CN101215588B - 酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法，包括：利用化学法合成底物S-苄基-L-半胱氨酸；将γ-谷氨酰转肽酶加入到底物S-苄基-L-半胱氨酸和L-谷氨酰胺的混合水溶液中反应；将反应得到的S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸分离，浓缩，结晶；将S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的S-苄基去除，得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸。利用本方法操作简单，成本低，可用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的合成方法，特别是涉及一种利用γ-谷氨酰转肽酶的酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法。
背景技术
γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸经肽键缩合而成的一种同时含有γ-谷氨酰基和巯基的具有生物活性的二肽化合物，是生物体内的非蛋白巯基化合物谷胱甘肽的前体化合物，在医药、食品和保健品领域具有广泛的用途。同半胱氨酸和谷胱甘肽相比，γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸能更加有效的提高细胞内谷胱甘肽浓度，所以医学上用于抗氧化衰老、解毒保肝、治疗白内障等疾病。在食品方面可以强化食品的风味防止食品的褐变等。
目前γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的生产方法主要有化学合成法和发酵法。化学合成法制备γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸由于涉及六个功能基团的保护和脱保护，所以合成路线较长，容易产生消旋体，同时大量有机溶剂会污染环境；而发酵法制备γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸主要有以下不足：产物浓度和转化率较低、发酵时间过长、下游分离难度大、设备成本高。
近年来，随着对γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸研究的深入，γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸在医学、食品、保健等方面越来越引起人们的重视。γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸生产市场需求正迅速扩大，抓紧开发研制并投入生产已是现在γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的研究热点。
专利号为WO2006102722名称为“Process For the Production Ofγ-Glutamylcysteine”公开了一种酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸及其类似物的方法。该方法利用γ-谷氨酰转肽酶、蛋白酶、脂肪酶和水解酶等酶将谷氨酰基从谷氨酰基供体化合物转移到谷氨酰基受体化合物(L-半胱氨酸及其类似物)从而制得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸及其类似物。该方法的优点在于反应条件温和，立体专一性强，谷氨酰胺不需要侧链的保护，反应过程中不消耗ATP。
但是该方法采用的底物经过基团衍生后水溶性较强，导致产物的后处理及分离纯化难以通过离子交换-结晶分离的方法来实现，这限制了该方法的推广使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效利用γ-谷氨酰转肽酶合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的酶学方法，以便于后续结晶分离过程，减少生产成本。
本发明的目的是通过下列措施来实现的：
本发明的酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法包括如下步骤：
1、利用化学法合成底物S-苄基-L-半胱氨酸；
2、将γ-谷氨酰转肽酶加入到底物S-苄基-L-半胱氨酸和L-谷氨酰胺的混合水溶液中，S-苄基-L-半胱氨酸的起始质量百分比为反应物总质量的1.46～2.92％，L-谷氨酰胺的起始质量百分比为反应物总质量的0.5～2％，γ-谷氨酰转肽酶的加入体积为底物混合水溶液体积的0.5～10％，反应pH为9.0～11.0，反应温度为35～45℃，反应时间为2～5小时；
3、将反应得到的S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸分离，浓缩，结晶；
4、将S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的S-苄基去除，得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸。
步骤1中，化学法合成S-苄基-半胱氨酸是本领域技术人员公知技术。底物L-半胱氨酸的巯基用苄基保护后，降低了它们在水中的溶解度，有利于后续分离过程通过结晶实现，减少生产成本。S-苄基-L-半胱氨酸的其余官能团无需保护，可促进底物与酶中心的结合从而强化反应过程，有利于底物转化成产物。
步骤2中，反应底物起始浓度高，有利于酶反应。其反应方程式如下：
步骤2中，γ-谷氨酰转肽酶优选纯的γ-谷氨酰转肽酶，纯度大于95％，其加入体积为底物混合水溶液体积的1％，例如一个20ml反应体积的转化反应，只要加0.2ml酶液即可，比没有纯化的酶用量要少得多。
上述γ-谷氨酰转肽酶可通过如下方法制备：
a、常规方法培养Bacillus subtillis NX-2，发酵产γ-谷氨酰转肽酶。
b、利用蛋白分离纯化系统制备γ-谷氨酰转肽酶。
步骤a中，产酶微生物枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCC No.0833)的培养为：以单糖或双糖作为碳源，如葡萄糖、蔗糖或麦芽糖；氮源以有机氮源为佳，效果最好的是玉米浆和酵母膏。该菌是好氧培养菌，在pH8～9、温度30～40℃的通气条件下，生长良好。在发酵时使用液体培养，一般发酵周期在20～30小时。
步骤b中，可采用
KTATM explorer 100蛋白纯化仪(AmershamPhannacia公司生产)分离纯化γ-谷氨酰转肽酶，该纯化方法利用仪器，对本领域普通技术人员而言，属于一般的分离纯化过程，依照该系统的使用手册即可进行操作。
步骤3中，可以利用蛋白分离纯化系统将反应得到的S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸进行分离。
步骤4中，可以利用三氟甲磺酸进行脱苄反应去除S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸中的苄基，反应温度为40～50℃，反应时间为0.5～1小时。利用三氟甲磺酸进行脱苄法可参考文献[Haruaki Yajima，et al.Trifluoromethanesulphonic Acid，as a DeprotectingReagent in Peptide Chemistry.J.C.S.CHEM.COMM.，1974，107]。
本发明的有益效果如下：
1、本发明采用S-苄基-L-半胱氨酸为反应底物之一，L-半胱氨酸的巯基用苄基保护，降低了它们在水中的溶解，有利于后续分离过程通过结晶来实现，减少生产成本。
2、本发明采用γ-谷氨酰转肽酶催化L-谷氨酰胺与S-苄基-L-半胱氨酸转肽反应，仅需一步就可以得到S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸，收率较高。与化学合成法相比，不需对游离羧基和氨基进行保护与脱除，反应过程中也不会产生消旋体。
3、本发明采用的γ-谷氨酰转肽酶是通过分离纯化得到的精制酶，反应在碱性的水溶液中进行，促进转肽反应，提高转化率(详见实施例转化效果)。
4、本发明采用的S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的下游分离，采用离子交换和结晶操作，方法简单，成本低，便于放大，可用于工业生产。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：
取蔗糖15g，玉米浆30g，蛋白胨15g，K2HPO4 15g，MgSO4 0.5g，pH7.5加自来水配制成1L液体培养基，按此配方配制3.5L装入5L发酵罐中0.1MPa高压蒸汽灭菌25分钟备用。同时分装50mL培养基到500mL，加8层纱布，用牛皮纸包好后，与发酵罐一起灭菌备用。
将冰箱内保存的菌种——枯草芽抱杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCCNo.0833)取出后，接在新鲜斜面培养基(斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂20)上，活化培养24小时，接入种子培养基(种子培养基(g/L)：葡萄糖15，玉米浆10，蛋白胨10，K2HPO42，MgSO40.25)在33℃、220r/min振荡培养20小时。培养结束接入发酵罐，于33℃、200r/min，发酵培养40小时。
发酵结束后，8000r/min离心25分钟，收集上清液。以60％～90％饱和度的硫酸铵梯度进行蛋白质分级沉淀，分离出的蛋白用等体积Tris-HCl(pH8.0，0.05mol/L)复溶，用疏水层析分离，收集30％洗脱液(pH8.0，0.05mol/L Tris-HCl)浓度处的洗脱峰，10万分子量的透析袋透析过夜，PEG20000浓缩，再用DEAE离子交换层析，收率20％～75％洗脱液(pH8.0，0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl)(约25min)梯度洗脱处第一个洗脱峰得到纯的(纯度＞95％)γ-谷氨酰转肽酶(比活为59.6U/mg蛋白)。(疏水层析及DEAE离子交换层析的方法为本领域普通技术人员公知的技术)。
取15.7g(0.1mol)L-半胱氨酸盐酸盐溶解，冷却至0～5℃后，通过恒流泵流加165ml氯化苄的乙醇溶液(氯化苄∶乙醇＝9∶1(V/V))，控制反应温度在5℃左右。流加结束后，室温继续反应约2小时，然后调节反应液至pH值5.50，过滤、洗涤、干燥、得到结晶——S-苄基-L-半胱氨酸，产品19.2g，纯度约98.2％，熔点为210～211℃。
实施例2：
γ-谷氨酰转肽酶制备及纯化方法、底物S-苄基-半胱氨酸的制备方法同实施例1。
取0.146gγ-L-谷氨酰胺，S-苄基-半胱氨酸0.42g，以Tris-HCl(pH10，0.1mol/L)溶解并定容至20mL，再加0.2ml的γ-谷氨酰转肽酶，混合均匀后，搅拌反应3小时，反应温度为40℃。反应结束后，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为：Kromasil KR100 5μC18；检测波长为220nm；流动相为60％KH2PO4缓冲液(20mmol/L)，40％甲醇；流速：1mL/min)，对谷氨酰胺的转化率为27％。
酶催化γ-L-谷氨酰胺，S-苄基-半胱氨酸合成S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的反应结束后，反应液经过超滤除去酶，再用
KTATM explorer 100蛋白纯化仪分离纯化(色谱分离条件：色谱柱Q Sepharose离子交换柱；检测波长为214nm；流动相为分别为A：pH8.5，0.05mol/L Tris-HCl，B：pH8.5，0.05mol/L Tris-HCl+1mol/L NaCl；流速：6ml/min；30min梯度洗脱0～35％B)收集11～13min洗脱液，然后经旋转蒸发浓缩冷却结晶，即可得产品S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸，回收率94％，纯度98％。
将1.0g S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸加入到50ml纯三氟甲磺酸(TFMSA)中，在40℃下反应0.5小时，然后用1mol/L的NaOH中和反应液到pH6-7，加1.0g的二硫苏糖醇(DTT)在50℃下反应1小时，还原氧化态的二聚体。最后利用反相色谱分离纯化还原型γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(色谱分离条件：色谱柱：Hypersil 300AC18 5μm；检测波长为214nm；流动相：A为95％水(含0.1％三氟乙酸)，B为5％甲醇；流速：6mL/min)收集7～8min洗脱液，冷冻干燥，可得粉状的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸0.6g，收率为82％，纯度为98％。(反相色谱的方法为本领域普通技术人员公知的技术)
实施例3：
γ-谷氨酰转肽酶制备及纯化方法、底物S-苄基-半胱氨酸的制备方法同实施例1。
取0.29gγ-L-谷氨酰胺，S-苄基-半胱氨酸0.41g，以Tris-HCl(pH10，0.1mol/L)溶解并定容至20mL，再加0.2ml的γ-谷氨酰转肽酶，混合均匀后，搅拌反应4小时，反应温度为37℃。反应结束后，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为Kromasil KR100 5μC18柱，检测波长为220nm，流动相为60％KH2PO4(20mmol/L)，40％甲醇；流速：1mL/min)，对谷氨酰胺的转化率为25.6％。
酶催化L-谷氨酰胺，S-苄基-半胱氨酸合成S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的反应结束后，反应液经过超滤除去酶，再用KTATM explorer 100蛋白纯化仪分离纯化(色谱分离条件：色谱柱Q Sepharose离子交换柱；检测波长为214nm；流动相为分别为A：pH8.5，0.05mol/L Tris-HCl；B：pH8.5，0.05mol/L Tris-HCl+1mol/L NaCl；流速：6ml/min；梯度洗脱为30min 0～35％B)收集11～13min洗脱液，然后旋转蒸发浓缩冷却结晶，即可得产品S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸，回收率95％，纯度98％。
将1.2g S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸加入到60ml纯三氟甲磺酸(TFMSA)中，在50℃下反应0.5小时，然后用1mol/L的NaOH中和反应液到pH 6～7，加2.5g的二硫苏糖醇(DTT)在50℃下反应1小时，还原氧化态的二聚体。然后利用反相色谱分离纯化还原型γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(色谱分离条件：色谱柱为Hypersil 300A C18 5μm；检测波长为214nm，流动相为A：95％的水(含0.1％三氟乙酸)；B：5％甲醇；流速：6mL/min)收集7～8min洗脱液，冷冻减压干燥，可得粉状的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸0.73g，收率为83％，纯度为98％。(反相色谱的方法为本领域普通技术人员公知的技术)
Claims (5)
1.一种酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)利用化学法合成底物S-苄基-L-半胱氨酸；
(2)将γ-谷氨酰转肽酶加入到底物S-苄基-L-半胱氨酸和L-谷氨酰胺的混合水溶液中，S-苄基-L-半胱氨酸的起始质量百分比为反应物总质量的1.46～2.92％，L-谷氨酰胺的起始质量百分比为反应物总质量的0.5～2％，γ-谷氨酰转肽酶的加入体积为底物混合水溶液体积的0.5～10％，反应pH为9.0～11.0，反应温度为35～45℃，反应时间为2～5小时；
(3)将反应得到的S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸分离，浓缩，结晶；
(4)将S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的S-苄基去除，得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸。
其中，所述的γ-谷氨酰转肽酶通过下述方法制备：
(a)常规方法培养枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis CGMCC No.0833发酵产γ-谷氨酰转肽酶；
(b)利用蛋白分离纯化系统制备γ-谷氨酰转肽酶。
2.根据权利要求1所述的酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸方法，其特征在于所述γ-谷氨酰转肽酶的纯度大于95％。
3.根据权利要求2所述的酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸方法，其特征在于γ-谷氨酰转肽酶的加入体积为底物混合水溶液体积的1％。
4.根据权利要求1所述的酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法，其特征在于步骤(3)中，利用蛋白分离纯化系统将反应得到的S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸进行分离。
5.根据权利要求1所述的酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的方法，其特征在于步骤(4)中，利用三氟甲磺酸进行脱苄反应将S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的S-苄基去除，反应温度为40～50℃，反应时间为0.5～1小时。
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