CN1688705A - 茶氨酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供高效的茶氨酸制造方法，能使茶氨酸的生产变得简单，并有利于工业生产。本发明人等从自然界的土壤中分离、选定的香茅醇假单孢菌GEA是属于假单胞菌属香茅(citronellosis)种，具有γ－谷氨酰基转移反应的茶氨酸生产菌。通过在9～12的pH值的条件下将来自上述生产菌的谷氨酰胺酶用于谷氨酰胺和乙胺混合物，能以与现有方法相比非常高的效率制造茶氨酸。

Description

茶氨酸的制造方法
技术领域
本发明涉及制造茶氨酸的新方法
背景技术
茶氨酸是已知的绿茶味道的主要成分，是以茶为代表的食品的重要的香料物质。另外，有文献指出，包括茶氨酸在内的γ-谷氨酰胺衍生物，在动、植物体内作为生理活性物质发挥作用。例如，在Chem.Parm.Bull.，19(7)，1301-1307(1971)；同一刊物中的19(6)，1257-1261(1971)；同一刊物中的34(7)，3053-3057(1986)；药学杂志，95(7)，892-895(1975)等文献中，揭示了茶氨酸、谷氨酰胺等可抑制由咖啡因引发的抽搐的内容。由此说明这些化合物对中枢神经系统产生作用，有望作为有效的生理活性物质发挥作用。
一直以来，茶氨酸的常见制造方法是从生产含茶氨酸的玉露茶的茶园中得到的干茶叶中提取的方法。但由于茶氨酸在干茶叶中存量仅有1.5％左右，且由于一般煎茶用茶园的茶叶因活跃的光合作用会使茶氨酸迅速分解，所以，很难保证充足的产量。因此，从干茶叶提取茶氨酸的方法被指工业上不实用。
因此，人们对工业化生产方法的开发有所期待，其一就是化学有机合成茶氨酸的方法(Chem.Parm.Bull.，19(7)，1301-1308(1971))。但这类技术存在着有机合成反应时收率低、合成产物分离、精制等时需要复杂操作的问题。
另外，还有利用谷氨酰胺酶的γ-谷氨酰基转移反应，由谷氨酰胺、乙胺合成茶氨酸的酶法(日本特公平07-55154号公报)。但该方法存在着因谷氨酰胺酶的水解反应而在生成茶氨酸的同时，还生成副产物谷氨酸，而使茶氨酸的精制变得麻烦的问题。
发明内容
本发明是考虑到上述情况而作出的发明，目的在于提供有效的茶氨酸制造方法，能使茶氨酸的生产变得简单，并有利于工业生产。
本发明人等为解决上述问题，反复从自然界的土壤中分离、选定新型茶氨酸生产菌，结果发现特定微生物所具有的谷氨酰胺酶与日本特公平07-55154中所揭示的硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)IFO 12694的谷氨酰胺酶相比，具有高茶氨酸合成活性和低谷氨酸合成活性，从而基本上完成了本发明。上述茶氨酸生产菌是本发明人等首次发现鉴定的新型菌株，名为香茅醇假单孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA(保藏机关名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心地址：日本茨城县筑波市东一丁目1番地中央第6，保藏日：2002年7月31日，保藏编号：FERM BP-8353)。
根据本发明，能提供高效的制造茶氨酸的新方法，能使茶氨酸的生产变得简单，并有利于工业生产。
附图说明
图1为茶氨酸的IR光谱示意图。
具体实施方式
下面，详细说明本发明的具体实施方式，但本发明的技术范围不受限于下述实施方式，在不改变其要点的前提下，可做各种改变进行实施。另外，本发明的技术范围延及均等的范围。
本发明的茶氨酸是指γ-谷氨酰基乙胺、L-谷氨酸-γ-乙胺等。茶氨酸是茶的味道成分，是用于调味用途的食品添加剂。
本发明所用的香茅醇假单孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA，保藏编号：FERM BP-8353)，是由本发明人等发现的新菌株，属于假单胞菌属、香茅(citronellosis)种，是具有γ-谷氨酰基转移反应的茶氨酸生产菌。另外，本发明所用的香茅醇假单孢菌GEA的鉴定，是通过根据一定法则的菌类学性质、生物化学性质的分析和相当于16s rRNA的DNA碱基序列与已知微生物的比较来进行的。
本发明的谷氨酰胺酶是来自香茅醇假单孢菌GEA的酶。该反应的酶活性源可直接使用活菌体或各种处理标准品，例如菌体磨碎物、超声波处理菌体、溶剂处理菌体、低温干燥菌体、硫酸铵盐析物、精制酶标准品等，或上述制品的定形品。为高效进行本发明的酶反应，pH值范围优选为9～12、更优选为10～11。而反应温度优选为10～55℃、更优选为25～35℃。
从如上所述而得的反应液中分离精制茶氨酸采用公知方法。例如，可很容易地通过组合各种色谱(例如，溶剂分配色谱、HPLC等)进行。
下面，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不受限于这些实施例。
实施例
实施例1茶氨酸营养性菌(utilizing bacteria)的分离
采用日本滋贺县、京都府的土壤，配制成土壤悬浊液后，利用以茶氨酸为碳源的选择培养基，其中，茶氨酸0.5％、酵母提取物0.03％、KH2PO4 0.05％、K2HPO4 0.05％、MgSO4·7H2O 0.03％、pH为7，进行3次传代培养，分离100株茶氨酸营养性菌。
实施例2无细胞提取液的配制
在1升实施例1的选择培养基中，分别将100株茶氨酸营养性菌在30℃下培养20小时。然后收集菌体并洗净，悬浊在50毫升30mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，在5℃～20℃下超声波破碎，得到无细胞提取液。
实施例3酶反应
使用实施例2的无细胞提取液，在含谷氨酰胺0.3M、乙胺0.6M的100mM硼酸缓冲液(Na2B4O7-NaOH、pH11)中，在30℃下进行24小时的酶反应，合成了茶氨酸。
实施例4茶氨酸合成活性、谷氨酸合成活性的测定
将实施例3中进行了茶氨酸合成的酶反应液适当稀释，通过进行逆相HPLC，分别对茶氨酸、谷氨酸的合成量进行定量。分析条件如下。分析柱使用Develosil ODS HG-5(野村化学(株))，检测仪使用Waters 2487DualλUV/VIS(Waters社制)检测仪。而内部标准物质使用烟酰胺(Nacalai Tesque，Inc.)。移动相使用以纯水∶甲醇∶三氟乙酸＝980∶20∶1的比例混合的混合物。
比较例1
将硝基还原假单胞菌的无细胞提取液用作100株茶氨酸营养性菌的对照菌株，进行茶氨酸合成活性与谷氨酸合成活性的测定。
试验例1以茶氨酸合成活性为标准，从茶氨酸营养性菌群中选择高茶氨酸生产菌
用实施例2的方法分别调制实施例1中分离的100株茶氨酸营养性菌各菌株的无细胞提取液，用实施例3的方法进行酶反应，用实施例4的方法测定茶氨酸的合成量。结果与成功得到1种与以往报告的硝基还原假单胞菌茶氨酸合成活性相比，具有4倍以上高活性的新型茶氨酸生产菌的菌株。
表1
  茶氨酸合成活性   谷氨酸合成活性
  硝基还原假单胞菌   2.1   2.2
  新型茶氨酸生产菌   9.6   2.6
                                                                                     单位：mM(h·mg)
实施例5新型茶氨酸生产菌的鉴定
按照一定法则，将试验例1所得新型茶氨酸生产菌的菌类学性质、生物化学性质，对下述项目，即革兰氏染色、细胞形态、过氧化氢酶试验(触酶试验)、硝酸盐还原活性、吡嗪酰胺酶、吡咯烷酮酰芳基酰胺酶(pyrrolidonyarylamidase)、碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶、尿素酶、明胶液化能力、七叶苷利用能力、葡萄糖利用能力、核糖利用能力、木糖利用能力、甘露醇利用能力、麦芽糖利用能力、乳糖利用能力、蔗糖利用能力、糖原利用能力进行试验。根据这些试验的结果，参照Bergey′s manual(第8版)的结果，得出菌属是假单孢菌属(Pseudomonas)的结论。
另外，决定相当于16s rRNA的DNA碱基序列，与已知微生物的同序列比较。结果，本菌株鉴定为假单孢菌属(Pseudomonas)，香茅(citronellosis)种，是一种新菌种，据此命名为香茅醇假单孢菌GEA。
实施例6香茅醇假单孢菌GEA培养条件的最优化
本发明人等研究了使用实施例1中的菌选择培养基(碳源：茶氨酸)之外的碳源的培养基的香茅醇假单孢菌GEA的培养。在研究了谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖、甘油等碳源后，结果发现，使用甘油时能达到最佳结果。而在研究了培养基中的甘油浓度后，结果发现，3％甘油浓度下，可得到具有最佳茶氨酸合成活性的无细胞提取液。同时，在研究了酵母提取物浓度后发现，0.3％时可得到具有最佳茶氨酸合成活性的无细胞提取液。
表2
  甘油1％   甘油2％   甘油3％
  酵母提取物0.1％   茶氨酸合成活性   1.02   1.01   1.05
  谷氨酸合成活性   0.34   0.38   0.41
  酵母提取物0.3％   茶氨酸合成活性   1.21   3.33   4.35
  谷氨酸合成活性   0.43   0.25   0.30
  酵母提取物0.5％   茶氨酸合成活性   1.18   1.33   2.02
  谷氨酸合成活性   0.54   0.45   0.48
                                                                                               单位：mM/(h·mg)
实施例7使用来自香茅醇假单孢菌GEA的无细胞提取液的酶反应条件的最优化
按照实施例1中的酶反应条件，研究使用来自香茅醇假单孢菌GEA的无细胞提取液时的谷氨酰胺、乙胺的各种浓度。结果发现，使用0.3M谷氨酰胺与0.9M乙胺反应48小时可得到最大的茶氨酸合成量。
表3
  乙胺   谷氨酰胺0.2M   谷氨酰胺0.3M   谷氨酰胺0.4M
  The   Glu   The   Glu   The   Glu
  0.3M   74.7(72)   10.7   98.3(72)   13.7   80.0(48)   33.3
  0.6M   81.6(60)   5   147(72)   8.1   115(72)   19.1
  0.9M   157(60)   3.1   166(48)   6.6   120(72)   6.2
  1.2M   155(72)   2.7   160(60)   5.2   97.1(72)   4.4
The：茶氨酸，Glu：谷氨酸，()内是反应时间(单位：小时)，单位：mM
实施例8使用香茅醇假单孢菌GEA制造茶氨酸
使用20升含有3.0％甘油、0.3％酵母提取物、0.05％KH2PO4、0.05％K2HPO4、0.03％MgSO4·7H2O的培养液，在容积30升的发酵罐(30℃、转速2000rpm)中将香茅醇假单孢菌GEA培养20小时。培养后，利用离心分离收集菌体并洗净，得到180g菌体。
使用10g配制的菌体，以0.3M谷氨酰胺、0.9M乙胺、pH10、30℃的条件进行酶反应，24小时后得到每升40g的茶氨酸。从反应液中分离精制茶氨酸是通过从反应液中除去菌体后，通过Dowex 50×8、Dowe×1×2谱柱，用乙醇处理而施行的。
用氨基酸分析仪与纸色谱分析法分析该分离物，结果显示出与标准物质同样的特性。而当用盐酸或谷氨酰胺酶进行水解处理后，会按照1∶1的比例产生谷氨酸与乙胺。由于利用谷氨酰胺酶可使该分离物水解，所以表明乙胺结合在谷氨酸的γ位。另外，还利用谷氨酸脱氢酶(GluDH)确认水解生成的谷氨酸为L型。图1表示茶氨酸标准样品的IR光谱。分离物得到与图1的IR光谱同样的光谱。根据上述结果可以确认分离物为茶氨酸。
实施例9使用来自香茅醇假单孢菌GEA的谷氨酰胺酶的固定化酶制造茶氨酸
(1)无细胞提取液的采取
洗净160g实施例8得到的菌体后，悬浊于2升30mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，以5℃～20℃下超声波破碎，得到无细胞提取液。
(2)硫酸铵分级分离(fractionation)
在2升上述(1)所得无细胞提取液中，用7％氨水将pH值调至7，同时加入硫酸铵。在得到35％饱和溶液的阶段，利用离心分离除去沉淀，再添加硫酸铵。在得到90％饱和溶液的阶段放置一夜，由离心分离回收沉淀，将其溶于0.01M磷酸钾缓冲液，对该缓冲液进行透析，得到透析酶液。
(3)使用DEAE-纤维素色谱柱的精制
以0.01M磷酸钾缓冲液缓冲上述(2)所得的透析酶液。然后使之吸附于DEAE-纤维素柱(15×60cm)，用含有0.1M食盐的缓冲液洗提谷氨酰胺酶。结果得到800mg谷氨酰胺酶部分精制(partially purified)品。
(4)固定化谷氨酰胺酶的制备
预先对以水膨润的市售固定化载体Chitopearl 3510(富士纺织(株))充分水洗，然后用0.1M磷酸钠(pH6.8)平衡。将该湿润载体2g悬浊于5ml含35mg上述(3)制备的谷氨酰胺部分精制品的20mM磷酸钠(pH6.8)中，在4℃下搅拌一夜。然后添加戊二醛使最终浓度为2.5％(V/V)，在4℃下放置3小时使之交联。用0.1M磷酸钠(pH6.8)充分洗净根据上述操作而得的固定化酶，在4℃下保存。
(5)由固定化谷氨酰胺酶引起的酶反应
在上述(4)所制备的固定化谷氨酰胺酶中，以30℃、SV＝0.2的流速使基质溶液(4％谷氨酰胺、25％乙胺、pH10.0)通过后，能得到收率65％的茶氨酸。从反应液中分离精制茶氨酸是通过使反应液通过Dowex 50×8、Dowex 1×2谱柱，用乙醇处理而进行。
用氨基酸分析仪与纸色谱分析法分析该分离物，结果显示出与标准物质同样的特性。而当用盐酸或谷氨酰胺酶进行水解处理后，会按照1∶1的比例产生谷氨酸与乙胺。由于利用谷氨酰胺酶可使该分离物水解，所以表明乙胺结合在谷氨酸的γ位。另外，还利用谷氨酸脱氢酶(GluDH)确认水解生成的谷氨酸为L型。经过茶氨酸的IR光谱分析后，标准物质和分离物都得到与实施例8同样的光谱。因此可确认分离物为茶氨酸。

Claims (2)

1.茶氨酸的制造方法，其特征在于，使用香茅醇假单孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA)。
2.如权利要求1所述的茶氨酸制造方法，其特征在于，使用来自香茅醇假单孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA)的谷氨酰胺酶。
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