KR880002418B1 - 이노신 및 구아노신의 제조법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

이노신 및 구아노신의 제조법

본 발명은 이노신 및 구아노신의 제조법에 관한 것이다. 이노신 및 구아노신은 의약품이나 정미성(呈味性)5'-리보누크레오티드 등의 합성 원료로서 중요한 물질이며, 이를 염가로 또한 대량으로 제조함은 공업상 대단히 의미가 있는것이다.

종래의 이노신 또는/및 구아로신의 제조법으로서는 천연물중에서 추출 단리하는 방법, 또는 미생물에 의한 발효법 등이 알려져 있는데 어느 방법도 제조 공정이 번잡하거나 원료가 비싸거나 또는 발효 수율이 낮은 따위의 결점이 있으므로 공업적 견지에서는 반드시 만족할 만한 것이 못된다.

본 발명자들은 미생물에 의한 이노신 또는/및 구아노신의 발효생산에 있어서 발효수율이 높은 이노신 또는/및 구아노신의 제조법을 확립하기 위하여 여러가지 검토를 거듭한 결과, 발효배지의 주원료로서 이용되는 당질(糖質)을 종래의 초발배지에 일괄하여 첨가하는 방법을 개량하여 미생물의 당소비 속도를 감안하면서 배양의 진행중에 소량씩 간헐적 또는 연속적으로 첨가함으로써 이노신 또는/및 구아노신의 생성 수율이 비약적으로 증대한다는 새로운 사실을 발견하여 이 지식에 의하여 예의 연구를 거듭한 끝에 본 발명을 완성 하였다.

본 발명은 이노신 또는/및 구아노신의 생산 능력을 가진 미생물을 탄소원으로서 당질을 함유한 배지에 배양하여 이노신 또는/및 구아노신을 배양물 중에 생성 축적시켜서 배양물로 부터 이노신 또는/및 구아노신을 채취하는 방법에 있어서, 그 배지중의 탄소원으로서의 당질의 농도가 약 1% 이하인 상태에서 당질을 간헐적 또는 연속적으로 첨가하여 배지중의 당질의 농도를 약 l%를 안 넘도록 유지하여 배양하는 것을 특징으로 하는 이노신 또는/및 구아노신의 제조법이다.

본 발명방법에 있어서 배지에 첨가되는 탄소원으로서의 당질로서는 예를들면, 당류[예; 글루코오스, 프락 토오스, 만노오스, 슈크로오스. 말토오스, 당밀, 전분, 전분의 가수분해물(예; 콘스타아치의 당화액등)등], 당알콜(예 ; 솔비톨등)등을 들 수 있다.

본 발명방법에 있어서는 배양액 중에 탄소원으로서의 당질의 농도가 약 1% 이하인 상태에서 탄소원으로서 당질을 간헐적 또는 연속적으로 첨가하고, 배지중의 당질의 농를 약 1%를 안 넘도록 유지하여 배양을 행한다. 배양액의 초밭 배지중의 탄소원으로서의 당질 농도는 약 1% 이하 또는 약 1% 이상이어도 무방하나 후자의 경우에는 배양을 시작하여 그 당질 농도가 약 1% 이하로 된 후에 당질을 첨가하기 시작하면 된다. 또, 상기 초밭 배지중의 탄소원으로서의 당질의 사입 농도는 약 4% 이하인 경우가 알맞다.

본 발명방법에 있어서는, 배양액중의 당질 농도는 상기한 바와 같이 약 1% 이하의 범위에서 선택된 소정의 값에 제어되지만 그와 같이 배양액 중의 당질 농도를 제어하는 기간은 배양 개시로부터 배양 종료까지의 배양의 전 기간이어도 무방하지만, 그 중의 특정의 기간, 예를들면, 이노신 또는/및 구아노신 생성의 왕성한 배양 12시간째 경부터 배양 종료까지의 기간이어도 무방하다.

또, 배양액 중의 당질 농도를 소정의 값에 제어하기 위하여는 배양액 중의 잔존 당량을 항상 파악하여 둘 필요가 있으나 그와 같은 방법으로서는 예를들면, 통상의 당 측정 시약을 사용하여 배양액 중의 당질 농도를 직접 알아내는 방법 외에 각종 측정기류를 이용하여 배양액이나 배양 배기 가스중의 산소 가스 농도라든가 탄산가스농도를 측정함으로써 배양액 중의 당질 농도를 간접적으로 알아보는 방법등이 있다. 이중에서도 후자의 방법 즉, 각종 측정기류를 이용하여 배양액 중의 당질 농도를 알아내는 방법에 있어서는 그들 측정 기기와 당질 피이드 장치를 운동시킴으로써 배양액 중의 당질 농도를 소정의 값에 자동적으로 제어할 수가 있으므로 편리 하다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 이노신 또는/및 구아노신 생산 능력을 가진 미생물이면 어떤 것이라도 좋다. 그 미생물의 구체 예로서는 예를들면, 바실러스(Bacillus)속균, 브레비박테리움(Brevibacterium)속균, 코리네박테리움(Corynebacterium)속균 등을 들수 있다. 그 바실러스 속균으로서는 예를들면, 바실러스 푸미러스(Bacillus pumilus), 바실러스서브틸리스(bacillus subtilis)등의 종류를 들 수 있으며, 구체적으로는, 바실러스푸미러스 No. 158-A-17(한국과학기술원 미생물 수탁번호 820426-02110, FERM BP-7, IFO 12477), 바실러스서브틸리스 ATCC 13956(IFO 14124)등을 들수 있다.

상기 FERM BP 번호는 부다페스트 조약에 의한 일본 공업 기술원 미생물 공업기술연구소의 기탁 번호를, ATCC 번호는 The American Type culture Collection(미국)의 기탁 번호를, IFO 번호는 일본재단법인 발효연구소의 기탁번호를 각각 표시한다. 그리고, 상기 IFO 12477 주는 일본 특공소 51-46839호 공보에 기재되어 있다. 또, 상기 ATCC 13956 주는 1980년판 ATCC 발행 카탈로그 제14판,(The American Type Culture Collection Catalogue of Strains I Fourteenth Edition 1980)에 수록되어 있다.

그 브레비박테리움 속균으로서는 예를들면, 브레비박테리움 암모니아게테스 ATCC 21477. ATCC 21478, ATCC 21479, ATCC 21480(1980년판 ATCC 카탈로그 제14판에 수록되어 있다)등을 들 수 있다. 그 배지에는 탄소원 이외에도 질소원 등이 통상의 배양에 있어와 마찬가지의 방법에 의하여 첨가된다. 질소원으로서는 콘스립리커, 면실박, 효모 엑기스, 건조효모, 어분, 육 엑기스, 펩톤, 카자아미노산 등의 유기 물질이나 암모니아 가스, 암모니아수, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 탄산 암모늄, 초산 암모늄, 인산 암모늄 등의 무기 질소 화합물 이외에 아미노산 등의 유기 질소 화합물이 사용된다. 또, 배지에는 상기의 탄소원이나 질소원 이외에 사용하는 미생물의 생육이나 이노신 또는/및 구아노신의 축적에 필요한 각종의 금속, 비타민, 아미노산류가 적의 첨가된다.

배양은, 진탕 또는 통기 교반 심부 배양 등의 호기적 조건하에서 실시된다. 배양 온도는 통상 약 20 내지 45℃의 범위에서 사용하는 미생물의 생육 및 이노신 또는/및 구아노신의 축적에 적합한 온도가 선택된다.

또, 배양액의 pH는 약 5 내지 9정도가 알맞으며 배양중의 pH를 이와 같은 최적합한 pH 범위로 유지하기 위하여 황산, 염산, 암모니아가스, 암모니아수, 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 탄산칼슘, 생석회 등을 적의 첨가해도 무방하다. 이러한 조건하에서 통상 약 48-120시간 배양하면 배지 중에 많은 량의 이노신 또는/및 구아노신이 생성된다.

이와 같이 하여 배양액 중에 축적된 이노신 또는/및 구아노신은 통상의 정제수단 예를들면, 이온 교환 수지나 활성탄에 의한 크로마토그래피, 침전법 또는 용매 추출법 등에 의하여 용이하게 채취할 수가 있다. 종래 미생물을 이용하는 이노신 또는/및 구아노신의 발효생산에 있어서는 이미 몇가지 보고된 것이 있는데 그들의 보고에 있어서는 주 탄소원인 당질을 배양 개시 때에 일괄하여 초밭 배지에 첨가하는 방법이 취해져 있다(예를들면, 노가미 등 ; 아미노산 핵산, 17권, 66페이지, 1967년. 죠등 ; 아미노산 핵산, 16권, 100페이지, 1967). 또 이미 일부의 핵산 관련 물질의 발효생산에 있어서는 배양 도중에 당질을 추가 보충 첨가함으로써 당질의 사용량을 늘리는 시험도 시도되고 있다(예를들면 고다니 등 ; Agric. Biol. Chem., 42권, 399 페이지, 1978년). 이들 경우도 배양액 중의 당질 농도가 통상의 상식적인 농도역을 벗어나서 미생물의 생육이 이 현저하게 저해되는 따위의 사태를 회피하기 의한 것이지 배양액 중의 당질 농도를 미리 정해진 값에 제어하고저 한 것은 아니다.

이에 대하여 본 발명의 방법은 이노신 또는/및 구아노신 생성 능력을 가진 미생물을, 배양액 중의 당질 농도를 이노신 또는/및 구아노신의 생산기에 있어서 약 1% 이하의 미리 정해진 값에 제어하면서 배양을 실행하는 것으로서 상기 방법과는 명백히 다른 새로운 방법이며, 이노신 또는/및 구아노신의 대소비당수율(對消費糖收率)을 향상시킬 수가 있다.

따라서, 본 발명의 방법에 있어서는 대소비당수율을 향상 시킬수가 있으므로 원재료인 당질의 사용량을 감소시킬수가 있으므로 본 발명은 공업상 유리한 방법이다.

다음에 실시예를 들어서 본 발명을 더 구체적으로 설명한다. 그리고, 다음에 있어(%)는 특별히 한정하지 않는 한 중량/용량 백분율(W/V %)을 표시한다.

[실시예 1]

영양 한천 배지상에 생육한 바실러스 No. 158-A-17(한국과학기술원 미생물 수탁번호 820426-02110, FER리 BP-7, IFO 12477)을 솔비톨 2%, KH₂PO₄, 0.1%, K₂HPO₄0.3%. 건조 효모 2%로써 된 멸균된 시드 배지에 접종하여 37℃로 18시간 진탕 배양하였다. 5l들이 쟈파멘터에 글루코오스 0.8%.(NH₄)₂SO₄, 0.4%, 글루타민산 소다 0.5%, KH₂PO₄0.05%, KCI 0.1%. CaC1₂.2H₂O, MnSO₄H₂O0.003%. 히스티딘 0.03%. 비오틴 200μg/1, MgSO₄,7H₂O. 0.2%. 리보핵산(순도 70.3%∼ 0.25%, 콘스팁 리커 1%로써된 멸균주 배지 2l를 넣고 상기 시드 배양물 200m1을 이식한다. 온도 38℃, 회전수 1.000rpm, 통기량 1.2l/mim으로 배양을 시작하며. 배양 중에는 25%(V/V) 암모니아수를 자동적으로 첨가하셔 pH를 6.4로 유지하였다. 그리고, 탄소원인 글루코오스 용액의 첨가는 다음에 표시하는 방법으로 행하였다.

방법 A: 배양 개시후 배양액 중의 글루코오스 농도가 0.1% 이하로 된 9시간째부터 배양액 중의 글루코오스 농도가 0.005%∼0.1%의 범위로 유지되도록 배양액 중의 글루코오스 농도를 2시간 마다 글루코오스 옥시다제를 사용하는 효소법에 의하여 측정하면서 별도로 멸균한 80% 글루코오스 용액을 연속적으로 첨가 하면서 56시간 배양을 계속하였다. 이 사이에 소비된 글루코오스의 양은 160g이었다.

방법 B : 배양개시 직후부터 배양액 중의 글루코오스 농도가 1% 이하로 유지되도록 A와 같이 하여 글루코오스를 연속적으로 첨가하면서 48시간 배양을 계속하였다. 이 사이에 소비된 글루코오스의 양은 150g 이였다.

방법 C; 배양개시 직후부터 배양액 중의 글루코오스 농도가 1.8%∼2.2%의 범위로 유지되도록 방법 A와 같이 하여 글루코오스를 연속적으로 첨가하고 40시간 배양을 계속하였다. 이 사이에 글루코오스 소비량은 140g 이었다.

방법 D; 배양개시때에 140g의 글루코오스를 첨가하고 배지 중의 글루코오스가 완전 소비되는 42시간째까지 배양을 계속했다.

상기의 각각의 방법으로 배양을 행한 각 배양물 중의 이노신 및 구아노신 양을 고속 액첼 크로마토그래피를 사용하여 측정하여 표 1에 표시한 결과를 얻었다.

[표 1]

주)이노신 및 구아노신의 축적 총량의 값은 발효 종료시의 액량을 측정하기 초발액량에 대한 값으로 환산하여 표시 하였다.

[실시예 2]

실시예 1과 동조성의 시드 배지에 제2표에 표시한 균주를 각각 접종하고 38℃, 18시간 진탕 배양후 실시예 1과 동조성의 주 배지에 실시예 1과 같은 방법으로 배양하였다. 이때 글루코오스의 첨가 방법은 실시예 1의 "방법 A" 및" 방법 D"의 방법으로 실시하였다. 배양 종료후 실시예 1에 기재한 방법에 따라서 배양물 중의 이노신 및 구아노신을 계량하고 대당수율을 계산하여 제 2표에 표시한 결과를 얻었다

[표 2]

[실시예 3]

실시예 1과 동조성의 시드 배지 100l를 200l들이 시드 배양조에 넣고 통상 방법에 따라서 멸균, 냉각하였다. 여기에 사까구찌 플라스크로 배양한 바실러스 푸미러스 No 158-A-17「한국과학기술원 미생물 수탁번호 820426-02110, FERM BP -7, IFO 12477)를 접종하고 온도 37℃, 교반 회전수 180rpm, 통기량 50/min의 조건에서 18시간 배양하였다. 별도로 실시예 1의 글루코오스 0.8%를 콘스터치 당화액 4%로 바꾼 주발효 배지 900l를 2.000l들이 발효조에 넣고 통상 방법에 따라서 멸균 냉각한후 여기에 상기 시드 배양물 100l를 이식하여 38℃, 240rpm. 800ι/min의 조건에서 배양을 개시하였다. 배양 개시후 20시간째부터 배양액 중의 글루코오스 농도가 0.001%∼0.1%의 범위로 유지되도록 배양액 중의 글루코오스 농도를 글루코오스 타드법으로 1시간 마다 측정하면서 콘스타치의 당화액을 10분 간격으로 간헐적으로 첨가하여 71시간 까지 배양을 계속하였다. 이 사이에 초발액에 대하여 글루코오스를 환산하여 20%의 당화액이 소비되었다. 그리고, 배양액의 pH는 배양의 전기간을 통해 25% 암모니아수로 6.3∼6.5로 자동적으로 조절하였다. 배양 종료후 배앙액 중의 이노신 및 구아노신을 고속 액체 크로마토그래피로 정량한 곁과 각각 29.6g/1 및 4.2g/1였다. 그리고, 이 경우의 대당수율은 양자의 합계로 21.3%였다.

상기 배양액의 1.000l를, 가성 소다로 pH를 10으로 조절하여 여과하고 이 여과액 900l를 1000l의 음이온 교환 수지 앰버라이트 IRA-402(Cl형)(롬 & 하스사제 : 미국)의 컬럼에 건 다음 0.2N HCI로 SV=1의 속도로 용출을 행하여 이노신 및 구아노신의 함유구분 4.000l를 얻었다.

다음에 이것을 850l의 활성탄의 칼럼에 흡착시킨 후 5v/v%의 부타놀·물을 사용하여 용출하고 얻어진 이노신 및 구아노신의 획분(5,100l)을 가성 소다로 중화한후 감압하에 농축하였다(140l). 이 농축액을 5℃로 냉각하여 이노신(22.0kg)과 구아노신(2.9kg)의 혼합 결정을 얻엇다.

Claims (5)

1. 이노신, 구아노신, 또는 이노신 및 구아노신 생산능력을 가진 바실루스속에 속하는 미생물을 탄소윈으로서 당질을 함유하는 배지에 배양하여 이노신, 구아노신, 또는 이노신 및 구아노신을 배양물중에 생성 축적시키고, 배양물로 부터 이노신, 구아노신, 또는 이노신 및 구아노신을 채취하는 방법에 있어서, 그 배지중의 탄소원으로서의 당질의 농도가 1% 이하인 상태에서 당질을 간헐적으로 또는 연속적으로 첨가하여 배지중의 당질의 농도를 1%를 넘지 않도록 유지하여 배양되는 것을 특징으로 하는 이노신, 구아노신, 또는 이노신 및 구아노신의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 배지중의 탄소원으로서의 당질이 소비되어 그 농도가 1% 이하로된 이후에 당질을 첨가하기 시작하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 배지중의 탄소원으로서의 당질의 투입 농도가 4%이하인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 당질이 글루코오스이며, 배지중의 그의 농도를 0.005∼0.1%로 유지함을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 당질이 옥수수 전분 당화액이며, 배지중의 그의 농도를 글루코오스 기준으로 0.001∼0.1%로 유지함을 특징으로 하는 방법.