CN106977583A

CN106977583A - 一种寡肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN106977583A
Application number: CN201710210253.5A
Authority: CN
Inventors: 崔春; 杨娟
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2017-07-25

Abstract

本发明公开了一种寡肽及其制备方法与应用。所述寡肽氨基酸序列为γ‑Glu‑γ‑Glu‑Arg，具有安全性高、无毒副作用，对勃起困难、早泄具有较好的改善作用。具体制备步骤为：将谷氨酰胺与精氨酸混合后溶于水中，添加溶液质量0.001‑0.4%（w/w）的谷氨酰胺酶或γ‑谷氨酰胺转肽酶，用10 mol/l的氢氧化钠溶液调节溶液的pH至7.0‑10.0，在25‑50℃反应3‑12小时，后用4 mol/L 盐酸回调pH 至 7~8之间，90℃灭酶10 min。

Description

一种寡肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及具有生理活性的肽及其制备方法，具体涉及具有壮阳效果的γ-谷氨酰肽混合物及其制备方法。

背景技术

勃起功能障碍(ED)又称阳痿。一般指在多数情况下阴茎不能勃起，或虽能勃起但不能维持勃起并进行性交，是临床上最常见的男子性功能障碍，其不仅发病率高，严重影响男性健康，而且有向年轻化发展的趋势。特别是在现代生活中，人们的生活节奏快，精神压力大，暴饮暴食，偏食酗酒等，都极易造成男性性功能障碍，出现阳痿症状。据统计40～70岁男子中有52％患有不同程度的ED。其治疗可分为非侵入性和侵入性治疗两类，非侵入性治疗系指心理治疗、药物治疗和真空负压勃起治疗。侵入性治疗包括尿道给药、海绵体活性药物注射、阴茎假体植入和血管性阳痿的手术治疗。侵入性治疗带有一定的创伤性，并发症多，患者不易接受；药物治疗目前主要是以西药为主，多为磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂：如西地那非(伟哥，辉瑞公司)、伐地那非(艾力达，拜耳公司)等虽然疗效肯定，但价格昂贵，一般患者难以承受，并可引起如头痛、低血压、心血管不良反应等令人不能接受的副作用。

广州善康生物科技有限公司公开了一种迅速、安全、持久壮阳的补肾壮阳药物(201510035437.3)。为了解决上述问题，该发明所提供的技术方案是：一种补肾壮阳的药物，所述药物的组分为鳄鱼鞭干粉、覆盆子牡蛎、枸杞子，所述各组分的重量百分比为：鳄鱼鞭干粉1％～50％、覆盆子1％～40％、牡蛎1％～30％、枸杞子1％～18％。发明人认为这一发明的有益效果在于：采用鳄鱼鞭粉为主要原料，配以覆盆子、牡蛎、枸杞子，可以实现迅速、安全、持久壮阳。山西金源酒业有限公司提供了一种治疗范围广、易吸收、无毒副作用的治疗阳痿、早泄、遗精、滑精等性功能衰退的壮阳药酒(201010573974.0)。其由下列原料制成:65°原浆酒、锁阳、冬虫夏草、人参、川穹、当归、红花、紫草,蜂蜜,将上述中药药材洗净晾干,用65°原浆酒浸泡,将酒滤出,加入蒸馏水调配成所需要的酒精度,然后加入蜂蜜调味制成。发明人认为这一发明活血化瘀、排毒利尿及滋补保健壮阳、健脾益气、涩精固脱、抗衰益寿的功能，总有效率达87％。青岛联合创新技术服务平台有限公司提供了一种滋阴壮阳的药酒(申请号201310265827.0)，由以下组分按照重量份数组成：鹿茸20-30份、肉苁蓉20-30份、山药20-30份、仙茅15-18份、熟地黄10-15份、白芍10-15份、当归10-15份、百合5-8份、桑葚5-8份、银耳5-8份、女贞子5-8份、黄精20-30份、饴糖60-80份，高粱酒2-4斤。发明人认为这一发明所提供药酒，组方配伍科学，具有滋阴壮阳，壮肾阳，益精血，有效防治男性阴亏阳虚、阳痿、早泄，女性月经不调，性冷淡等症状。黑龙江江恒医药科技有限公司公开了一种壮阳春胶囊及其制备方法(申请号201410731929.1)，其特征在于取甘松150g,肉苁蓉300g，锁阳200g，菟丝子300g，车前子300g，制何首乌200g,采用二氧化碳超临界萃取法提取，减压干燥，用高能纳米冲击磨粉碎成纳米干膏，加入功能性辅料，制成壮阳春胶囊，崩解时间显著缩短，疗效显著优于市售壮阳春胶囊，取得了积极效果。

目前尚未见具有壮阳效果的肽类物质的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶合成具有壮阳效果的γ-谷氨酰肽的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种寡肽，其氨基酸序列为γ-Glu-γ-Glu-Arg。

所述一种寡肽在制备食品或药品中的应用，具体是在食品或药品中添加占食品或药品的总重量60mg/kg以上的所述寡肽。

所述一种寡肽在制备食品或药品中的应用，具体是在在食品或药品中添加占食品或药品的总重量500mg/kg以上的所述寡肽。

制备所述一种寡肽的方法，具体是：L-谷氨酰胺与精氨酸，摩尔比为1-2:1，溶于水中得溶液，调节反应pH为7.0-10.0，添加谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶0.02-1％(w/w)，在25-50℃反应3-12小时，后用4mol/L盐酸回调pH至7～8之间，90℃灭酶10min，对酶促反应产物进行浓缩，冷冻干燥，得到寡肽含γ-Glu-γ-Glu-Arg反应液。采用XSelect HSS T3 5μm 4.6x 250mm分析柱，流动相A液为0.1％(V/V)甲酸-水溶液；流动相B液为0.1％(V/V)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1mL/min，反应液的进样量10μL，对反应液进行梯度洗脱，第3个峰即为寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg。

上述制备方法中，所述溶液中L-谷氨酰胺和L-精氨酸的浓度为400-1200mmol/L。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1)本发明首次公开了寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg对勃起困难、早泄具有较好的改善作用。

2)首次公开了利用谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶催化制备寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg。

附图说明

图1为γ-Glu-γ-Glu-Arg的二级质谱图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体是实施作进一步举例，但本发明的实施和保护不限于此。

实施例1

将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SWJS22(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8425)以1％的接种量接种于发酵培养基(发酵培养基的组成为：4％豆粕、2％麸皮、2％玉米粉，92％水)中，37～39℃发酵培养30h。将发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤得上清液，即谷氨酰胺酶粗酶液。

将400mM谷氨酰胺与400mM精氨酸溶于100g水中，调节溶液的pH值至10.0，加入1g谷氨酰胺酶粗酶液，在25℃分别反应12h，后用4mol/L盐酸回调pH至7.0后，90℃灭酶10min，对酶促反应产物进行浓缩，冷冻干燥，得到含寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg反应液。采用XSelectHSS T3 5μm 4.6x 250mm分析柱，流动相A液为0.1％(V/V)甲酸-水溶液；流动相B液为0.1％(V/V)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1mL/min，反应液的进样量10μL，对反应液进行梯度洗脱，第3个峰即为寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg。

UPLC-MS/MS对反应产物进行定性分析：包括：An Agilent 1290series UPLCsystem(Agilent Technologies)用于分离各γ-Glu-peptides,带有an elec-trosprayionization(ESI)的质谱系统(Q-TOF MS/MS，Bruker Daltonics)进行定性分析。色谱柱为：Agilent ZORBAX RRHD SB-C18(2.1x 50mm,1.8μm)。进样量为5μL。液相条件为：溶液A为0.1％甲酸-水溶液，和溶液B为0.1％甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱程序为：0–10％B,0-5.0min；10-15％B,5.0-10.0min；然后100％B,10.0-12.0min。MS条件：Ionization(离子化)：正离子模式；Drying gas(干燥气体)：350℃下10L/min；Nebulizer(喷雾器压力)：25psig；Fragmentor(毛细管电压)：30V。对第3个峰进行UPLC-MS/MS测定，其检测结果如图1。由图1可鉴定出寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg。

实施例2

一、毒性实验

本实验采用健康SD大鼠，口服给药实施例1制备的寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg剂量梯度为10mg/kg以及30mg/kg，连续给药30天，经观察大鼠给药期间及停药后1周之内动物生长状态、活动饮食、血液学、血液生化学、脏器组织结构以及尿常规等均无明显影响，表明临床用药安全可靠。

二、小鼠交尾试验

小鼠交尾试验。取昆明小鼠每组25只，其中雄性5只，雌鼠20只。每组分5个鼠笼饲养。每只雄鼠与4只雌鼠同笼饲养。随即分为空白组(蒸馏水)、寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg(10mg/kg，按占小鼠体重计)和精氨酸组。每组灌胃给药雄鼠，每日早上、下午分别给药一次，连续10日。每天上午检查雌鼠有无阴栓出现。如下表1所示。

表1

组别	雌鼠数	发现阴栓数	阴栓出现率
				γ‐谷氨酰肽	20	17	85％
精氨酸	20	11	55％
				空白	20	8	40％

从上表中可以看出，寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg组能明显促进雄性小鼠交尾。

三、小鼠血浆睾酮实验：

取ICR系清洁级昆明雄性小鼠45只，随机分为空白组(蒸馏水)、本发明寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg，每组15只，每组灌胃给药，每日分别上午、下午给药一次，连续10天后，将小鼠摘眼球取血，检测血浆睾酮含量，如下表2所示：

表2

组别	雄鼠数	睾酮(ng/L)
			γ-Glu-γ-Glu-Arg	15	9.86±2.67
精氨酸	15	7.49±4.75
			空白	15	6.15±3.41

从上表中可以看出，本发明寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg可明显增加雄性小鼠血浆睾酮的含量，促进雄性小鼠交尾，提高雄性小鼠性功能。

实施例3

选用门诊病人77例ED患者采用随机分组，其中治疗组38例，对照组39例；两组患者年龄、病程、勃起功能积分和病情轻重等方面比较均无显著差异，具有可比性。诊断标准参照国际ED诊断原则，即男子在性刺激下，不断持续的达到或维持足够硬度的阴茎勃起以完成满意性交，且病程在3个月以上，国际勃起功能评分问卷(IIEF-5)≤21分，诊断为ED。

排除标准(1)合并糖尿病者；(2)合并有严重的心、肝、肾、造血系统等疾病者；(3)前列腺明显增生者或前列特异性抗原(PSA)＞4ug/ml者；(4)精神病患者；(5)近期服用过其它相关药物者；(6)未按规定用药或资料不全，不能坚持正常治疗者。

治疗方法：

治疗组服用实施例1制备的寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg，口服每次1g，均一日两次，分二次服用。对照组1服用六味地黄丸，8粒/次，1日3次；对照组2服用精氨酸，口服每次1g，均一日两次，分二次服用。三组均治疗8周。治疗前、治疗4周、治疗8周分别观察勃起功能国际问卷(IIEF-5)积分改变，包括阴茎勃起信心、成功插入次数，勃起硬度、维持勃起能力和性交满意度5个问题。

疗效标准临床控制：治疗后性交机会达75％以上成功，或勃起功能积分≥21分；显效：治疗后性交机会达50％以上成功，或勃起功能积分较前增加7-14分；有效：治疗后性交机会达25％以上成功，或勃起功能积分较前增加≤7分；无效：治疗后性交机会成功率无变化，或勃起功能积分无增加。

治疗结果

两组均治疗8周后统计疗效。两组疗效比较见表3。

表3

组别	例数	显效	有效	无效	总有效率
						γ-Glu-γ-Glu-Arg	52	31	16	5	90.38％
精氨酸	52	14	14	24	53.8％
						六味地黄丸	52	22	14	16	69.2％

由表3可见，γ-谷氨酰肽与精氨酸和六味地黄丸相比，总有效率明显优于精氨酸和六味地黄丸。

Claims

1.一种寡肽，其特征在于氨基酸序列为γ-Glu-γ-Glu-Arg。

2.权利要求1所述一种寡肽在制备食品或药品中的应用，其特征在于在食品或药品中添加占食品或药品的总重量60mg/kg以上的所述寡肽。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于在食品或药品中添加占食品或药品的总重量500mg/kg以上的所述寡肽。

4.制备权利要求1所述一种寡肽的方法，其特征在于：L-谷氨酰胺与精氨酸，摩尔比为1-2:1，溶于水中得溶液，调节反应pH为7.0-10.0，添加谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶0.02-1%（w/w），在25-50℃反应3-12小时，后用4 mol/L 盐酸回调pH至7~8之间，90℃灭酶10min，对酶促反应产物进行浓缩，冷冻干燥，得到含寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg的反应液。

5.制备权利要求1所述一种寡肽的方法，其特征在于：采用XSelect HSS T3 5μm 4.6x250mm分析柱，流动相A 液为0.1％（V/V）甲酸-水溶液；流动相B 液为0.1％(V/V) 甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1 mL/min，反应液的进样量 10 μL，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，第3个峰即为寡肽γ-Glu-γ-Glu-Arg。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述溶液中L-谷氨酰胺和L-精氨酸的浓度为400-1200mmol/L。