개에 접종하고 18시간, 37℃로 진탕 배양하였다. 이 시드 배양액 100m1를 멸균한 22%, 글루코오스 용액 1l와, 멸균한 황산 암모늄0.8%, L-글루타민산 나트륨 1.0%, 황산 마그네슘(7수염) 0.4%, 염화칼륨 0.2%, 염화칼륨(2수염) 0.4%, 황산망간(약 4수염) 0.006%, 히스티딘 0.03%, 비오틴 400μg/1, 이노신 0.1%, 콘스팁 리커 5.0% 및 리보핵산 0.03%(아데닌 함유 물질 소요량의 약 10%)로써 된 주 발효 배지 1l를 넣은 5l들이 쟈파멘터에 이식하고 온도 38℃, 회전수 1000rpm, 통기량 0.6 V.V.M의 조건에서 주 발효를 개시한다. 이 배지의 경우 증식량의 대표값으로서 측정한 590mm의 파장에 있어서의 흡광도×희석배수(이하 U.O.D라 부른다)의 값이 초발 4, 최종 32로 됨이 예비 실험에서 알았으므로 그 균이 증식을 개시하여 U.O.D가 7.2로 된 배양 8시간 째부터 아데닌 함유 물질로서 리보핵산의 10%용액을 초발 공급속도 F(o)=0.003%,hr로 첨가를 개시하고, 이후 첨가 리보핵산 총량이 배지 액량에 대하여 0.32%가 될 때까지 표 1에 표시한 비(比) 공급속도 K로 1시간 마다 첨가하여 72시간 까지 배양하였다. 그리고 배양중에는 배양액의 PH가 6.7로 유지되도록 25%의 암모니아수를 자동적으로 첨가하였다. 이렇게 하여 얻은 발효 종류 후의 구아노 신량은 고속액체 크로마토 그래피로 측정하여 표 1에 나타난 결과를 얻었다.

[표 1]

[실시예 2]

바실러스.푸미러스 No148-S-16 대신에 바실러스.서브틸리스 ATCC 19221(IFO 14123)을 사용하여 실시예 1과 같은 조건하에서 주 발효를 개시하고 U.O.D. 가 7.5에 이른 배양 8시간 째부터 리보핵산을 첨가량이 약 0.27 또는 0.28%에 이를 때까지 표 2에 표시한 공급 속도로 1시간 마다 첨가하였다.

배양 72시간의 구아노신량을 측정하여 표2의 결과를 얻었다.

[표 2]

[실시예 3]

실시예 1과 같이 바실러스. 푸미러스 No 148-S-16(한국 과학기술원 미생물 수탁번호 820426-02210,FERM BP-6, IFO 12483)을 사용하여 주 발효를 개시함에 있어 초발 배지에 첨가하는 리보핵산을 표 3에 나타낸 바와같이 변경하여 개시하고, 각각 표 3에 표시한 U.O.D.까지 증식한 시점에서 리보핵산을 F(o)=0.003%/hr, K=0.1hr^-1의 조건으로 첨가를 개시하여 리보핵산의 첨가 총량이 0.3에 이를 때까지 1시간 마다 첨가를 행하여 72시간 째의 생성 구아노신량을 측정한 결과 표3에 표시하는 결과가 얻어졌다.

[표 3]

[실시예 4]

주 발효 배지의 탄소원으로서 1ι당 글루코오스 196g, 올리고당 29g을 함유하는 전분 당화액을 사용하여 실시예1과 같은 조건 하에서 바실러스. 푸미러스 No148-S-16(한국 과학기술원 미생물 수탁번호 820426-02210, FERM BP-6, IFO 12483)을 사용하여 주 발효를 개시하여 U.O.D.가 7.4에 이른 배양 8시간째 부터 리보핵산을 표4에 표시하는 초발 공급속도 F(o)로 첨가를 개시하고 이후 첨가 러보핵산량이 0.27%에 이를때까지 1시간마다 K=0.1hr^-1의 비공급 속도로 첨가하여 갔다. 72시간째의 구아노신량을 측정한 결과 표4에 표시한 결과가 얻어졌다.

[표 4]

[실시예 5]

실시예1과 같이 바실러스.푸미러스 No.148-S-16(한국 과학기술원 미생물 수탁번호 820426-02210, FERM BP-6. IFO 12483)을 사용하여 주 발효를 개시함에 있어 초발 배지에 첨가하는 아데닌 함유 물질로서 리보핵산 대신에 표 5에 표시한 물질을 0.0001mole/1 첨가한 배지로 주 발효를 개시하고, U.O.D.가 7 내지 8이 된 시점에서 각각의 아데닌 함유 물질을 초발 첨가량 f(o)=0.0002mole/'1/hr, K=0.1hr^-1의 조건으로 첨가를 개시하여 아데닌 함유 물질의 총 첨가량이 0.001mo1e/1 또는 0.002mo1e/1에 이를 때가지 1시간마다 첨가를 계속하여 배양하여 72시간째의 발효액중의 구아노신 함량을 첨가하였다. 표 5에 표시한 결과를 얻었다.

[표 5]

[실시예 6]

실시예 1에 표시한 K=0.10hr^-1인 때의 배양액(구아노신 51.4g/1 함유 )1l를 80℃로 가온하여 원심분리하고, 상청액을 2℃로 냉각하여 구아노신을 석출 시켜서 16.3g의 조(祖) 구아노신 결정을 얻었다. 이 조 구아노신을 1l의 물에 현탁하여 80℃로 가온하여 용해한 후 2℃로 냉각하여 재결정화하여 구아노신의 결정 13.3g을 얻었다.

Claims (1)

1. 아데닌 요구성 및 구아노신 생산 능력을 가진 바실러스속 미생물을 배지에 배양하여 구아노신을 배양물 중에 생성축적 시켜서 배양물로 부터 구아노신을 채취하는 방법에 있어서, 아데닌 함유 물질을 아데닌으로서 0.001 내지 0.002물/1의 50% 이하를 함유 하는 배지에서 배양을 개시하고, 배지중의 아데닌 함유 물질이 아데닌으로서 0.01 밀리몰/1 이하로 소비된 시점으로 부터 상기 50%량의 나머지를 간헐적 또는 연속적으로 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 구아노신의 제조방법.