CN100999746A - 酶法合成γ－D－谷氨酰－L－色氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶法合成γ－D－谷氨酰－L－色氨酸的方法，先将γ－谷氨酰转肽酶加入到由L－色氨酸8～50mmol/L和γ－D－谷氨酰胺5～35mmol/L组成的底物溶液中，在8小时以内，通过γ－谷氨酰转肽酶的转肽反应制备γ－D－谷氨酰－L－色氨酸，并分离纯化产物γ－D－谷氨酰－L－色氨酸。本发明方法简单，成本低，副反应少，收率较高，纯度好，γ－D－谷氨酰－L－色氨酸转化率高，可用于工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法合成方法，特别是涉及一种利用γ-谷氨酰转肽酶合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法。
背景技术
免疫系统是适于保护有机体对抗病原体和被识别为不是“自身”的细胞的细胞网络。免疫系统一旦激活，就会征集各种各样的细胞和分参与来增强指定的效应子功能，从而消除体内的“非自身”实体。淋巴细胞是能特异性识别和选择性消除外源实体的免疫系统的细胞，与免疫系统的其他细胞相比，诸如与被认为在对侵入物的反应中没有特异性的嗜中性白细胞相比，淋巴细胞给免疫应答带来了特异性、多样性、记忆性和自身/非自身识别等特性。有两组主要的淋巴细胞：B淋巴细胞和T淋巴细胞。T淋巴细胞的正常发育、成熟和分化石由胸腺细胞分泌的肽激素调节的，而二肽γ-D-谷氨酰-L-色氨酸也具有类似性能。研究发现γ-D-谷氨酰-L-色氨酸能够激发T-淋巴细胞分裂及特异性免疫应答，增加老鼠的白细胞介素2和干扰素γ的产生。SCV-07在老鼠体内进行的实验已证实了它对抗肺结核病的生物活性，现在已进入2期临床试验，配合标准化学治疗，在肺结核病的治疗中疗效显著。
目前γ-D-谷氨酰-L-色氨酸主要采用化学法合成，因为γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的分子中有多个活性基团，包括D-和L-氨基酸，还有γ位的酰键，因此用化学法合成需要对多个基团进行保护及脱除，且易生成消旋体。而酶法合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸过程中，γ-谷氨酰转肽酶催化D-谷氨酰胺与L-色氨酸转肽反应，仅需一步就可以得到γ-D-谷氨酰-L-色氨酸，收率较高。此方法的优越性在于：(1)与化学合成法相比，不需进行基团保护与脱除，反应过程中也不会生成消旋体；(2)不需要能量ATP供应；(3)由Bacillu，subtillis NX-2发酵产的γ-谷氨酰转肽酶属于胞外酶，反应过程不受细胞传质的影响。利用谷氨酰转肽酶催化制备小肽的专利有：ZL02151746.0、CN1772916A、JP2005080503、JP5284983等，其专利保护内容主要涉及发酵用菌种、发酵工艺、酶提取纯化工艺和小肽制备工艺。
在上述公开的专利中，利用谷氨酰转肽酶催化制备小肽的方法一般描述为：通过发酵得到谷氨酰转肽酶，通过此酶催化转肽反应制备小肽。经实践和研究发现，采用这些工艺合成小肽存在以下问题：
1.以上专利均存在工艺路线长、操作费用高，收率和纯度不高等缺点，增加了运行和能耗成本，不利于规模化生产，削弱了产品的市场竞争能力。
2.以上专利中反应的底物均采用L型谷氨酰胺做为酶的供体，这样会引起副反应发生，生成多余的三肽和四肽。
3.以上专利中酶法制备二肽的反应时间过长，产物积累到一定量后就开始水解，导致最后转化率不高。
γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的生产市场需求正迅速扩大，因此酶法合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸由于其众多优点而被广泛深入地研究。但经检索，国内外关于酶法合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种高转化率利用γ-谷氨酰转肽酶的化学酶法合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种酶法合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，将γ-谷氨酰转肽酶加入到由L-色氨酸8～50mmol/L和γ-D-谷氨酰胺5～35mmol/L组成的底物溶液中，在8小时以内，通过γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应制备γ-D-谷氨酰-L-色氨酸，并分离纯化产物γ-D-谷氨酰-L-色氨酸。
上述γ-谷氨酰转肽酶为纯化过的γ-谷氨酰转肽酶，其制备方法如下：
a、常规方法培养Bacillus subtillis NX-2，发酵产γ-谷氨酰转肽酶；
b、利用蛋白质分离纯化系统KTATM explorer 100制备纯的γ-谷氨酰转肽酶。
上述底物L-色氨酸的起始浓度优选为12～50mmol/L，γ-D-谷氨酰胺起始浓度优选为10～35mmol/L；L-色氨酸与γ-D-谷氨酰胺的起始浓度比为5∶2～4，优选5∶3。
上述方法中，γ-谷氨酰转肽酶反应制备γ-D-谷氨酰-L-色氨酸时，反应时间优选为3～8小时，进一步优选4～8小时，最优选5～7小时，反应pH为9.0～10.5，可选用Tris-HCl缓冲体系或NaHCO3-NaOH缓冲体系，缓冲液的离子强度为100-200mmol/L，酶量控制在0.001-0.5U/mL，反应温度为35～45℃。
上述产物γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的分离纯化方法为：
用KTATM explorer 100蛋白纯化仪进行分离纯化，分离纯化条件为：色谱柱为反相C18柱，检测波长为214nm，流动相为A：0.1％甲酸，B：乙腈，梯度洗脱5％～40％B，20min；流速：4～8mL/min。
本发明的目的具体是通过下列措施来实现的：
一种酶法合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，包括：a.制备并纯化γ-谷氨酰转肽酶；b.γ-谷氨酰转肽酶的供体为D型谷氨酰胺；c.将γ-谷氨酰转肽酶加入到底物溶液中，通过γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应制备γ-D-谷氨酰-L-色氨；d.分离纯化产物γ-D-谷氨酰-L-色氨酸。
所述的合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，其中γ-谷氨酰转肽酶是通过下列步骤得到的：a、常规方法培养Bacillus subtillis NX-2，发酵产生γ-谷氨酰转肽酶；b、利用蛋白质分离纯化系统KTATM explorer 100蛋白纯化仪(AmershamPhannacia公司生产)分离纯化γ-谷氨酰转肽酶：发酵液离心，取上清液，以60-90％饱和度的硫酸铵梯度做蛋白质梯度沉降，分离出的蛋白用等体积Tris-HCl(pH8.0，0.05mol/L)复溶；以pH8.0，0.05mol/L Tris-HCl+1.0mol/L硫酸铵为上样缓冲，pH8.0，0.05mol/L Tris-HCI为洗脱液，进行疏水层析分离，收集30％洗脱液浓度处的洗脱峰；10万分子量的透析袋透析过夜，PEG20000浓缩；以pH8.0，0.05mol/L Tris-HCI为上样缓冲，pH8.0，0.05mol/L Tris-HCI+0.5mol/L NaCl为洗脱液，进行DEAE离子交换层析，收集20-75％洗脱液(25min)梯度洗脱处第一个洗脱峰即得到纯的γ-谷氨酰转肽酶(电泳纯)。该纯化方法利用仪器，对本领域普通技术人员而言，属于一般的分离纯化过程，依照该系统的使用手册即可进行操作。
所述的合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，其中利用γ-谷氨酰转肽酶反应制备γ-D-谷氨酰-L-色氨酸时γ-谷氨酰转肽酶的供体选择D型的谷氨酰胺，反应在水溶液中进行，反应pH须控制在碱性9.0～10.5，可选用Tris-HCl缓冲体系或NaHCO3-NaOH缓冲体系，缓冲液的离子强度为100-200mmol/L，反应时间在8小时以内，酶量控制在0.001-0.2U/mL，底物L-色氨酸的起始浓度为8-50mmol/L，γ-D-谷氨酰胺起始浓度为5-35mmol/L，两者浓度比为5∶3，反应温度在35-45℃。
所述的合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，其中产品γ-D-谷氨酰-L-色氨酸是利用蛋白质分离纯化系统KTATM explorer 100分离得到的。(分离条件：色谱柱为依利特柱(反相柱)，检测波长为280nm，流动相为A：0.1％甲酸，
B：乙腈，梯度洗脱5％-40％B；流速：6mL/min)，收集梯度洗脱处第二个峰，再冷冻减压抽干得到产品。
以下具体介绍本发明的方法：
产酶微生物枯草牙抱杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCC No.0833)的培养：以单糖或双糖作为碳源，如葡萄糖、蔗糖或麦芽糖；氮源以有机氮源为佳，效果最好的是玉米浆和酵母膏。该菌是好氧培养菌，在pH8-9、温度30-40℃的通气条件下，生长良好。
在发酵时使用液体培养，一般发酵周期在20-30小时，发酵结束后，发酵液离心收集上清液，再KTATM explorer 100蛋白纯化仪分离纯化得到γ-谷氨酰转肽酶用作合成催化剂。
利用γ-谷氨酰转肽酶反应制备γ-D-谷氨酰-L-色氨酸时γ-谷氨酰转肽酶的供体选择D型的谷氨酰胺，反应在水溶液中进行，反应pH须控制在碱性9.0～10.5，底物L-色氨酸的起始浓度为8-50mmol/L，γ-D-谷氨酰胺起始浓度为5-35mmol/L，两者浓度比为5∶3，反应温度在35-45℃，反应时间须在8小时以内。因为γ-谷氨酰转肽酶不仅有转肽作用也有水解功能，如果反应时间过长，产物二肽积累量达到一定浓度后水解速率加快，导致产物量减少。反应结束后，反应液经过微滤除去酶，再用KTATM explorer 100蛋白纯化仪分离纯化(色谱分离条件：色谱柱为反相C18柱，检测波长为214nm，流动相为A：0.1％甲酸，B：乙腈，梯度洗脱5％-40％B；流速：4-8mL/min)，收集梯度洗脱处第二个峰后冻干，即可得到产品γ-D-谷氨酰-L-色氨酸。
本发明的反应方程式如下：
本发明的特点在于：
1、本发明采用γ-谷氨酰转肽酶催化D-谷氨酰胺与L-色氨酸转肽反应，仅需一步就可以得到γ-D-谷氨酰-L-色氨酸，收率较高。γ-谷氨酰转肽酶的供体选用D型谷氨酰胺，因为该酶的受体不能为D型氨基酸，所以选用D型谷氨酰胺作为供体，不会产生三肽或四肽副产物，使转化率远远高于使用L型谷氨酰胺做供体。
2、本发明利用γ-谷氨酰转肽酶催化D-谷氨酰胺与L-色氨酸转肽反应时pH必须控制在碱性9.0～10.5，因为γ-谷氨酰转肽酶不仅有转肽作用也有水解功能，当pH低于9.0时水解活性高于转肽活性。
3、本发明利用γ-谷氨酰转肽酶催化D-谷氨酰胺与L-色氨酸转肽反应时反应时间必须控制在8小时以内，因为γ-谷氨酰转肽酶具有水解活性，如果反应时间过长，产物二肽积累量达到一定浓度后其水解速率大于转肽速率，导致产物量减少，转化率降低。
4、本发明中生产产品γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的反应体系里底物与产物的性质很接近，给产物的分离纯化带来一定困难，利用反相色谱分离纯化，方法简单，纯度好，且回收率高。
5、在酶转化反应过程中，采用的是带有杂质的粗酶，常引起副反应的发生，转化效率低，产物的分离难度大，直接导致产物收率不高，纯度低，同时影响了反应的放大，而本发明采用纯酶，提高了产率，降低了副反应的发生。
具体实施方式
制备例1：制备并纯化γ-谷氨酰转肽酶
取蔗糖15g，玉米浆30g，蛋白胨15g，K2HPO415g，MgSO40.5g，pH7.5加自来水配制成1L液体培养基，按此配方配制3.5L装入5L发酵罐中0.1MPa高压蒸汽灭菌25分钟备用。同时分装50mL培养基到500mL，加8层纱布，用牛皮纸包好后，与发酵罐一起灭菌备用。
将冰箱内保存的菌种——枯草芽抱杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCCNo.0833)取出后，接在新鲜斜面培养基(斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl5，琼脂20)上，活化培养24小时，接入种子培养基(种子培养基(g/L)：葡萄糖15，玉米浆10，蛋白胨10，K2HPO42，MgSO4 0.25)在33℃、220rpm振荡培养20小时。培养结束接入发酵罐，于33℃、200rpm，补料添加四新有机硅发酵消泡剂(X-100F)，发酵培养40小时。
发酵结束后，8000转/分离心机离心25分钟，收集上清液。以60-90％饱和度的硫酸铵梯度做蛋白质梯度沉降，分离出的蛋白用等体积Tris-HCl(pH8.0，0.05mol/L)复溶，用疏水层析分离，收集30％洗脱液(pH8.0，0.05mol/L Tris-HCl)浓度处的洗脱峰后，再用DEAE离子交换层析，收率20-75％洗脱液(pH8.0，0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl)(约25min)梯度洗脱处第一个洗脱峰得到纯的(电泳纯)γ-谷氨酰转肽酶。(疏水层析及DEAE离子交换层析的方法为本领域普通技术人员公知的技术)。
实施例1
取制备例1得到的γ-谷氨酰转肽酶0.02U，加入0.0292gγ-D-谷氨酰胺，L-色氨酸0.0489g，Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl(pH9.0，0.2mol/L)20mL，混合均匀后，搅拌反应5h，反应温度为38℃。反应结束后，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为Kromasil KR100-5C18柱，检测波长为220nm，流动相为75％，20mmol/L KH2PO4，25％甲醇；流速：1mL/min)，γ-D-谷氨酰-L-色氨酸转化率为58％，纯度为98％。
将反应结束后的反应液经过微滤除去酶，再用KTATM explorer 100蛋白纯化仪进行分离纯化，分离纯化条件为：色谱柱为反相C18柱，检测波长为214nm，流动相为A：0.1％甲酸，B：乙腈，梯度洗脱5％-40％B，20min；流速：8mL/min。收集梯度洗脱处第二个峰后再冷冻减压抽干，即可得到产品γ-D-谷氨酰-L-色氨酸，回收率95.7％，纯度99.5％。
实施例2
取制备例1得到的γ-谷氨酰转肽酶0.5U，加入0.0584gγ-D-谷氨酰胺，L-色氨酸0.122g，NaHCO3-NaOH(pH10.5，0.1mol/L)20mL，混合均匀后，搅拌反应6h，反应温度为37℃。反应结束后，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为Kromasil KR100-5C18柱，检测波长为220nm，流动相为75％，20mmol/L KH2PO4，25％甲醇；流速：1mL/min)，γ-D-谷氨酰-L-色氨酸转化率为65％，纯度为98.4％。
将反应结束后的反应液经过微滤除去酶，再用KTATM explorer 100蛋白纯化仪进行分离纯化，分离纯化条件为：色谱柱为反相C18柱，检测波长为214nm，流动相为A：0.1％甲酸，B：乙腈，梯度洗脱5％-40％B，20min；流速：4mL/min。收集梯度洗脱处第二个峰后再冷冻减压抽干，即可得到产品γ-D-谷氨酰-L-色氨酸，回收率96％，纯度99.6％。
实施例3
取制备例1得到的γ-谷氨酰转肽酶4U，加入0.0438gγ-D-谷氨酰胺，L-色氨酸0.102g，Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl(pH10.0，0.1mol/L)20mL，混合均匀后，搅拌反应6h，反应温度为40℃。反应结束后，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为Kromasil KR100-5C18柱，检测波长为220nm，流动相为75％，20mmol/L KH2PO4，25％甲醇；流速：1mL/min)，γ-D-谷氨酰-L-色氨酸转化率为68％，纯度为99％。
将反应结束后的反应液经过微滤除去酶，再用KTATM explorer 100蛋白纯化仪分离纯化(色谱分离条件：色谱柱为依利特柱(反相柱)，检测波长为214nm，流动相为A：0.1％甲酸，B：乙腈，梯度洗脱5％-40％B，20min；流速：6mL/min)，收集梯度洗脱处第二个峰后再冷冻减压抽干，即可得到产品γ-D-谷氨酰-L-色氨酸，回收率95％，纯度99.4％。
Claims (6)
1、一种酶法合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，其特征在于将γ-谷氨酰转肽酶加入到由L-色氨酸8～50mmol/L和γ-D-谷氨酰胺5～35mmol/L组成的底物溶液中，在8小时以内，通过γ-谷氨酰转肽酶的转肽反应制备γ-D-谷氨酰-L-色氨酸，并分离纯化产物γ-D-谷氨酰-L-色氨酸。
2、根据权利要求1所述的合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，其特征在于所述的γ-谷氨酰转肽酶为纯化过的γ-谷氨酰转肽酶，其制备方法为：
a、常规方法培养Bacillus subtillis NX-2，发酵产γ-谷氨酰转肽酶；
b、利用蛋白质分离纯化系统KTATM explorer 100制备纯的γ-谷氨酰转肽酶。
3、根据权利要求1所述的合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，其特征在于底物L-色氨酸的起始浓度为12～50mmol/L，γ-D-谷氨酰胺起始浓度为10～35mmol/L。
4、根据权利要求3所述的合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，其特征在于底物L-色氨酸与γ-D-谷氨酰胺的起始浓度比为5∶2～4。
5、根据权利要求1所述的合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，其特征在于利用γ-谷氨酰转肽酶反应制备γ-D-谷氨酰-L-色氨酸时，反应时间为3～8小时，反应pH为9.0～10.5，酶量为0.001-0.5U/mL，反应温度为35～45℃。
6、根据权利要求1所述的合成γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的方法，其特征在于产物γ-D-谷氨酰-L-色氨酸的分离纯化方法为：
用KTATM explorer 100蛋白纯化仪进行分离纯化，分离纯化条件为：色谱柱为反相C18柱，检测波长为214nm，流动相为A：0.1％甲酸，B：乙腈，梯度洗脱5％～40％B；流速：4～8mL/min。
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