CN112076249B - 紫苏叶提取物在制备治疗炎症性肠病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫苏叶提取物在制备治疗和/或预防炎症性肠病药物中的应用。本发明所述的紫苏叶提取物对低分子量硫酸葡聚糖钠诱导的炎症性肠病小鼠的腹泻、便血、体重下降以及结肠部位病理损伤有逆转作用;可显著抑制模型小鼠结肠组织细胞因子NO、IFN‑γ、IL‑4、IL‑10和IL‑17的分泌;显著抑制模型小鼠肠组织MPO水平。
Description
技术领域
本发明涉及一类紫苏叶提取物,其制备方法,及其制备物用于预防和/或治疗炎症性肠病药物或食物中的应用,属于医药或食品技术领域。
背景技术
炎症性肠病(IBD)是一类慢性非特异性肠道炎症,主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病,其病因和发病机制尚未阐明,一般认为IBD是由遗传、环境、微生物、免疫因子等因素的复杂的相互作用所致,是机体在外界因素,如化学物质、感染、抗原等作用下,由炎症细胞及其释放的炎症介质参与引起的一系列病理生理过程。本病以肠道炎症和黏膜组织损伤为特征,主要表现为腹泻、腹痛、体重下降及腹部包块等,其病理机制与肠道正常菌群和黏膜的免疫反应异常有着密切的关系。克罗恩病可能影响到消化道的各个部分,而溃疡性结肠炎一般局限于大肠。克罗恩病最常见的病变部位在回盲部,呈多发、节段性溃疡;溃疡性结肠炎则主要累及直肠及乙状结肠,呈连续性病变,也可累及整个结肠。当前,临床采用氨基水杨酸、糖皮质激素及免疫抑制剂治疗,而这些治疗药物常伴有溃疡病加重、高血压、血糖升高、骨质疏松、水钠潴留、血钾降低等不良反应。
紫苏(Perilla frutescens L.)是唇形科紫苏属一年生草本植物,其叶为临床常用中药,味辛,性温,具有解表散行气和胃等功效,用于风寒感冒,咳嗽呕恶,妊娠呕吐,鱼蟹中毒等治疗。紫苏叶含有的挥发油、黄酮、酚酸等活性成分,具有良好的抗炎、抗氧化、抗过敏、止血、降血脂等药理活性。目前尚未见关于紫苏叶提取物及其治疗炎症性肠病的相关研究报道。为有效阐释传统中药治疗炎症性疾病的作用,并为寻找活性更好的抗炎药物提供理论依据和实践经验,我们制备了紫苏叶有效部位,并对其抗炎症性肠病活性进行了评价。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明解决的技术问题是提供一种紫苏叶提取物在制备抗炎症性肠病药物中的应用。所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎、克隆恩病。
为解决本发明的技术问题,本发明提供如下技术方案:
本发明技术方案提供了一种紫苏叶提取物在制备抗炎症性肠病药物中的应用其特征在于,所述紫苏叶提取物制备方法为如下步骤:
1)以紫苏叶药材为原料,水或C1~C5低级醇水溶液为溶剂进行提取,回收含水低级醇溶剂,回收后的溶液浓缩,制得浸膏;
2)将浸膏加水分散,加入低极性有机溶剂萃取,剩余水溶液浓缩得到得浸膏;
3)所得浸膏以C1~C5低级醇水溶液醇沉,过滤,沉淀物干燥、粉碎得到紫苏叶提取物。
在上述制备方法的步骤1)中,
提取溶剂为水或C1~C5低级醇水溶液,优选C1~C3低级醇水溶液,进一步优选为乙醇水溶液;
C1~C5低级醇水溶液的低级醇浓度为0-95%(体积/体积),优选为50-80%(体积/体积),进一步优选为65%-75%(体积/体积);
提取方法为浸渍、渗漉、煎煮或加热回流,优选煎煮或加热回流;
提取次数为1-5次,优选2-3次;
浓缩为常压浓缩或减压浓缩,优选减压浓缩。
在上述制备方法的步骤2)中,
萃取所用低极性有机溶剂为环己烷、石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异戊醇或它们的混合溶剂,优选乙酸乙酯或正丁醇溶剂,进一步优选为正丁醇溶剂;
萃取次数为1-5次,优选2-3次。
浓缩为常压浓缩或减压浓缩,优选减压浓缩。
在上述制备方法的步骤3)中,
醇沉所用C1~C5低级醇水溶液优选C2~C3低级醇水溶液,进一步优选为乙醇水溶液;
C1~C5低级醇浓度为50-90%(体积/体积),优选为60-85%(体积/体积),进一步优选为 75%-85%(体积/体积);
醇沉时间为8-72h,优选为12-24h;
干燥方法为常压干燥、真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥,优选真空干燥、冷冻干燥。
炎症性肠病以肠道炎症和黏膜组织损伤为特征,主要表现为腹泻、腹痛、体重下降及腹部包块等,其病理机制与肠道正常菌群和黏膜的免疫反应异常有着密切的关系。以低分子量硫酸葡聚糖钠诱导小鼠的炎症性肠病模型。紫苏叶提取物在剂量50、100mg/kg下灌胃给药,对模型小鼠的腹泻、便血、体重下降有逆转作用,对结肠部位病理变化有逆转作用,对炎症和细胞因子NO、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17的分泌有调节作用,对生化指标MPO有抑制作用。
本发明技术方案的第二方面是提供了一种药物组合物在制备抗炎症性肠病药物中的应用,所述的药物组合物含有第一方面所述紫苏叶提取物以及药学上可接受的载体或赋形剂。其中紫苏叶提取物的制备方法如本发明第一方面所述。
用于此目的时,如果需要,可将活性成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合,制成可作为人药使用的适当施用形式或剂量形式。
本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药,给药途径可为肠道或非肠道,如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
本发明的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明的组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化纳、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等;湿润剂与粘合剂,如水、甘泊、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素纳、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等;崩解剂,例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢纳与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等;崩解抑制剂,例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等;吸收促进剂,例如季铵盐、十二烷基硫酸纳等;润滑剂,例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片,例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片,或双层片和多层片。
为了将给药单元制成丸剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等;粘合剂,如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等;崩解剂,如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
为了将给药单元制成栓剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酶、明胶、半合成甘油酶等。
为了将给药单元制成胶囊,将有效成分与上述的各种载体混合,并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂,混悬于水性介质中形成混悬剂,亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如,将本发明的组合物制成注射用制剂,如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂,这种制剂可以是含水或非水的,可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1,3 一丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酶等。另外,为了制备等渗注射液,可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油,此外,还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。
此外如需要,也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
本发明药用组合物的给药剂量取决于许多因素,例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度,患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应,给药途径、给药次数等,因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲,本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明药用组合物中最后的制剂中所含有的实际有效药物数量,加以适当的调整,以达到其治疗有效量的要求,完成本发明的治疗炎症性肠病的目的。通常对体重约75公斤患者,所给提取物的日剂量为0.001mg/kg体重~500mg/kg体重,优选3mg/kg体重~30mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个,例如二、三或四个剂量形式给药,这受限于给药医生的临床经验以及给药方案。
本发明的优点在于:(1)本发明属于中药制剂,成分纯天然,毒副作用低;(2)本发明能有效防治非特异性溃疡性结肠炎及克隆恩病;(3)本品制备工艺简单,易于规范化生产。
附图说明
图1紫苏叶提取物对IBD小鼠结肠组织病理学损伤的影响。
具体实施方式
以下实施例对本发明作进一步的说明,但本发明并不限于这些实施例。
实施例1:紫苏叶提取物的制备
取干燥的紫苏叶1.5kg,加入70%乙醇5升,加热回流1.5小时,趁热过滤。滤渣以同样的方法再处理一次;合并两次所得滤液,减压回收乙醇,得浸膏65g。该浸膏加入300mL水搅拌制成混悬液,分别以150mL乙酸乙酯萃取2次。剩余水部分加入1580mL95%乙醇溶解,室温沉淀24h,减压抽滤,滤渣以50ml水溶解,冷冻干燥、粉碎得紫苏叶提取物。
实施例2:剂型制备
胶囊:紫苏叶提取物100g,加入糊精147.5g,硬脂酸镁2.5g,充分拌均匀后,按胶囊制备法制成1000粒,填装于250mg胶囊,每粒含紫苏叶提取物100mg,其总量不低于50%。
片剂:取紫苏叶提取物100g,加入淀粉100g,糊精80g,蔗糖15g,充分搅拌混匀,制成颗粒,在60℃以下干燥,加入适量硬脂酸镁、滑石粉,混匀,压制成1000片,包糖衣或薄膜衣,即得。
颗粒剂:取紫苏叶提取物100g,加入适量蔗糖和糊精,按颗粒剂制法制成颗粒,干燥,制成1000g。
口服液:取紫苏叶药材,70%乙醇加热回流1.5小时提取2次,滤过,合并滤液,减压回收乙醇;浸膏加入等量水搅拌制成混悬液,乙酸乙酯萃取2次;水部分加入95%乙醇适量溶解,室温沉淀24h,减压抽滤,滤渣加水适量溶解,以40%氢氧化钠调节PH值至7.0,搅匀,4-8℃冷藏48小时,滤过,滤液加入蔗糖300g,搅匀使溶解,再加入适量香精并调节PH值至7.0,加水制成1000ml,搅匀,静置12小时,滤过,灌装,灭菌,即得。
药理实验
实验例1:紫苏叶提取物对DSS诱导小鼠炎症性肠病(IBD)的抑制作用
方法:SPF级雄性C57BL/6小鼠,18-20g,随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(柳氮磺胺吡啶,20mg/kg,灌胃给药)、药物处理组(紫苏叶提取物50,100mg/kg,灌胃给药),每组10只。小鼠自由饮用含2.8%(W/V)DSS饮用水7天制备小鼠肠炎模型。动物于造模型前1天开始灌胃给药,每天1次,连续10天。记录每日体重、腹泻、便血情况。第11 日处死小鼠,解剖取小鼠结肠部位并测量结肠长度,结肠质量;结肠部位常规固定包埋后进行HE染色;结肠部位匀浆后测生化指标MPO,离心后上清液用于分析肠组织NO和细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17)的含量。
结果:
(1)紫苏叶提取物对IBD小鼠病理生理损伤的逆转作用
①紫苏叶提取物对IBD小鼠疾病活动指数的影响
疾病活动指数DAI,每日评估小鼠体重、腹泻和便血情况,按症状严重程度给予评分,各部分最高4分,总分12分;评分标准如表1。本实验目的在于考察紫苏叶提取物对炎症性肠病小鼠疾病活动指数DAI的影响。
表1疾病活动指数评分表
结果见表2。空白组小鼠几乎无体重下降,腹泻和便血情况。模型组小鼠的疾病活动指数随DSS水饮用天数增加而迅速增加,在停止饮用DSS水后疾病活动指数有所下降。给予阳性药可以减缓疾病活动指数增加。紫苏叶提取物灌胃剂量在50,100mg/kg时分别在第5天、第 4天开始显著缓解肠炎小鼠体重减少、便血和腹泻情况。紫苏叶提取物可缓解炎症性肠病小鼠疾病活动的情况。
表2紫苏叶提取物对IBD小鼠疾病活动指数的影响(Mean±Std,n=10)
备注:与空白对照组比较,#p<0.05;与模型对照组比较,*p<0.05
②紫苏叶提取物对IBD小鼠结肠长度和质量比的影响
第11日处死小鼠,解剖取小鼠结肠部位。自然伸展并固定结肠两端,直尺测量并拍照;剖开并用生理盐水清洗,滤纸吸干后称重,结肠质量比计算公式为(结肠质量/当日体重×100%)。本实验目的在于考察紫苏叶提取物对炎症性肠病小鼠结肠部位的影响。
结果见表3。紫苏叶提取物可缓解炎症性肠病小鼠结肠长度变短和质量比增加的情况。
表3紫苏叶提取物对IBD小鼠结肠长度和结肠质量比的影响(Mean±Std,n=10)
备注:与空白对照组比较,#p<0.05;与模型对照组比较,*p<0.05
③紫苏叶提取物对IBD小鼠病变结肠部位病理情况的影响
取结肠相同部位处组织1cm,常规固定包埋后石蜡切片,行HE染色。每例样本选择
5处炎症病变明显处进行评分,病理组织学评分标准如下:
0级:黏膜固有层无中性白细胞浸润,肠绒毛结构清晰,未见异常;
Ⅰ级:黏膜固有层有少量中性白细胞(<10个.HPF)浸润,累及少量隐窝,肠绒毛结构尚清晰,未见明显异常;
Ⅱ级:黏膜固有层有明显中性白细胞(10~50个.HPF)浸润,累及50%以上隐窝,局部肠绒毛间质受累可见散在炎症细胞浸润;
Ⅲ级:黏膜固有层有大量中性粒细胞(>50个.HPF)浸润,伴隐窝脓肿,局部炎症明显部位肠绒毛间质可见大量炎症细胞侵润;
Ⅳ级:固有层明显急性炎症伴溃疡形成,溃疡部位肠绒毛坏死缺失,周边肠绒毛间质大量炎症细胞侵润。
实验结果如图1和表4所示。HE染色及病理评分(HI)结果表明,空白组小鼠结肠局部肠黏膜固有层下可见少量散在淋巴细胞,未见中性粒细胞浸润;肠绒毛结构清晰,未见异常。模型组小鼠结肠固有层明显急性炎症伴溃疡形成,溃疡部位肠绒毛坏死缺失,周边肠绒毛间质大量炎症细胞浸润。阳性药组小鼠小鼠结肠黏膜固有层有明显中性白细胞(10~50个.HPF) 浸润,累及50%以上隐窝,局部肠绒毛间质受累可见散在炎症细胞浸润。紫苏叶提取物 100mg/kg灌胃组小鼠结肠黏膜固有层有少量中性白细胞(<10个.HPF)浸润,累及少量隐窝,肠绒毛结构尚清晰,未见明显异常。紫苏叶提取物50mg/kg灌胃组小鼠黏膜固有层有大量中性粒细胞(>50个.HPF)浸润,伴隐窝脓肿,局部炎症明显部位肠绒毛间质可见大量炎症细胞侵润。紫苏叶提取物可缓解炎症性肠病小鼠结肠部位病变情况。
表4紫苏叶提取物对IBD小鼠病理评分的影响(Mean±Std,n=3)
备注:与空白对照组比较,#p<0.05;与模型对照组比较,*p<0.05
(2)紫苏叶提取物对IBD小鼠髓过氧化物酶(MPO)和NO分泌的影响
近年研究表明,过量产生ROS,使机体处于氧化应激状态,是IBD发病过程中的组织损伤和形成溃疡的关键因素。在此过程中,SOD和GSH-Px能够稳定细胞膜,对结肠组织起保护作用。MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志,其水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞的功能和活性状态。MPO和NO是氧自由基的重要来源,进一步造成氧化损伤。本试验目的是采用MPO检测试剂盒和Griess法分别对结肠组织匀浆中MPO和NO表达进行检测。
结果如表5。紫苏叶提取物可抑制IBD小鼠结肠部位MPO活性和NO的分泌。
表5紫苏叶提取物对IBD小鼠结肠组织MPO和NO的影响(Mean±Std,n=6)
备注:与空白对照组比较,#p<0.05;与模型对照组比较,*p<0.05
(3)紫苏叶提取物对IBD小鼠细胞因子分泌的影响
近年研究表明,CD4+T细胞各亚群在肠粘膜免疫调节及炎症性肠病中发挥着重要作用。 Th1/Th2亚群的免疫失衡在炎症性肠病发病中具有重要作用,其中Th1主要分泌IFN-γ,Th2主要分泌IL-4和IL-10。研究表明辅助性T细胞17(Th17)参与了炎症性肠病,大量分泌IL-17并发挥促炎性作用。本实验的目的是按照ELISA试剂盒说明书对结肠组织匀浆中IFN-γ、IL-4、 IL-10和IL-17的表达进行检测。
结果如表6。紫苏叶提取物可调节IBD小鼠结肠部位IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17的分泌,降低炎症水平。
表6紫苏叶提取物对IBD小鼠结肠组织细胞因子分泌的影响(Mean±Std,n=6,pg/ml)
备注:与空白对照组比较,#p<0.05;与模型对照组比较,*p<0.05 。
Claims (4)
1.一种紫苏叶提取物在制备预防和/或治疗炎症性肠病药物中的应用,其特征在于,所述紫苏叶提取物制备方法为如下步骤:
1)以紫苏叶为原料,70%乙醇为溶剂进行提取,回收溶剂,回收后的溶液浓缩,制得浸膏;
2)将步骤1)得到的浸膏加水分散,加入乙酸乙酯溶剂萃取,剩余水溶液浓缩得到浸膏;
3)将步骤2)得到的浸膏以95%乙醇溶液醇沉,过滤,沉淀物干燥、粉碎得到紫苏叶提取物。
2.根据权利要求1的应用,其特征在于,所述步骤1)中提取方法为浸渍、渗漉、煎煮或加热回流。
3.根据权利要求1的应用,其特征在于,所述步骤2)中,萃取次数为1-5次。
4.根据权利要求1-3任一项的应用,其特征在于,所述的炎症性肠病包括溃疡性结肠炎、克隆恩病。
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CN112076249A (zh) | 2020-12-15 |
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