CN109718273B - 紫苏叶提取物在预防或治疗骨性关节炎中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了紫苏叶提取物在制备治疗和/或预防骨性关节炎产品中的应用。本发明所述的紫苏叶提取物对骨性关节炎模型小鼠的体重下降和脏器指数改变具有逆转作用；可改善骨性关节炎引起的血清炎症因子和基质金属蛋白酶表达水平改变；可改善骨性关节炎小鼠膝骨关节损伤及病理性改变。

Description

紫苏叶提取物在预防或治疗骨性关节炎中的应用

技术领域

本发明涉及一类紫苏叶提取物及其药物组合物用于预防和/或治疗骨性关节炎药物或食物中的应用，属于医药或食品技术领域。

背景技术

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是破坏滑膜关节并导致疼痛和畸形的非特异性炎症性疾病，已成为全球十大致残性疾病之一。在我国60岁以上人群中中晚期OA的患病率男性为7.5％、女性则高达14.7％，导致关节疼痛甚至自主行动能力下降，严重影响患者的生活质量及身心健康。当前，OA的临床药物治疗主要包括镇痛药和非甾体类抗炎药等。然而，这些药物的治疗时间窗集中在病情中晚期，难以精准阻止OA病情进展，甚至疗效不佳。此外，基于“软骨降解-炎性因子分泌的双向调控”理论，针对炎性因子如TNF-α和IL-1β等的抗体类生物制剂将治疗时间窗前移，临床上取得了较好的疗效，但是，作为拮抗免疫级联下游炎性因子等效应分子，长期应用易导致过度的免疫抑制和致命的机会性感染等危险。因此寻找治疗的其他途径显得尤为重要和紧迫。

紫苏Perillafrutescens L.是唇形科紫苏属一年生草本植物，为临床常用中药，味辛，性温，具有解表散行气和胃等功效，用于风寒感冒，咳嗽呕恶，妊娠呕吐，鱼蟹中毒。紫苏叶含有的挥发油，黄酮，酚酸等活性成分，具有良好的抗炎、抗氧化、抗过敏、止血、降血脂等药理活性。目前尚未见关于紫苏叶提取物及其治疗骨性关节炎的相关研究报道，为有效阐释传统中药治疗骨性关节炎的作用，并为寻找活性更好的治疗药物提供理论依据和实践经验，我们制备了紫苏叶提取物，并对其抗骨性关节炎的疗效进行了评价。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明解决的技术问题是提供紫苏叶提取物在治疗骨性关节炎中的应用。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明技术方案是提供了一种紫苏叶提取物在制备治疗和/或预防骨性关节炎相关产品中的应用，其特征在于，紫苏叶提取物的制备步骤如下：

1)以紫苏叶药材为原料，水或C₁～C₅低级醇水溶液为溶剂进行提取，回收含水低级醇溶剂，回收后的溶液浓缩，制得浸膏；

2)将浸膏加水分散，加入低极性有机溶剂萃取，剩余水溶液浓缩得到得浸膏；

3)所得浸膏以C₁～C₅低级醇水溶液醇沉，过滤，沉淀物干燥、粉碎得到紫苏叶提取物。

在上述制备方法的步骤1)中，提取溶剂为水或C₁～C₅低级醇水溶液，优选C₁～C₃低级醇水溶液，进一步优选为乙醇水溶液；C₁～C₅低级醇水溶液的低级醇浓度为0-95％(体积/体积)，优选为50-80％(体积/体积)，进一步优选为65％-75％(体积/体积)；提取方法为浸渍、渗漉、煎煮或加热回流，优选煎煮或加热回流；提取次数为1-5次，优选2-3次；浓缩为常压浓缩或减压浓缩，优选减压浓缩。

在上述制备方法的步骤2)中，萃取所用低极性有机溶剂为环己烷、石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异戊醇或它们的混合溶剂，优选乙酸乙酯或正丁醇溶剂，进一步优选为正丁醇溶剂；萃取次数为1-5次，优选2-3次。浓缩为常压浓缩或减压浓缩，优选减压浓缩。

在上述制备方法的步骤3)中，醇沉所用C₁～C₅低级醇水溶液优选C₂～C₃低级醇水溶液，进一步优选为乙醇水溶液；C₁～C₅低级醇浓度为50-90％(体积/体积)，优选为60-85％(体积/体积)，进一步优选为75％-85％(体积/体积)；醇沉时间为8-72h,优选为12-24h；干燥方法为常压干燥、真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥，优选真空干燥、冷冻干燥。

以上所述的产品包括药品或保健品。

骨性关节炎是一种骨科常见疾病。以关节腔内微量注射碘乙酸制备小鼠骨性关节炎模型，紫苏叶提取物在0.05，0.1g/kg剂量下灌胃给药。结果显示，紫苏叶提取物对模型小鼠的体重下降和脏器指数改变具有逆转作用；可改善骨性关节炎引起的炎症因子和基质金属蛋白酶表达水平改变；可改善骨性关节炎小鼠膝骨关节损伤及病理性改变。

本发明的优点在于：(1)本发明属于中药制剂，成分纯天然，毒副作用低；(2)本发明能有效预防和/或治疗骨性关节炎；(3)本品原料易得，制备工艺简单，易于规范化生产。

附图说明

图1.紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠股骨髁损伤的影响；

图2.紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠关节H-E病理检查结果的影响；

具体实施方式

以下实施例对本发明做进一步的说明。但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：紫苏叶提取物的制备

取干燥的紫苏叶1.5kg，加入70％乙醇5升，加热回流1.5小时，趁热过滤。滤渣以同样的方法再处理一次；合并两次所得滤液，减压回收乙醇，得浸膏65g。该浸膏加入300mL水搅拌制成混悬液，分别以150mL正丁醇萃取2次。剩余水部分浓缩，加入1580mL95％乙醇溶解，室温沉淀24h，减压抽滤，沉淀物以50ml水溶解，冷冻干燥、粉碎得紫苏叶提取物(22g)。

实施例2：剂型制备

胶囊：紫苏叶提取物100g，加入糊精147.5g，硬脂酸镁2.5g，充分拌均匀后，按胶囊制备法制成1000粒，填装于250mg胶囊，每粒含紫苏叶提取物100mg，其总量不低于50％。

片剂：取紫苏叶提取物100g，加入淀粉100g，糊精80g，蔗糖15g，充分搅拌混匀，制成颗粒，在60℃以下干燥，加入适量硬脂酸镁、滑石粉，混匀，压制成1000片，包糖衣或薄膜衣，即得。

颗粒剂：取紫苏叶提取物100g，加入适量蔗糖和糊精，按颗粒剂制法制成颗粒，干燥，制成1000g。

口服液：取紫苏叶药材，70％乙醇加热回流1.5小时提取2次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇；浸膏加入等量水搅拌制成混悬液，正丁醇萃取2次；水部分加入95％乙醇适量溶解，室温沉淀24h，减压抽滤，滤液以40％氢氧化钠调节PH值至7.0，搅匀，4-8℃冷藏48小时，滤过，滤液加入蔗糖300g，搅匀使溶解，再加入适量香精并调节PH值至7.0，加水制成1000ml，搅匀，静置12小时，滤过，灌装，灭菌，即得。

药理实验

实验例1：紫苏叶提取物对骨性关节炎的治疗作用

实验方法：

取雄性8周龄C57BL/6J小鼠，体重22-24g，随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(viartril-s 0.250g/kg，灌胃给药)、紫提取物组(0.05g/kg、0.1g/kg，灌胃给药)，每组20只。除空白对照组外，各组动物采用关节腔内微量注射碘乙酸100μg制备骨性关节炎模型；从造模后14天开始灌胃给药，每天1次，连续14天。于末次给药1小时后，称量体重，小鼠眶静脉采血，血液4℃静置8h，2500r离心10min，取血清分装保存于-80℃，检测TNF-α，IL-6和MMP-9；摘取小鼠胸腺和脾脏，称其湿重，并计算脏器指数；取后肢膝关节，大体观察并拍照，4％多聚甲醛固定后，10％EDTA脱钙，石蜡包埋切片，进行H-E病理染色检查。

实验结果：

(1)紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠生长情况的影响

体重是衡量患者生存质量的重要指标之一。本实验通过称量OA小鼠体重来初步观察紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠一般生长情况的影响。表1结果显示，与正常对照组比较，OA小鼠从7天起体重显著降低，而紫苏叶提取物可减少OA小鼠的体重降低，其中0.1g/kg组第28天体重与模型组比较差异显著。

表1紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠体重生长的影响(Mean±Std,n＝

3)

备注：与正常对照组比较，#p＜0.05；与模型对照组比较，*p＜0.05

(2)紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响

胸腺、脾脏脏器指数可反映动物的免疫功能状态，本实验于末次给药1小时后，摘取各组小鼠的胸腺和脾脏，称其湿重，并计算脏器指数(脏器指数＝脏器重量/当日体重×100％)。结果见表2。表2结果显示，紫苏叶提取物可降低骨性关节炎小鼠的脾指数，增加骨性关节炎小鼠的胸腺指数，其中0.1g/kg剂量与模型组比较差异具有显著性。

表2紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠脏器指数的影响(Mean±Std,n＝18-20)

备注：与正常对照组比较，#p＜0.05；与模型对照组比较，*p＜0.05

(3)紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠血清炎性因子水平的影响

OA病理生理改变是软骨合成与分解代谢失衡的结果。而这一失衡是炎性介质、炎性基质成分，经与特殊受体结合，传递信号进入细胞核，激活基质金属蛋白酶和炎性基因转录的结果。TNF-α和IL-6是机体炎症反应与免疫应答的重要调节因子，在OA的细胞因子网络中起中心作用。本实验通过ELISA法检测血清炎症因子TNF-α和IL-6来初步观察紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠炎症情况的影响。结果如表3所示。与正常对照组比较，骨性关节炎模型组小鼠炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平均有显著性升高，而紫苏叶提取物可显著减少骨性关节炎小鼠的炎症因子表达水平。结果提示，紫苏叶提取物及阳性对照药具有改善骨性关节炎引起的小鼠炎症。

表3紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠炎症因子的影响(Mean±Std,n＝6)

备注：与空白对照组比较，#p＜0.05；与模型对照组比较，*p＜0.05

(4)紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠血清基质金属蛋白酶水平的影响

基质金属蛋白酶在OA软骨降解过程中起重要作用。本实验通过ELISA法检测血清MMP-9水平来初步观察紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠软骨降解的影响。结果如表4所示。与正常对照组比较，骨性关节炎模型组小鼠基质金属蛋白酶MMP-9的表达水平均有显著性升高，而紫苏叶提取物可显著减少骨性关节炎小鼠的炎症因子及基质金属蛋白酶的表达水平。结果提示，紫苏叶提取物及阳性对照药具有改善骨性关节炎引起的小鼠软骨损伤。

表4紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠基质金属蛋白酶的影响(Mean±Std,n＝6)

备注：与正常对照组比较，#p＜0.05；与模型对照组比较，*p＜0.05

(5)紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠膝骨关节损伤的影响

OA是一种由多种原因所致的慢性退行性关节病变，以关节软骨变性、破坏及骨质增生为主要特征。本实验于末次给药1小时后，处死小鼠取膝关节进行观察：正常对照组关节面光整，色泽如常；模型组关节面糜烂，软骨缺损深达软骨深层，阳性药组关节面粗糙，软骨缺损深达软骨浅中层；提取物0.05g/kg关节面糜烂，软骨缺损深达软骨深层；提取物0.1g/kg关节面粗糙，有小的裂隙。结果见图1。

(6)紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠膝骨关节病理改变的影响

OA可进行性损伤膝骨关节腔内软骨和滑膜组织，引起组织炎性浸润和降解。本实验于末次给药1小时后，处死小鼠取膝关节行H-E病理染色和评分(0分：关节形态正常，未见损伤；1分：局部关节面软骨磨损变薄，磨损面可见软骨组织增生，局部伴或不伴轻微炎症，整个关节面未见软骨缺损；2分：关节面软骨明显损伤，局部关节面表层软骨缺损，关节面缺损部位未达骨质；关节面缺损范围＜25％；3分：关节面软骨严重损伤，局部关节面软骨完全缺损，损伤深达骨质，未见软骨下骨组织明显受损，缺损部位关节面凸凹不平；关节面缺损范围25～50％；4分：关节面软骨严重损伤，部分关节面软骨完全缺损，损伤深达骨质，软骨下骨组织明显受损，关节面凸凹不平，可伴有(或不伴)关节面塌陷，关节腔及周围软组织可见炎症反应；关节面缺损范围＞50％。病理检查结果见图2，软骨缺损比例及病理评分结果见表6。

表6紫苏叶提取物对骨性关节炎小鼠软骨缺损比例及病理评分的影响(Mean±Std,n＝4)

备注：与正常对照组比较，#p＜0.05；与模型对照组比较，*p＜0.05

综上研究结果显示，紫苏叶提取物可以改善骨性关节炎小鼠的体重降低和免疫脏器指数改变；对小鼠血清炎症因子和基质金属蛋白酶的检测表明，紫苏叶提取物可显著改善骨性关节炎小鼠血清TNF-α，IL-6和MMP-9的水平，从而减少骨性关节炎的炎症和软骨降解的发生；同时，紫苏叶提取物可显著改善骨性关节炎软骨面磨损和关节腔内各组织的损伤和炎症情况，对其发挥明显的治疗作用。而且，中药来源的紫苏叶提取物尚未发现有任何毒副作用，可见其在骨性关节炎的治疗中具有十分广阔的应用前景。

Claims (1)

1.一种紫苏叶提取物在制备治疗和/或预防骨性关节炎药品中的应用，其特征在于，所述紫苏叶提取物制备方法为如下步骤：

取干燥的紫苏叶1.5kg，加入70％乙醇5升，加热回流1.5小时，趁热过滤；滤渣以同样的方法再处理一次；合并两次所得滤液，减压回收乙醇，得浸膏65g；该浸膏加入300mL水搅拌制成混悬液，分别以150mL正丁醇萃取2次；剩余水部分浓缩，加入1580mL 95％乙醇溶解，室温沉淀24h，减压抽滤，沉淀物以50ml水溶解，冷冻干燥、粉碎得紫苏叶提取物。

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