RU2088659C1 - Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент тимидина - Google Patents
Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент тимидина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2088659C1 RU2088659C1 RU9595104437A RU95104437A RU2088659C1 RU 2088659 C1 RU2088659 C1 RU 2088659C1 RU 9595104437 A RU9595104437 A RU 9595104437A RU 95104437 A RU95104437 A RU 95104437A RU 2088659 C1 RU2088659 C1 RU 2088659C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thymidine
- strain
- bacillus amyloliquefaciens
- producer
- auxotroph
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, микробиологическая промышленность, микробиологическое производство тимидина. Сущность изобретения: новый штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-6843, продуцирующий до 4,5 г/л тимидина за 96 ч. ферментации на среде, содержащей глюкозу, дрожжи кормовые - паприн, аммоний азотнокислый, магний хлористый, мел. Штамм устойчив к 5-фторурацилу, 5-фторуридину, 5-фтордезоксиуридину и является ауксотрофом по аденину, гистидину, тиамину и неполным ауксотрофом по тирозину и аспарагину.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается прямого микробиологического синтеза тимидина.
Тимидин (2'-тиминдезоксирибонуклеозид) пиримидиновый дезоксирибонуклеозид является структурным компонентом дезоксирибонуклеиновых кислот. Он используется в качестве исходного соединения для химического синтеза азидотимидина единственного на сегодняшний день эффективного средства для терапии болезни СПИД. Кроме того, тимидин и его производные имеют большие перспективы использования в медицине при создании лекарственных препаратов антимикробного и антиканцерогенного действия, а также как реактив при проведении научных исследований в области биологии и сельского хозяйства.
В промышленных масштабах тимидин получают путем ферментативного гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из молок лососевых и сельдевых рыб, с последующим отделением тимидина от других дезоксирибонуклеозидов и азотистых оснований [1] Недостатками данного способа являются: сезонность поступления сырья (молок), его ограниченная доступность, необходимость применения дорогостоящих препаратов (специфических ферментов-нуклеаз) для гидролиза ДНК, высокая стоимость конечного продукта. Кроме того, масштабное получение тимидина данным способом может нанести существенный ущерб экологии ценных пород промысловых рыб.
Известны штаммы бактерий, относящихся к родам Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, Flavobacterium, Micrococcus и др. осуществляющие трансформацию 2'-дезоксирибозо-1-фосфата и тимина до тимидина [2,3] Недостатком этих штаммов является то, что в качестве исходного сырья для получения тимидина применяются весьма дорогостоящие соединения, что приводит к удорожанию целевого продукта.
Для производства тимидина более рентабельной является технология прямого микробиологического синтеза. Известен штамм Brevibacterium L-17 [4] который продуцирует 1,9 г/л тимидина и 2 г/л тимина за 168 ч на питательной среде, содержащей глюкозу (15), дрожжевой экстракт (1), минеральные соли, витамины (тиамин: кальция пантотенат, биотин, фолевую кислоту), а также целый ряд микроэлементов. Недостатками данного штамма являются низкий выход тимидина и длительность ферментации. Задача изобретения получение нового штамма, обеспечивающего повышение выхода тимидина, получаемого путем прямого микробиологического синтеза на дешевых и простых по составу средах и сокращение времени ферментации.
Поставленная задача достигается созданием штамма Bacillus amyloliguefaciens КГМ-5, способного продуцировать до 4,5 г/л тимидина за 96 ч ферментации на среде, содержащей, глюкозу 12; БВК 3,4; NH4NO3 2,5; MgCl2 0,5; CaCO3 2.
Штамм КГМ-5 получен с применением современных генетико-селекционных методов с использованием структурных аналогов природных пиримидинов, в частности, 5-фторурацила, 5-фторуридина, 5-фтордезоксиуридина. Отбор проводили путем ступенчатой селекции к возрастающим концентрациям указанных аналогов.
Штамм Bacillus amyloliquefaciens КГМ-5 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-6843.
Культурально-морфологические признаки.
Грамположительная палочка длиной 4-5,5х0,6-0,8 мкм, со сниженной подвижностью и способностью к спорообразованию (эффективность споруляции 0,1х10-7 спор/мл). На полноценных агаризованных средах (агары: L, мясопептонный, Хоттингера) через 24-48 ч инкубации при 34-37oC образует колонии беловато-кремового цвета с изрезанным краем, диаметром 1 2,5 мм. Посев штрихом на агаре Хоттингера дает после 24 ч при 34 37oC умеренный рост, цвет кремовый.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный аэроб. При инкубации в полноценной жидкой среде наблюдается поверхностный рост. При посеве уколом в полноценный 0,7 агар растет на поверхности. При интенсивной аэрации наблюдается интенсивный рост, без встряхивания клетки лизируются. Для роста на жидкой или агаризованной синтетических средах клетки продуцента требуют аденин, гистидин, тирозин, аспарагин и тиамин. Желатину разжижает, растет на крахмальном агаре и обезжиренном молоке, клетчатку не разрушает и не усваивает, нитраты не восстанавливает.
В качестве единственных источников углерода усваивает глюкозу, фруктозу, маннозу, глицерин, цитрат, сахарозу, лактозу, галактозу, сукцинат, пируват, фумарат. Плохо усваивает рибозу, ксилозу, глюконат.
Отношение к источникам азота. Усваивает азот в форме аммонийных солей (аммоний сернокислый, аммоний азотнокислый и др.).
Отношение к температуре. Растет при температуре от 25 до 40oC. Оптимальная температура 34-37oC.
Отношение к pH среды. Растет при pH от 6,5 до 8,5. Оптимальное значение pH 7,3.
Чувствителен к антибиотикам: пенициллину, стрептомицину, рифампицину, неомицину. Устойчив к 5-фторурацилу, 5-фторуридину, 5-фтордезоксиуридину.
Штамм КГМ-5 является ауксотрофом по аденину, гистидину, тиамину и неполным ауксотрофом по аспарагину и тирозину. Обладает сниженной активностью пиримидиннуклеозидфосфорилазы и цитидиндезаминазы. Совокупность перечисленных мутаций в штамме КГМ-5 приводит к сверхпродукции тимидина. Антагонистических свойств не имеет, не патогенен.
За 96 ч ферментации образует 4,5 г/л тимидина. Кроме тимидина штамм КГМ-5 в значительном количестве (до 5 г/л) продуцирует такое ценное соединение, как дезоксицитидин.
Штамм поддерживают на полноценных агаризованных средах (Хоттингера, мясо-пептонный агар) в течение 7-10 сут. Для длительного хранения используют ампулы с лиофильновысушенными клетками.
Пример. Культуру штамма Bacillus amyloliquefaciens КГМ-5 выращивают в течение 24 ч при 34-37oC на полноценной агаризованной среде Хоттингера, затем культуру засевают в колбы емкостью 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава, г/л: глюкоза 20; пептон 10; дрожжевой экстракт 10; натрий хлористый 2,5; вода дистиллированная до 1 л; pH 7,2 7,5. Колбы устанавливают на термостатируемую круговую качалку (200-240 об./мин) и выращивают посевной материал в течение 24 ч при 34oC.
Выращенный посевной материал в количестве 5-10 об. вносят в колбы емкостью 750 мл, содержащие 30 мл ферментационной среды следующего состава, г/л: глюкоза 120; БВК 34; аммоний азотнокислый 25; магний хлористый 5; мел 20; вода дистиллированная до 1 л; pH 7,2-7,5. Процесс ферментации осуществляют на круговой качалке (240-260 об./мин) при 34oC.
Через 96 ч ферментации в культуральной жидкости накапливается 4,5 г/л тимидина и до 10 г/л других нуклеозидов (в том числе 5 г/л дезоксицитидина).
Аналитический контроль содержания тимидина в культуральной жидкости, а также сопутствующих ему других нуклеозидов осуществляли методом тонкослойной хроматографии на отечественных ТСХ-пластинках Sorbfil. Визуализацию пятен на хроматограммах осуществляли с помощью ультрахемископа Брумберга (длина волны
254 нм). Идентификацию гомогенности веществ, находящихся в пятках и соответствующих по хроматографической подвижности стандартам тимидина, дезоксицитидина и других нуклеозидов осуществляют с помощью ВЭЖХ после элюции с пластинки этих соединений.
254 нм). Идентификацию гомогенности веществ, находящихся в пятках и соответствующих по хроматографической подвижности стандартам тимидина, дезоксицитидина и других нуклеозидов осуществляют с помощью ВЭЖХ после элюции с пластинки этих соединений.
Анализ продуктов, накапливающихся в культуральной жидкости проводили также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЗЖХ), основанном на разделении нуклеозидов с последующим диодно-матричным детектированием и последующей идентификацией по временам удержания и спектральным характеристикам. Разделение проводят на обращенно-фазной колонке с элюентом, содержащим уксусную кислоты, триэтиламин и ацетонитрил. Пробы разводят в 10 раз элюентом. Количественную обработку проводят методом абсолютной калибровки.
Литература.
1. Advanced Org.Chem. Third Bd. John Wiley, N.Y. 1985, p.390.
2. Патент Японии N 1104190.
3. Патент Японии N 2023882.
4. Европейский патент N 344937.
Claims (1)
- Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-6843 продуцент тимидина.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU9595104437A RU2088659C1 (ru) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент тимидина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU9595104437A RU2088659C1 (ru) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент тимидина |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU95104437A RU95104437A (ru) | 1996-12-10 |
RU2088659C1 true RU2088659C1 (ru) | 1997-08-27 |
Family
ID=20166055
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU9595104437A RU2088659C1 (ru) | 1995-03-27 | 1995-03-27 | Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент тимидина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2088659C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2509148C1 (ru) * | 2012-08-31 | 2014-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "НОВА" | ШТАММ Bacillus amyloliquefaciens ВКМ В-2714D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К ТЕТРАЦИКЛИНУ И ТРИМЕТОПРИМУ |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110408667A (zh) * | 2019-06-29 | 2019-11-05 | 赤峰蒙广生物科技有限公司 | 一种提高β-胸苷产量的发酵工艺 |
-
1995
- 1995-03-27 RU RU9595104437A patent/RU2088659C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Advanced Org. Chem., Third Bd., Gohn Wiley, N.Y., 1985, p.390. 2. Патент Японии N 1104190, 1989. 3. Патент Японии N 2023882, 1990. Заявка ЕПВ N 0344937, кл. C 12 P 19/38, 1989. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2509148C1 (ru) * | 2012-08-31 | 2014-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "НОВА" | ШТАММ Bacillus amyloliquefaciens ВКМ В-2714D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К ТЕТРАЦИКЛИНУ И ТРИМЕТОПРИМУ |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU95104437A (ru) | 1996-12-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU1838408C (ru) | Способ культивировани бактерий | |
KR920007405B1 (ko) | 아미노산의 제조방법 | |
JPH0698010B2 (ja) | 免疫抑制剤の新規な製造方法 | |
KR870002167B1 (ko) | 리바비린의 제법 | |
EP0188708B1 (en) | Method for production of cytidine and/or deoxycytidine | |
CN101113420A (zh) | 一种高产核苷磷酸化酶的菌种及阿糖核苷的合成方法 | |
RU2088659C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент тимидина | |
JP2874761B2 (ja) | デオキシリボヌクレオシドの生産 | |
US4767713A (en) | Pure culture of Brevibacterium acetylicum AT-6-7, ATCC 39311 | |
Hemphill et al. | Nutrition of Myxococcus xanthus FBa and some of its auxotrophic mutants | |
Nara et al. | Production of Nucleic Acid-Related Substances by Fermentative Processes: Part III. Fermentative Production of 5′-Inosinic Acid by an Adenine Auxotroph of Brembacterium ammoniagenes | |
Moore et al. | Nutritional requirements and biochemical activities of brewery lactobacilli | |
US4880736A (en) | Production of uridine | |
KR910005630B1 (ko) | 발효법에 의한 오로트산의 제조방법 | |
KR880002417B1 (ko) | 구아노신의 제조법 | |
Venkateswarlu et al. | Production of rifamycin using Amycolatopsis mediterranei (MTCC14) | |
JPH022349A (ja) | ピリミジンアナログ耐性化遺伝子dnaおよびその用途 | |
Shimizu et al. | An Improved Method for the Fermentative Production of Coenzyme A from Pantothenic Acid, Cysteine, and 5′-AMP | |
EP0090417B1 (en) | Process for producing 3'-deoxyguanosine | |
US4292309A (en) | Antibiotics C-14482 B1, B2 and B3 | |
CN1688705A (zh) | 茶氨酸的制造方法 | |
JP2927882B2 (ja) | 醗酵法によるオロチン酸および/またはオロチジンの製造法 | |
KR880002418B1 (ko) | 이노신 및 구아노신의 제조법 | |
SU1705347A1 (ru) | Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, предназначенный дл получени 2Ъ-дезоксиаденозина | |
RU2103351C1 (ru) | Штамм дрожжей rhodosporidium diabovatum - продуцент каротиноидов |