CN107007826B - 板蓝根活性蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种板蓝根活性蛋白，该板蓝根活性蛋白中含有胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂和α‑胰凝乳蛋白酶抑制剂。实验结果表明，本发明提供的板蓝根活性蛋白具有明显的抗多种原因所致胰腺炎的作用；并且采用MTT法和荷瘤小鼠研究板蓝根活性蛋白对不同肿瘤的抑制作用，研究结果表明本发明板蓝根活性蛋白具有显著的抗肿瘤活性和提高免疫力功效，具有开发治疗胰腺炎和抗肿瘤药物的前景。

Description

板蓝根活性蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种板蓝根活性蛋白药物制剂，具体涉及一种具有治疗胰腺炎及抗肿瘤的板蓝根活性蛋白及其制备方法，属医药技术领域。

背景技术

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一个常见的外科急腹症，轻型易于治疗，重型病情凶险，病死率高，是目前外科急腹症中最棘手的疾病之一。慢性胰腺炎是由于各种原因造成的胰腺组织结构和功能慢性进行性损害。在慢性胰腺炎的发生发展过程中，早期主要症状为疼痛，晚期则疼痛症状减轻，代之以胰腺外分泌功能不全所引起的进行性消化不良和营养不良，严重影响到病人的生活质量和疾病预后。目前，对于慢性胰腺炎的治疗方法包括一般治疗、胰酶替代治疗和外科治疗(包括减压术、切除术和神经阻断术)。胰腺炎发病急、并发症多、病死率高，其治疗主要药物为抑酶制剂及抗生素，目前从天然药物中发现的一些生物活性物质对胰腺炎具有较好的治疗作用，具有广泛的开发前景。

恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的多发病和常见病，早在2000～3000年前埃及和我国已有关于肿瘤的记载。包括中国在内的很多国家，尤其是中等发达国家，恶性肿瘤所致死亡在所有死亡原因中占首位或第二位，且发病率在世界范围内仍呈上升趋势。因此，肿瘤的治疗是当前科学界研究的一大难点，低毒、高效的抗肿瘤药物的研发是目前医药界的重中之重的任务。

板蓝根味苦，性寒，归心、肝、胃经。有清热解毒，凉血利咽之功效，用于温毒发斑、舌绛紫暗、痄腮、烂喉丹痧、大头瘟疫、丹毒、痈肿等症。板蓝根中的大分子物质蛋白，近年来由于具有独特的药理活性受到研究者的广泛关注。前期研究表明板蓝根活性蛋白中含有胰蛋白酶抑制剂且具有较好的抗肿瘤活性。本课题组首次发现板蓝根活性蛋白具有较好的治疗胰腺炎及抗肿瘤活性。因此板蓝根活性蛋白的制备工艺及其在治疗胰腺炎及抗肿瘤方面的应用具有原创性，亟需知识产权保护。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了提供一种板蓝根活性蛋白制备方法及其在治疗胰腺炎和抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：

一种板蓝根活性蛋白，其中板蓝根活性蛋白重量百分含量为50％～100％，板蓝根活性蛋白中含有胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂和α-胰凝乳蛋白酶抑制剂。

以上所述的板蓝根活性蛋白，它是通过以下方法制备得到的：

以菘蓝属植物的板蓝根或爵床科植物马蓝的干燥根或根茎为原料，采用pH值为2～12，浓度为10～150mM的Tris-HCl为溶剂超声提取，得提取液，提取液在冰浴的环境中，缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵的质量浓度为10％～80％，然后低温冷藏，离心，收集沉淀，得板蓝根粗蛋白；

将板蓝根粗蛋白用去离子水溶解后装入分子截留量为1000Da的透析袋中透析除去残留的硫酸铵盐和小分子化合物，经冷冻干燥，得板蓝根活性蛋白。

本发明的板蓝根活性蛋白在制备治疗胰腺炎药物中的应用。

本发明所述的板蓝根活性蛋白在制备治疗胰腺炎药物中的应用，所述的胰腺炎为急性或慢性胰腺炎。

本发明所述的板蓝根活性蛋白在制备治疗胰腺炎药物中的应用，将板蓝根活性蛋白和药学上可接受的载体制备成胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、注射剂或微囊剂的药物。

本发明所述的板蓝根活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述的板蓝根活性蛋白在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，将板蓝根活性蛋白和药学上可接受的载体制备成胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、注射剂或微囊剂的药物。

本发明所述的板蓝根活性蛋白，板蓝根活性蛋白含量为50％～100％，板蓝根活性蛋白中含有胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂和α-胰凝乳蛋白酶抑制剂。其中胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂和α-胰凝乳蛋白酶抑制剂重量比值范围为30～100:10～50:10～90,优选为三者的重量比值为3:1:5。板蓝根蛋白的氨基酸组成主要含人体必需氨基酸：异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、组氨酸；非必需氨基酸：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸。

本发明所述的板蓝根活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：

以菘蓝属植物的板蓝根或爵床科植物马蓝的干燥根或根茎为原料，采用pH值为2～12，浓度为10～150mM的Tris-HCl为溶剂提取，得提取液，提取液在冰浴的环境中，缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵的质量浓度为10％～80％，低温冷藏，离心，收集沉淀得板蓝根粗蛋白；

取粗蛋白用去离子水溶解后装入分子截留量为1000Da的透析袋中透析除去残留的硫酸铵盐和小分子化合物，经冷冻干燥，得板蓝根活性蛋白。

作为优选方案，以上所述的板蓝根活性蛋白的制备方法，提取方法为超声提取，超声功率为100～1000W，提取溶剂和原料比为5～100，提取1～3次，每次提取时间为5～120min。

本发明采用雨蛙素联合脂多糖致小鼠急性胰腺炎及高浓度胆盐胰管内注射的出血坏死性胰腺炎模型研究板蓝根活性蛋白治疗胰腺炎的作用。实验结果表明，板蓝根活性蛋白具有显著的治疗胰腺炎的作用。

有益效果：本发明具有以下优点：

本发明通过大量实验筛选，采用优选的方法制备得到板蓝根活性蛋白，实验结果表明，本发明制备得到的板蓝根活性蛋白具有很好的治疗胰腺炎的作用；并且本发明制备得到的板蓝根活性蛋白，经检测具有良好的体内外抗肿瘤活性。小鼠及人肿瘤细胞株给药剂量在0.1-100g/mL范围内可抑制多种肿瘤细胞的生长；小鼠给药剂量在1-1000mg/kg范围内可抑制动物体内移植肿瘤的生长，同时可以显著改善荷瘤小鼠体征性状及免疫功能。

本发明单独或与其它抗肿瘤药物联合使用均有抗肿瘤作用，用于各种癌症的治疗和辅助治疗，如肝癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌、结肠癌、白血病等。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品或原料。

实施例1：板蓝根活性蛋白含量测定

蛋白含量测定标准曲线的建立：标分别精密量取不同体积的100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)标准溶液，置于6只10mL试管中，分别加入蒸馏水至1.0mL，再分别加入5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，一段时间后设定波长为595nm测定每组的吸光值。以蛋白浓度为横坐标，以每组测定的吸光度值为纵坐标，绘制含量测定的标准曲线。

根据浓度和吸光度绘制的标准曲线为y＝0.0091x+0.0305，R²＝0.9985(x为蛋白质含量，单位为μg/mL；y为样品的吸光度值)。

准备3份板蓝根样品，其中1号样品为菘蓝根，产地为安徽；2号样品为菘蓝根，产地为内蒙古；3号样品为马蓝根，产地为广州；每种样品平行称取药材粉末(过20目筛)3份，加入50mM Tris-HCl溶液超声提取2次，液料比为60：1，每次提取65min，合并提取液，3000rpm离心5min，取上清液在冰浴环境中，缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为60％，放入4℃冰箱24h，离心，收集沉淀得板蓝根粗蛋白。粗蛋白再用去离子水溶解后装入分子截留量为1000Da的透析袋中，4℃透析除去残留的硫酸铵盐和其它小分子化合物，经冷冻干燥，得板蓝根活性蛋白粉末，称取提纯后的板蓝根活性蛋白适量，加入蒸馏水溶解，测定板蓝根活性蛋白浓度，计算不同样品板蓝根活性蛋白的百分含量(表1)。

表1不同样品板蓝根活性蛋白的百分含量

实施例2：板蓝根活性蛋白氨基酸含量测定

取实施例3号样品的板蓝根蛋白样品5mg，加人5mL的6N的盐酸在110℃在密封管中酸水解24h。因为在酸水解过程中色氨酸容易破坏故选择碱水解的方法测定色氨酸，样品用5mol/LNaOH煮沸20h后水解结束，12000g离心10min取上清液过0.22μm微孔滤膜进样分析，水解后的蛋白进行氨基酸测定，计算含量。

板蓝根蛋白中氨基酸组成见表2。板蓝根蛋白中的天冬氨酸和天冬酰胺的总含量高达9.78g/100g。板蓝根蛋白中所含的必需氨基酸的总含量为33.79g/100g，达到联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)的推荐量(32.8g/100g)。异亮氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸的量也满足FAO/WHO的推荐用量的要求。必需氨基酸(Essential amino acids)和总氨基酸(Total amino acids)的比值(E/T)为46.77％，表明板蓝根蛋白具有较好的营养价值。

表2板蓝根蛋白的氨基酸组成及联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)推荐用量

实施例3：板蓝根活性蛋白对不同蛋白酶的抑制作用

空白反应：在每管中加入去离子水2.0mL，置于37℃中预热，然后立即加入N-苯甲酞-L-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐(BAPNA)5.0mL，仍置于恒温37℃水浴锅中反应10min，加入1.0mL乙酸(30％)终止反应，迅速加入2.0mL胰蛋白酶溶液，充分混匀后，离心。

酶催化反应：操作步骤与空白反应类似，先加2.0mL胰蛋白酶后加N-苯甲酞-L-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐溶液，最后用30％的乙酸终止反应。

在酶反应试管中，加入实施例1中3号样品的板蓝根活性蛋白溶液1.0mL(100μg/mL)，加去离子水至2.0mL，同时进行空白试验，每次都以相对应的空白做对照。

在空白试管中，加入实施例1中3号样品的板蓝根活性蛋白溶液1.0mL(100μg/mL)，加去离子水至2mL，同时进行空白试验。

酶抑制率的计算公式如下：

抑制率(％)＝(A_标准-A_样品)/A_标准

式中：A_标准表示没有加抑制酶所测得的吸光度值；A_样品表示加抑制酶后测定的吸光度值。

按上述方法，分别测定板蓝根活性蛋白对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶四种蛋白酶的抑制活性。

在四种蛋白酶-BAPNA体系中加入等量的板蓝根活性蛋白，观察其抑制活性。如表3所示，结果表明本发明制备得到的板蓝根活性蛋白对胃蛋白酶的抑制活性最好抑制率达到45.45％，对胰蛋白酶的抑制率为22.45％，对α-胰凝乳蛋白酶的抑制率为16.67％，对木瓜蛋白酶基本无活性。表明板蓝根活性蛋白板蓝根活性蛋白中含有胃蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶的抑制剂和α-胰凝乳蛋白酶抑制剂。

表3板蓝根活性蛋白对不同蛋白酶的抑制率

注：“―”表示无抑制活性

实施例4：板蓝根活性蛋白对雨蛙素联合脂多糖致急性胰腺炎小鼠模型影响

本实验采用雨蛙素联合脂多糖(LPS)建立急性胰腺炎小鼠模型。实验小鼠制模前禁食12h，不禁水。小鼠雌雄各半，按完全随机方法分组，每组10只。以100μg/kg的雨蛙素，连续6次，每次间隔1h，末次注射LPS(10mg/kg)制备急性胰腺炎小鼠模型。分组为正常组、模型组、阳性药物组(乌司他丁)、实施例1中3号马蓝根制备得到的板蓝根活性蛋白低(25mg/kg)、中(50mg/kg)、高(100mg/kg)三个剂量组。待建模成功后，立即进行腹腔注射给板蓝根活性蛋白溶液。造模20h后，采用小鼠眼球静脉丛取血，常温放置1h，3000r/min，4℃离心，取上清适量，用于测定血清淀粉酶含量；采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖组织，获取胰腺并计算胰腺指数，并测定胰组织中脂肪酶和蛋白酶的含量。

胰腺指数＝胰腺湿重(mg)/小鼠体重(g)

表4板蓝根活性蛋白对急性胰腺炎模型小鼠胰腺指数及酶活性的影响

注：*表示与模型组比较p＜0.05；**表示与模型组比较p＜0.01；#表示与正常组比较p＜0.05；##表示与正常组比较p＜0.01。

如表4所示，采用雨蛙素联合脂多糖致急性胰腺炎小鼠模型是成功的，与正常组比较胰腺指数、血清淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶的含量均显著增加(p＜0.01)。本发明提供的板蓝根活性蛋白不同剂量对胰腺炎小鼠均有一定的治疗作用，高剂量组(100mg/kg)的板蓝根活性蛋白的治疗作用与阳性药乌司他丁的作用相当。研究结果表明本发明制备得到的板蓝根活性蛋白具有较好的治疗胰腺炎的作用。

实施例5：板蓝根活性蛋白对不同癌细胞的抑制作用

取对数生长期不同癌细胞：人肝癌HepG2、SMMC-7721细胞，人非小细胞肺癌A549细胞，人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞、人胰腺癌PANC-1细胞、人前列腺癌DU145细胞。用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，用细胞培养液调整细胞密度为1×10⁵个/mL，接种于96孔板中，设给药组、阴性对照组。其中为防止边缘效应，96孔板的四周36个孔不接种细胞，加PBS作空白组；另外给药组(实施例1中3号马蓝根制备得到的板蓝根活性蛋白)每个浓度设5个复孔，其余设为阴性对照组。每孔均加入100μL。置37℃、5％CO₂的饱和湿度培养箱中培养。

孵育24h后，吸弃上清，给药组每孔加入100μL不同浓度的板蓝根活性蛋白供试品溶液，配制成7个浓度梯度，阴性对照组加入等体积培养液，置于37℃、5％CO₂的饱和湿度培养箱中培养。

48h后，每孔加入MTT溶液20μL，继续培养4h，轻轻吸弃上清，每孔加DMSO150μL，水平摇床混匀，酶标仪于490nm波长处测定吸光度(A)。按下式计算板蓝根活性蛋白对癌细胞的抑制率(IR)。根据不同浓度的抑制率计算半数抑制浓度(IC₅₀)

IR％＝(1-A_{给药组均值}/A_{阴性对照组均值})×100％。

表5板蓝根活性蛋白对不同癌细胞的抑制作用

如表5所示，本发明提供的板蓝根活性蛋白对不同肿瘤细胞均有一定的抑制作用，其中对人肝癌SMMC-7721细胞、人胰腺癌PANC-1细胞具有明显的抑制作用，IC₅₀分别为56.74μg/mL和85.14μg/mL。

实施例6：板蓝根活性蛋白对H22肝癌荷瘤小鼠抑瘤作用研究

将体重20g左右的清洁级昆明小鼠正常条件下饲养7d，称重后，无菌抽取接种7d的小鼠肝癌H₂₂肿瘤细胞株(第三代)，在无菌条件下抽取瘤液，用生理盐水按1：3的比例稀释后混合均匀(细胞数约为1×10⁷个/mL)。然后用1mL注射器按0.2mL/只接种于被试动物右前肢内侧皮下，制作成实体瘤动物模型。观察7天，检验模型成功与否。

取造模成功小鼠进行随机分组，分为4个组，每组10只。分别为荷瘤对照组、阳性对照组5-Fu(15mg/kg)和实施例1中3号马蓝根制备得到的板蓝根活性蛋白高剂量组(100mg/kg)、低剂量组(50mg/kg)。

各给药组按照给药剂量连续灌胃7天，最后一次给药1h后颈部脱臼处死小鼠，解剖小鼠，剥离肿瘤，分别解剖获得肝、肾、脾脏和胸腺并称重计算各脏器指数。通过解剖取出右侧前肢皮下的肿瘤，观察肿瘤形态并称重。肿瘤增长抑制率公式：

抑瘤率(％)＝(W₁–W₂)/W₁×100，

其中W₁为荷瘤对照组肿瘤的重量，W₂为不同给药组肿瘤的重量。脏器指数的计算公式如下：

脏器指数＝(脏器重量/解剖时动物体重)×100。

如表6所示，随着饲养时间的延长，各组小鼠移植瘤体积逐渐增大，且各组之间具有显著性差异，荷瘤对照组小鼠H22肝癌移植瘤体积增长速度最快，给药组小鼠H22肝癌移植瘤体积增长速度较慢，连续给药7天后，荷瘤对照组小鼠H22肝癌移植瘤瘤重为0.66±0.19g，而五氟尿嘧啶组小鼠H22肝癌移植瘤瘤重为0.36±0.06g，抑瘤率为44.73％，具有显著性差异(P<0.01)；本发明提供的板蓝根活性蛋白高剂量组的H22肝癌移植瘤瘤重为0.35±0.07g，抑瘤率为47.27％，与15mg/kg的阳性药五氟尿嘧啶的抑瘤率相当；板蓝根活性蛋白低剂量组的H22肝癌移植瘤瘤重为0.45±0.09g，抑瘤率为32.47％，说明板蓝根活性蛋白具有较好的抑制H22肝癌移植瘤的作用，且具有一定的量效关系。

表6各组小鼠H22肝癌移植瘤瘤重及抑瘤率(n＝10)

注：a-c表示不同的组别之间具有显著性差异(p<0.01)。

如表7所示与荷瘤对照组比较，5-Fu组和板蓝根活性蛋白组的肝指数较大，有一定的显著性差异(p<0.05)，说明经过药物干预后荷瘤小鼠的肝损害性相对降低。说明设定的药物浓度对肾脏无显著的毒性。与荷瘤对照组比较5-Fu组的脾、胸腺指数显著降低，说明5-Fu在杀死癌细胞的同时也会对免疫器官造成的损害，而板蓝根活性蛋白高剂量组能显著提高脾指数，高、低剂量的板蓝根活性蛋白也能够显著的提高胸腺指数(p<0.05)，说明板蓝根活性蛋白能提高H22肝癌移植瘤小鼠的免疫器官的指数，进而增强免疫力而发挥抗肿瘤的活性。

表7板蓝根活性蛋白对H22肿瘤移植小鼠脏器指数的影响(n＝10)

注：a-c表示不同的组别之间具有显著性差异(p<0.05)。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.板蓝根活性蛋白在制备治疗胰腺炎药物中的应用；所述的板蓝根活性蛋白是通过以下方法制备得到的：

以菘蓝属植物的板蓝根或爵床科植物马蓝的干燥根或根茎为原料，采用pH 值为2~12，浓度为10~150 mM 的Tris-HCl为溶剂超声提取，得提取液，提取液在冰浴的环境中，缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵的质量浓度为10%~80%，然后低温冷藏，离心，收集沉淀，得板蓝根粗蛋白；

将板蓝根粗蛋白用去离子水溶解后装入分子截留量为 1000Da 的透析袋中透析除去残留的硫酸铵盐和小分子化合物，经冷冻干燥，得板蓝根活性蛋白。

2.根据权利要求1所述的板蓝根活性蛋白在制备治疗胰腺炎药物中的应用，其特征在于，所述的胰腺炎为急性或慢性胰腺炎。

3.根据权利要求1所述的板蓝根活性蛋白在制备治疗胰腺炎药物中的应用，其特征在于，将板蓝根活性蛋白和药学上可接受的载体制备成胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、注射剂或微囊剂的药物。

4.板蓝根活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用；所述的肿瘤为非小细胞肺癌、人乳腺癌、人胰腺癌或人前列腺癌；所述的板蓝根活性蛋白是通过以下方法制备得到的：

以菘蓝属植物的板蓝根或爵床科植物马蓝的干燥根或根茎为原料，采用pH 值为2~12，浓度为10~150 mM 的Tris-HCl为溶剂超声提取，得提取液，提取液在冰浴的环境中，缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵的质量浓度为10%~80%，然后低温冷藏，离心，收集沉淀，得板蓝根粗蛋白；

将板蓝根粗蛋白用去离子水溶解后装入分子截留量为 1000Da 的透析袋中透析除去残留的硫酸铵盐和小分子化合物，经冷冻干燥，得板蓝根活性蛋白。

5.根据权利要求4所述的板蓝根活性蛋白在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，将板蓝根活性蛋白和药学上可接受的载体制备成胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、注射剂或微囊剂的药物。