CN1164737C - 利用枯草芽孢杆菌NX-2制备γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体 - Google Patents
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Abstract
枯草芽孢杆菌NX-2即CGMCC No.0833是经筛选而获得的一株菌种，用在γ-聚谷氨酸及其盐的生产，还可用于谷胱甘肽及其前体的生产。利用枯草芽孢杆菌NX-2在含谷氨酸的培养基中培养，在优化条件下能积累30～50g/lγ-聚谷氨酸，生产率高达0.8～2.5g·h-1·l-1。利用枯草芽孢杆菌NX-2在优化条件下发酵生成γ-谷氨酰转肽酶，发酵液的酶活力达到1～5U/ml，将发酵液或分离纯化得到的酶或其固定化酶用于谷胱甘肽及其前体的生产，对底物二肽或二肽前体的转化率为30～80%。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和高产γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)的微生物菌株，以及将它用于γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体的生产。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)及其盐是一种生物可降解的对人和环境无害的高分子物质，可期待在食品、化妆品、农业、医药和水处理等领域有广泛用途。目前发现有许多细菌能产生γ-PGA，如B.licheniformic ATCC9945，B.subtilis IF03335，B.subtilisF02-1等，但是尚存在耗用原料多，生产周期长，生产率低，生产成本高等问题，因此高效、低成本生产γ-聚谷氨酸仍有待发展。
谷胱甘肽即N-(N-L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸(L-Glutathione、Glutathiol，简称为GSH)，它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽，其中谷氨酸是以γ-羧基与半胱氨酸形成肽键，其分子结构如下：
GSH是一种非常重要的氨基酸衍生物，具有非常广泛的应用前景。作为试剂，谷胱甘肽广泛用于生化、医学、生物学、化学的研究与测定。临床上，它可用于肝炎的辅助治疗，有机物及重金属的解毒，癌症辐射和化疗的保护，白内障、HIV的抑制，细胞膜的保护，性功能的改善等；在食品加工中，谷胱甘肽作为食品添加剂可提高营养，加强食品风味及防止变质；谷胱甘肽还可制成复合治疗和保健的药品用于人体保健。
GSH的制备方法有以下几种：
1、化学合成法：采用常规的肽类合成方法，由L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸经多步的基团保护，接肽和脱保护过程，合成GSH。
2、酵母提取法：从富含GSH的酵母细胞中萃取得到GSH。
3、酶法全合成：利用γ-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶和GSH合成酶分别的催化作用合成，在能量ATP存在下，由L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。
发明内容
本发明目的在于提供一种高产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和高产γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)的微生物新菌株，将它用于γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体的生产。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NX-2(以下简称为NX-2菌株)，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是：CGMCC No.0833保藏日期是：2002年11月18日。以此菌作为生产菌株。
NX-2菌株具有下述性质
1、形态特征
在肉膏琼脂培养基上营养细胞为0.7-1.0×1.3-2.0μm大小的杆菌，30℃培养2-3天形成芽孢，芽孢大小为0.7-0.9×1.0-1.5μm，为长圆形或圆柱形。
2、在各种培养基上的特征：
(1)肉膏琼脂平板培养：25-45℃培养1-3天可大量生长。菌落呈污白色，粗糙有皱褶，不透明，不闪光，蔓延，边缘不规则。
(2)肉膏琼脂斜面培养：同(1)
(3)肉膏液体培养：在液体表面形成菌膜，液体内部透明。
(4)肉膏穿刺培养：菌体在表面生长，底部不生长。
3、生理生化性质：
NX-2菌株的生理生化性质见表1。
表1：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NX-2(CGMCC No.0833)生理生化性质
| 试验项目 结果 | 试验项目 结果 |
| 革兰氏染色 阳性细胞形状 杆状细胞直径＞1微米 -形成芽孢 +芽孢膨大 -芽孢圆形 -伴孢晶体 -接触酶 +氧化酶 -厌氧生长 -甲基红试验 +VP试验 +pH＜6.0 +pH＞7.0 - | 从碳水化合物产酸葡萄糖 +阿拉伯糖 +木糖 +甘露糖 +从葡萄糖产气 -利用柠檬酸盐 +50℃生长 +pH＜5.7生长 +7％NaCl生长 +液化明胶 +水解淀粉 +水解酪素 +硝酸盐还原 + |
根据中国科学院微生物研究所鉴定：NX-2菌株属于枯草芽孢杆菌。
菌株培养
该菌株用于γ-聚谷氨酸及其盐生产时，将菌株经斜面活化，液体培养在含谷氨酸的培养基中，30～37℃培养，可生成30-50g/lγ-聚谷氨酸，生产率高达0.8～2.5g·h-1·l-1。
该菌株用于谷胱甘肽及其前体时，对NX-2菌株进行常规培养，培养基为：葡萄糖1～10％，酵母膏1～5％，玉米浆1～5％，MgSO40.01～0.5％，K2HPO4 0.01～0.5％，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，以下同。pH6～9，装液量20～200ml/500ml三角瓶，100～120℃摇瓶培养20～50分钟。灭菌结束后，冷却，接种，接种量为1～10％，20～40℃摇瓶培养，转速100～220r/min。在上述条件下进行摇瓶发酵试验，培养20～50小时，产γ-谷氨酰转肽酶达1～5U/ml。
γ-谷氨酰转肽酶活力测定方法：在试管中依次加入0.1mol/lTris-HCl缓冲液(pH＝8)1.2ml，0.1MGly-Gly0.4ml，5mmol/lγ-谷氨酰对硝基苯胺0.4ml，组成反应底物。发酵液稀释1～50倍，取0.2ml加入反应底物中，置于37℃恒温水浴30分钟，于721分光光度计(λ＝410nm)测定吸光值。酶活力的单位定义：在上述条件下，每分钟生成1μmol对硝基苯胺的酶量，定义为1个酶活力单位(U)。
培养后的发酵液作为酶源，加入到以L-半胱氨酰L-甘氨酸或其前体和L-谷氨酸或L-谷氨酰胺组成的底物溶液中进行酶反应，生成谷胱甘肽及其前体。
或者，对发酵液进行酶分离纯化后得到γ-谷氨酰转肽酶的酶制剂，配成酶液。
或者，将γ-谷氨酰转肽酶的酶制剂进行固定化，固定化方法为：用生理盐水将γ-谷氨酰转肽酶配成酶溶液，与1.5～6％，1～5倍量的卡拉胶溶液在35～55℃下混匀，冷却后加KCl溶液硬化制成固定化酶，以此作为酶源进行反应。除了卡拉胶作为固定化载体包埋外，还可以用海藻酸钙、明胶、甲壳素等载体包埋的方法。固定化细胞可反复回用，进行多次酶反应。
酶转化反应：加入γ-谷氨酰转肽酶的酶量为50-1000mU/ml，酶反应温度20～50℃，pH6.0～11.0，时间0.5～30小时。
本发明采用化学-酶法工艺路线，通过化学合成法合成L-半胱氨酰L-甘氨酸或基团保护的前体，然后利用微生物产生的γ-谷氨酰转肽酶，以L-谷氨酸或L-谷氨酰胺为γ-谷氨酰基供体，酶法合成(L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸，即谷胱甘肽。该路线避免了化学全合成途径中γ-谷氨酰基接肽过程需要对有关的-NH2，-COOH基团进行保护和脱保护，工艺路线大大简化。该路线同酶法全合成途径相比，不需要供给ATP这一昂贵的原料，很符合实用性要求。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
以葡萄糖1.5％，酵母膏0.5％，谷氨酸3％，KH2PO40.5％，MgSO4.7H2O0.05％，的比例制成培养基，灭菌前的pH为7.0～7.5。500ml容积的三角瓶中装液50ml，121℃灭菌20分钟，冷却。
将上述枯草芽孢杆菌NX-2菌株接种于该培养基中，37℃培养24h，摇瓶转速200r/ml。得到发酵液中γ-聚谷氨酸含量为30g/l，生产率为1.25g·h-1·l-1。
实施例2
培养基为葡萄糖1.5％，酵母膏1.0％，玉米浆1.0％，MgSO40.01％.K2HPO40.01％，pH7，装液量50ml/500ml三角瓶，120℃20分钟。灭菌结束后，冷却，接种，菌种为枯草芽孢杆菌NX-2菌株，接种量为1％，37℃摇瓶培养24小时，转速180r/min。培养液的γ-谷氨酰转肽酶活力为达3.0U/ml。
实施例3
由化学合成制备的L-半胱氨酰L-甘氨酸，用50ml水配制成20mmol/l浓度，再加入L-谷氨酸使其浓度为20mmol/l，混合作为酶反应底物，充N2待用。将实施例2中得到的发酵液加入到反应底物中，加酶量为0.5U/ml，置37℃恒温水浴反应2～10小时，每隔30分钟取样进行高效液相分析。反应10小时，生成谷胱甘肽6mmol/l，对L-半胱氨酰L-甘氨酸转化率30％。
实施例4
将实施例2中发酵液1000ml，离心去除细胞，硫酸铵梯度盐析，过夜，用透析袋对自来水透析过夜，得γ-谷氨酰转肽酶粗酶，该酶制剂活力为80U/g，将该酶制剂用作酶源。由化学合成制备得的S-苄基半胱氨酰甘氨酸甲酯(SBCGM)和L-谷氨酰胺配成底物溶液，SBCGM的浓度为100mmol/l，L-谷氨酰胺浓度为100mmol/l。加入γ-谷氨酰转肽酶粗酶液，加入酶量为0.5U/ml。置37℃恒温水浴反应2～10小时，每隔30分钟取样进行高效液相分析。反应6小时，生成S-苄基谷胱甘肽甲酯，对SBCGM摩尔转化率60％。
实施例5
将实施例3中得到的γ-谷氨酰转肽酶粗酶，取100mg在37-50℃溶于34ml蒸馏水中，又将1.8g卡拉胶溶于66ml生理盐水中，加热溶解后冷却到55℃保温。两者在55℃混匀，冷却后将凝胶切成3mm×3mm×3mm左右的小块，泡在2％KCl溶液中硬化处理过夜。将此固定化酶进行酶转化。酶转化底物为S-苄基半胱氨酰甘氨酸苄酯(SBCGB)和L-谷氨酸配成底物溶液，SBCGB的浓度为100mmol/l，L-谷氨酸浓度为200mmol/l。加入γ-谷氨酰转肽酶粗酶液，加入酶量为0.5U/ml，置37℃恒温水浴反应10小时，生成S-苄基谷胱甘肽苄酯，反复分批转化为8次，对SBCGB摩尔转化率见表2。
表2固定化酶反复分批转化结果
| 转化次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 转化率(％) | 62.3 | 62.1 | 62.5 | 61.8 | 61.5 | 60.2 | 59.3 | 59.2 |
Claims (6)
1、一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NX-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCCNO.0833。
2、利用枯草芽孢杆菌NX-2制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法，其特征是将菌株NX-2经斜面活化，液体培养在含谷氨酸或其盐的培养基中，30-37℃培养，生成30-50g/l γ-聚谷氨酸，生产率高达0.8-2.5g·h-1·l-1。
3、利用枯草芽孢杆菌NX-2制备谷胱甘肽及其前体的方法，其特征是：
a.菌株NX-2进行常规培养，发酵产γ-谷氨酰转肽酶，发酵液的酶活力达1～5U/l；
b.以L-半胱氨酸和L-甘氨酸为主要原料合成L-半胱氨酰L-甘氨酸或基团保护的前体，配成浓度为20-500mmol/l溶液，加入L-谷氨酸或L-谷氨酰胺，作为酶反应底物；
c.将a的发酵液；或者对γ-谷氨酰转肽酶进行分离纯化，得到酶制剂，配成酶液；或者对γ-谷氨酰转肽酶酶制剂进行固定化；和b的酶反应底物溶液混合，反应生成谷胱甘肽及其前体。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征是反应体系中加入γ-谷氨酰转肽酶的酶量50-1000mU/ml，酶反应温度20～50℃，pH6.0～11.0，酶反应时间0.5～30小时。
5、根据权利要求3所述的方法，其特征是固定化方法为：用生理盐水将γ-谷氨酰转肽酶配成酶溶液，与1.5～6％，1～5倍量的卡拉胶溶液在35～55℃下混匀，冷却后加KCl溶液硬化制成固定化酶，以此作为酶源进行反应。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征是还可以用海藻酸钙、明胶、甲壳素载体包埋。
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