CN1772916A - 化学酶法合成谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学酶法合成谷胱甘肽的方法。该方法包括:a.利用化学法合成底物;b.制备γ-谷氨酰转肽酶;c.将γ-谷氨酰转肽酶加入到底物溶液中,通过γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应制备谷胱甘肽步骤,其中底物为S-苄基-半胱氨酰甘氨酸和L-谷氨酰胺。本方法简单,成本低,谷胱甘肽转化率高,可用于工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种谷胱甘肽的合成方法,特别是涉及一种利用γ-谷氨酰转肽酶的化学酶法合成谷胱甘肽的方法。
背景技术
还原型谷胱甘肽是一种具有重要生理功能的活性三肽,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成,在医药、食品和保健品领域有广泛的用途。如在医学上可用于解毒保肝,治疗白内障等疾病,在食品方面可强化营养、增强食品的风味和防止食品的褐变等。
目前谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、发酵法和酶法。萃取法制备谷胱甘肽,其生产原料受到限制、生长路线长且产品纯度不高;化学合成法制备谷胱甘肽合成路线比较长,消旋体需拆分,易造成环境污染;而发酵法制备谷胱甘肽需要筛选优良菌种,细胞中GSH含量不高,也存在产品从胞内分离的问题;酶法合成则需要经过两步酶反应,每步酶反应都要消耗能量ATP,必须要ATP再生系统。
近年来,随着对谷胱甘肽研究的深入,谷胱甘肽在医学、食品、保健等方面越来越引起人们的重视。谷胱甘肽的生产市场需求正迅速扩大,抓紧开发研制并投入生产已是现在谷胱甘肽的研究热点。
专利号为ZL02151746.0名称为“利用枯草芽胞杆菌NX-2制备γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体”的专利公开了一种化学酶法合成谷胱甘肽的方法,该方法利用从土壤筛选的枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCC No.0833)发酵所产的γ-谷氨酰转肽酶的催化作用,将谷氨酰基转移到L-半胱氨酰L-甘氨酸或其前体制备谷胱甘肽或其前体,该法将化学合成与酶促合成有机结合,其主要优点表现在反应条件温和,立体专一性强,谷氨酰胺不需侧链保护,在酶反应中不需要加ATP。
该专利公开的利用枯草芽胞杆菌NX-2制备谷胱甘肽及其前体的方法,其步骤是a.菌株NX-2进行常规培养,发酵产γ-谷氨酰转肽酶,发酵液的酶活力达1-5U/L;b.以L-半胱氨酸和L-甘氨酸为主要原料合成L-半胱氨酰L-甘氨酸或基团保护的前体,配成浓度为20-500mmol/L溶液,加入L-谷氨酸或L-谷氨酰胺,作为酶反应底物;c.将a的发酵液;或者对γ-谷氨酰转肽酶进行分离纯化,得到酶制剂,配成酶液;或者对γ-谷氨酰转肽酶酶制剂进行固定化;和b的酶反应底物溶液混合,反应生成谷胱甘肽及其前体。反应体系中加入γ-谷氨酰转肽酶的酶量50-1000mU/ml,酶反应温度20-50℃,pH6.0-11.0,酶反应时间0.5-30小时。
但是该方法采用的底物为L-半胱氨酰L-甘氨酸或基团保护的前体及L-谷氨酸或L-谷氨酰胺,这些底物的水溶性不高,导致底物浓度太低,影响酶的利用,其采用的酶也是粗酶,在酶转化反应过程中,粗酶带有的一些杂质影响反应,而引起副反应的发生,使最终产品的纯度不高,使用粗酶反应,其转化效率不高,会造成反应底物的浪费,而且一些杂质会影响酶反应产物的分离,从而影响收率;另外,用粗酶反应,只所用的粗酶量比较大,则进一步在反应过程中增加了杂质,限制了该方法的推广使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种转化率高的利用γ-谷氨酰转肽酶的化学酶法合成谷胱甘肽的方法。
本发明的目的是通过下列措施来实现的:
一种化学酶法合成谷胱甘肽的方法,包括:a、利用化学法合成底物,b、培养Bacillussubtillis NX-2产生γ-谷氨酰转肽酶,c、将γ-谷氨酰转肽酶加入到底物溶液中,通过γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应制备谷胱甘肽,其中底物为S-苄基-半胱氨酰甘氨酸和L-谷氨酰胺。
其中底物S-苄基-半胱氨酰甘氨酸的甘氨酸的羧基不需要保护,以增加其水溶性,若甘氨酸的羧基用甲基或苄基保护后,降低了它们在水中的溶解,使反应液中底物浓度较低,影响酶的利用率。另外,若甘氨酸的羧基用苄基保护,其芳香环会影响二肽底物与酶反应中心的结合,产生酶反应过程中的空间位阻效应,从而导致酶反应收率比较低。
该方法中采用的γ-谷氨酰转肽酶为纯酶,一个转化反应,50ml反应体积只要加个1U的酶活力的酶液即可,比没有纯化的酶用量要少的多。
所述的合成谷胱甘肽的方法,其中γ-谷氨酰转肽酶是通过下列步骤得到的:
a、常规方法培养Bacillus subtillis NX-2,发酵产生γ-谷氨酰转肽酶;
b、利用蛋白质分离纯系统KTATM explorer 100蛋白纯化仪(Amersham Pharmacia公司生产)分离纯化γ-谷氨酰转肽酶:以100%冷丙酮(-20℃)冰水浴中加入发酵液上清液,离心,沉淀物用原上清液30%体积的Tris-HCl(pH8.0,0.05mol/L)重新溶解;以60-90%饱和度的硫酸铵梯度做蛋白质梯度沉降,分离出的蛋白用等体积Tris-HCl(pH8.0,0.05mol/L)复溶;以pH8.0,0.05mol/L Tris-HCl+1.0mol/L硫酸铵为上样缓冲,pH8.0,0.05mol/L Tris-HCl为洗脱液,进行疏水层析分离,收集30%洗脱液浓度处的洗脱峰;10万分子量的透析袋透析过夜,PEG20000浓缩;以pH8.0,0.05mol/LTris-HCl为上样缓冲,pH8.0,0.05mol/LTris-HCl+0.5mol/LNaCl为洗脱液,进行DEAE离子交换层析,收集20-80%洗脱液(30min)梯度洗脱处第一个洗脱峰即得到纯的γ-谷氨酰转肽酶(电泳纯)。该纯化方法是利用仪器,对本领域普通技术人员而言,属于一般的分离纯化过程,依照该系统的使用手册即可进行操作。
所述的合成谷胱甘肽的方法,其中利用γ-谷氨酰转肽酶反应制备谷胱甘肽时反应在水溶液中进行,且反应pH必须控制在碱性9-11。
以下具体介绍本发明的方法:
产酶微生物枯草牙孢杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCC No.0833)的培养:以单糖或双糖作为碳源,如葡萄糖、蔗糖或麦芽糖;氮源以有机氮源为佳,效果最好的是玉米浆和酵母膏。该菌是好氧培养菌,在pH5-9、温度25-40℃的通气条件下,生长良好。
在发酵时使用液体培养,一般发酵周期在20-30小时,发酵结束后,发酵液离心收集上清液,再KTATM explorer 100蛋白纯化仪分离纯化得到γ-谷氨酰转肽酶用作合成催化剂。
酶反应的前体底物S-苄基-半胱氨酰甘氨酸是通过化学合成得到的。先将半胱氨酸的侧链巯基用苄基保护,再将其氨基用苄氧羰基保护,得到N-苄氧羰基-S-苄基-半胱氨酸,再与甘氨酸甲酯缩合得到N-苄氧羰基-S-苄基-半胱氨酰甘氨酸甲酯,将它脱保护得到S-苄基-半胱氨酰甘氨酸。化学法合成S-苄基-半胱氨酰甘氨酸的方法为本领域技术人员公知方法。S-苄基-半胱氨酰甘氨酸的羧基无需保护,可以增加其水溶性,如果底物浓度太低,影响酶的利用;且减少保护基团可促进底物与酶活性中心的结合从而增强反应过程,有利于底物的转化成产物。
利用γ-谷氨酰转肽酶反应制备谷胱甘肽时反应在水溶液中进行,S-苄基半胱氨酰甘氨酸的起始浓度为1.2-2.0%,谷氨酰胺起始浓度为1.5-2.0%;pH9-11;反应温度35-40℃;反应时间为10-16小时。反应底物起始浓度高,有利于酶反应,但如果太高的话,有可能抑制酶反应。
反应结束后,反应液经过微滤除去酶,再用高效液相色谱系统分离纯化(色谱分离条件:色谱柱为麦科菲柱(反相柱),检测波长为254nm,流动相为A:0.2%三氟乙酸,B:甲醇,梯度洗脱5%B~30%B;流速:8mL/min),得到中间产物S-苄基-谷胱甘肽。S-苄基-谷胱甘肽,在液氨的条件下脱苄基(该脱保护基的方法是常规的化学方法,教课书里都有),即可得到产品谷胱甘肽。反应方程式如下:
本发明的有益效果:
1、本发明采用S-苄基半胱氨酰甘氨酸为反应底物之一,S-苄基半胱氨酰甘氨酸的羧基无需保护,以增加其水溶性,同时减少保护基团可促进底物与酶活性中心的结合从而增强反应过程,有利于底物转化成产物,提高转化率(专利ZL02151746.0介绍的工艺其转化率只有30%)。
2、本发明采用的γ-谷氨酰转肽酶是通过分离纯化得到的精制酶,反应在碱性的水溶液中进行,可提高酶的效率,促进反应转化,提高转化率。本申请方法简单,成本低,谷胱甘肽转化率高(详见实施例转化效果),可用于工业生产。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1:
取蔗糖20g,玉米浆30g,蛋白胨10g,K2HPO4 15g,MgSO4 0.5g,pH7.5加自来水配制成1000mL液体培养基,按此配方配制3.5L装入5L发酵罐中0.1MPa高压蒸汽灭菌25分钟备用。同时分装50mL培养基到500mL,加8层纱布,用牛皮纸包好后,与发酵罐一起灭菌备用。
将冰箱内保存的菌种——枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCCNo.0833)取出后,接在新鲜斜面培养基(斜面培养基(g/L):蛋白胨10,牛肉膏3,NaCl5,琼脂20)上,活化培养24小时,接入种子培养基(种子培养基(g/L):葡萄糖20,玉米浆10,蛋白胨5,K2HPO4 2,MgSO4 0.25)在32.5℃、220rpm振荡培养20小时。培养结束接入发酵罐,于32.5℃、200rpm,补料添加四新有机硅发酵消泡剂(X-100F),发酵培养40小时。
发酵结束后,8000转/分离心机离心25分钟,收集上清液。以100%(体积比)冷丙酮(-20℃)冰水浴中加入发酵液上清液,离心,沉淀物用原上清液30%体积的Tris-HCl(pH8.0,0.05mol/L)重新溶解;然后以60-90%饱和度的硫酸铵梯度做蛋白质梯度沉降,分离出的蛋白用等体积Tris-HCl(pH8.0,0.05mol/L)复溶,用疏水层析分离,收集30%洗脱液(pH8.0,0.05mol/L Tris-HCl)浓度处的洗脱峰后,再用DEAE离子交换层析,收率20-80%洗脱液(pH8.0,0.05mol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl)(约30min)梯度洗脱处第一个洗脱峰得到纯的(电泳纯)γ-谷氨酰转肽酶。(疏水层析及DEAE离子交换层析的方法为本领域普通技术人员公知的技术)。
取15.7g(0.1mol)L-半胱氨酸盐酸盐溶解,冷却至0~5℃后,通过恒流泵流加165ml氯化苄的乙醇溶液(氯化苄∶乙醇=1∶9(v/v)),控制反应温度在5℃左右。流加结束后,室温继续反应约2h,然后调节反应液至pH值5.50,过滤、洗涤、干燥,得到结晶——S-苄基-半胱氨酸,产品19.2g,纯度约98.2%,熔点为210~211℃。
取S-苄基-半胱氨酸10.5g(约0.05mol),用200mL 2mol/L NaOH进行溶解,将溶液置于500mL三口烧瓶中,利用滴液漏斗向其中缓慢滴加9.8mL氯甲酸苄酯,电动搅拌器充分搅拌后进行反应,反应温度控制在0℃,反应时间5h。反应结束后用乙醚洗涤后,乙酸乙酯萃取得酯层,并用水洗至中性,无水硫酸钠干燥后浓缩,石油醚结晶——S-苄基-N-苄氧羰基半胱氨酸,产品15.5g,收率为88%,纯度达95%。同法制备S-苄基N-苄氧羰基半胱氨酸备用。
取17.4g S-苄基N-苄氧羰基半胱氨酸溶解于100mL二氯甲烷;6.27g甘氨酸甲酯溶于100mL二氯甲烷中,再加入20mL四氢呋喃和7mL三乙胺,将两溶液混匀后置于500mL三口烧瓶中预冷至0℃,再将10.5g DCC(环二己基碳二亚酰胺)的50mL冰冷四氢呋喃溶液滴加到反应液中,0℃搅拌反应,再室温反应5h。滤去沉淀物,滤液浓缩至干,再用乙酸乙酯溶解,依次用NaHCO3、2N柠檬酸、NaHCO3和水洗涤,加无水硫酸钠干燥后减压浓缩有固体析出时加入石油醚研磨得白色结晶——S-苄基-N-苄氧羰基-半胱氨酰甘氨酸甲酯,产品18.5g,收率为89%,纯度为97%。
取10g S-苄基-N-苄氧羰基-半胱氨酰甘氨酸甲酯置于500mL圆底烧瓶中(瓶口接有氯化钙干燥管),加入40mL 39.5%的溴化氢的醋酸溶液于室温下振摇,2h后减压抽去部分溴化氢和冰醋酸,得到油状物。加入大量乙醚研磨,倾去乙醚后,抽干成粉状物,放置于真空干燥器中进行干燥。。将所得到的固体溶于200mL水中,过滤除去少量不溶物,滤液用乙醚洗两次以除去残余的溴化苄,分出水层,用乙酸乙酯抽提,再5%NaCl水洗至中性,无水硫酸钠干燥减压浓缩得结晶S-苄基-半胱氨酰甘氨酸二肽6.8g,收率为91%,纯度为98%。
取0.134g S-苄基-半胱氨酰甘氨酸二肽溶解于50mL三角瓶中,L-谷氨酰胺0.074g,去离子水10mL,用5mol/L NaOH调节pH至10.0,再加1.0U的γ-谷氨酰转肽酶,混合均匀后,搅拌反应10h,反应温度为39℃。反应结束后,反应液经过微滤除去酶,硅胶薄层制备色谱,流动相为正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1,v/v/v),得S-苄基-谷胱甘肽0.1g,收率为50%,纯度为95%。同法制备S-苄基-谷胱甘肽备用。
再将所得的S-苄基-谷胱甘肽脱掉苄基就可得到还原型谷胱甘肽。取1.9gS-苄基-谷胱甘肽置于新配成的Na/液氨溶液(浓度约15%(m/v))中,轻微振荡至溶液不再变色,然后室温让氨自然挥发干,再冷冻减压抽干,则可得到粉状的谷胱甘肽1.4g,收率90%,纯度97%。对S-苄基-半胱氨酰甘氨酸的转化度为45%。
实施例2
γ-谷氨酰转肽酶制备及纯化方法、底物S-苄基-半胱氨酰甘氨酸二肽的制备方法均同实施例1。
取0.134g S-苄基-半胱氨酰甘氨酸二肽溶解于50mL三角瓶中,L-谷氨酰胺0.09g,去离子水10mL,用5mol/L NaOH调节pH至11.0,再加1.0U的γ-谷氨酰转肽酶,混合均匀后,搅拌反应10h,反应温度为39℃。反应结束后,反应液经过微滤除去酶,硅胶薄层制备色谱,流动相为正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1,v/v/v),得S-苄基-谷胱甘肽0.095g,收率为48%,纯度为95%。同法制备S-苄基-谷胱甘肽备用。
将2.0gS-苄基-谷胱甘肽置于新配成的Na/液氨溶液中,轻微振荡至溶液不再变色,然后室温让氨自然挥发干,再冷冻减压抽干,则可得到粉状的谷胱甘肽1.35g,收率88%,纯度96%。对S-苄基-半胱氨酰甘氨酸的转化度为43%。
实施例3
γ-谷氨酰转肽酶制备及纯化方法、底物S-苄基-半胱氨酰甘氨酸二肽的制备方法均同实施例1。
取0.2g S-苄基-半胱氨酰甘氨酸二肽溶解于50mL三角瓶中,L-谷氨酰胺0.08g,去离子水10mL,用5mol/L NaOH调节pH至10.5,再加1.0U的γ-谷氨酰转肽酶,混合均匀后,搅拌反应10h,反应温度为38℃。反应结束后,反应液经过微滤除去酶,硅胶薄层制备色谱,流动相为正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1,v/v/v),得S-苄基-谷胱甘肽0.16g,收率为55%,纯度为96%。同法制备S-苄基-谷胱甘肽备用。
将2.5gS-苄基-谷胱甘肽置于新配成的Na/液氨溶液中,轻微振荡至溶液不再变色,然后室温让氨自然挥发干,再冷冻减压抽干,则可得到粉状的谷胱甘肽1.77g,收率92%,纯度98%。对S-苄基-半胱氨酰甘氨酸的转化度为50%。
Claims (5)
1、一种化学酶法合成谷胱甘肽的方法,包括:a、利用化学法合成底物,b、制备γ-谷氨酰转肽酶,c、将γ-谷氨酰转肽酶加入到底物溶液中,通过γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应制备谷胱甘肽,其特征在于底物为S-苄基-半胱氨酰甘氨酸和L-谷氨酰胺。
2、根据权利要求1所述的方法,其特征在于制备的γ-谷氨酰转肽酶为纯的γ-谷氨酰转肽酶。
3、根据权利要求2所述的合成谷胱甘肽的方法,其特征在于γ-谷氨酰转肽酶是通过下列步骤得到的:
a、常规方法培养Bacillus subtillis NX-2,发酵产γ-谷氨酰转肽酶;
b、利用蛋白质分离纯系统KTATM explorer 100制备纯的γ-谷氨酰转肽酶。
4、根据权利要求1所述的合成谷胱甘肽的方法,其特征在于利用γ-谷氨酰转肽酶反应制备谷胱甘肽时反应在水溶液中进行,且反应pH必须控制在碱性9-11。
5、根据权利要求1所述的合成谷胱甘肽的方法,其特征在于利用γ-谷氨酰转肽酶反应制备谷胱甘肽时S-苄基半胱氨酰甘氨酸的起始浓度为1.2-2.0%,谷氨酰胺起始浓度为1.5-2.0%;反应温度35-40℃;反应时间为10-16小时。
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