CN101282737A - 用于软骨组织再生和骨关节炎治疗的草本药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于再生软骨组织和治疗骨关节炎的草本药物组合物。更具体而言，本发明涉及含有朝鲜当归萃取物、茵陈蒿萃取物和白苏萃取物的组合物。本发明组合物具有抗炎活性、抗炎和镇痛活性、对关节组织蛋白酶、炎性酶、足部水肿的抑制作用、在关节滑液的增加以及关节滑液总蛋白的增加等等中具有活性，并且因此可用作再生软骨组织的药物和治疗骨关节炎的药物。

Description

用于软骨组织再生和骨关节炎治疗的草本药物组合物
发明背景
(a)发明领域
本发明涉及用于再生软骨组织和治疗骨关节炎的草本药物组合物。更具体而言，该组合物具有抗炎活性，抗炎和镇痛活性，对关节组织蛋白酶、炎性酶、足部水肿、关节滑液的增加以及关节滑液总蛋白的增加等等具有抑制作用，并且因此可用作再生软骨组织的药物和治疗骨关节炎的药物。
(b)相关领域的描述
虽然包括人类的需氧生物体对使用氧的能量代谢中产生的活性氧具有自身防御体系，自防御中氧自由基的过量产生可引发各种疾病，例如关节炎。
活性氧为通过处于基态(3O2)的三线态氧的还原产生的自由基，并且包括单线态氧的超氧阴离子(1O2-)、过氧化物(H2O2)和羟基(-OH)。这种活性氧损伤蛋白质、DNA、酶和免疫相关因子，例如T细胞，由此引起各种疾病。
因此，已经主动研究了多种抗氧化剂。存在多种抗氧化剂，包括抗氧化酶，例如超氧化物歧化酶(SOD)、催化酶和谷胱甘肽过氧化物酶；天然抗氧化剂，例如维生素E、维生素C、类胡萝卜素、谷胱甘肽；合成抗氧化剂，例如叔丁基-4-羟基茴香醚(BHA)和3，5-(叔丁基)-4-羟基甲苯(BHT)。然而由于天然抗氧化剂酶的防护活性随着年龄降低，合成抗氧化剂引起突变或产生毒性。因此，仍然需要研制稳定和有效的抗氧化剂。
炎性疾病被认为是细菌感染所引起的脓肿疾病。两种环加氧酶(COX)已知为炎性酶。环加氧酶-1(COX-1)涉及前列腺素(PG)在各种正常器官和组织(例如胃肠道和肾)以及炎性区域中的产生。环加氧酶-2(COX-2)仅仅作用于炎性区域。例如双氯芬酸、阿司匹林和布洛芬的非甾体抗炎药(NSAIDs)为抑制COX-1和COX-2或主要抑制COX-1的市售药物。由于NSAIDs的连续给药抑制PG以及COX，而PG是维持肝脏、胃肠道、肾功能所必须的，NSAIDs产生多种不利作用(Isselbcher等人，Harrison′s Principles of Internal Medicine，(第13版)2，第1543-1711页)。
骨关节炎(OA)为最常见的病并且占骨骼肌系统疾病的40-60％。由于人类寿命的平均跨度增加，骨关节炎的流行连续增加。目前，世界上约15％的人口患有骨关节炎，并且60％的患者六十多岁(Haq I等人，J.Osteroarthritis，79(993)，第377～383页)。
骨关节炎与关节软骨的磨损有关，其引起骨骼与骨骼的直接接触并且产生关节疼痛并妨碍身体活动。由于慢性疾病需要长期治疗，长期药物给药引起并发症和副作用。因此仍然需要治疗这种并发症和用于减轻疼痛，并且在关节炎的治疗中保持和恢复关节软骨功能的药物。
治疗关节炎的方法通常集中于通过在仅仅产生疼痛的早期阶段给药简单的消除疼痛的药物减轻疼痛而进行。在由于疾病作用持续感觉疼痛的随后阶段，已经使用了具有止疼作用的抗炎药，例如皮质类甾醇。例如长期给药例如氢化可的松和倍他米松的抗炎药，然而其减弱肝脏、胃和肾的功能，并且抑制软骨细胞的生成能力。因此在连续观察中，抗炎药必须通过注射到关节中给药，而非口服给药。
对于关节炎的治疗，存在多种降低副作用并且具有抗炎和镇痛活性的药物。代表性实例为NSAIDs，例如双氯芬酸、阿司匹林和布洛芬。NSAIDs在消化器官尤其是胃和肠中引起副作用，并且仅仅消除疼痛和炎症而没有彻底治疗关节炎。
发明概述
为了解决先有技术中的问题，本发明目的是提供用于再生软骨组织和治疗骨关节炎的组合物，该组合物在抗炎作用、抗炎和镇痛作用，以及关节组织蛋白酶、炎性酶、足部水肿、关节滑液增加，以及滑液总蛋白的增加等等中具有抑制作用。
本发明另一目的是提供用于再生软骨组织和治疗骨关节炎的包括朝鲜当归(Angelica koreanum)萃取物、茵陈蒿(Artemisia apillaries)萃取物和白苏(perilla frutescens)萃取物作为有效药剂的组合物。
本发明另一目的是提供制备用于再生软骨组织的组合物或用于治疗骨关节炎的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：使用选自蒸馏水、C1-C5醇、乙酸乙酯以及其混合物的至少一种溶剂萃取朝鲜当归、茵陈蒿和白苏中每种植物或植物混合物；通过进行分馏萃取浓缩萃取物并且分离乙酸乙酯组分。
附图简介
图1表示根据实施例1-1至1-3、实施例2和实施例3的朝鲜当归、茵陈蒿和白苏的每种萃取物和包括其混合物的草药组合物对由脂多糖(LPS)所引起的骨关节炎的抗炎效果。
图2A至2C表示以0.8、4、20微克/毫升的量根据试验实施例2使用在实施例1-4、实施例2和实施例3中得到的草本药物组合物治疗具有由LPS引起的骨关节炎的小鼠巨噬细胞后的一氧化碳(CO)产生，并且LPC表示对照组中的CO产生。
图3A至3B表示以0.8、4、20微克/毫升的量根据试验实施例3使用在实施例1-4、实施例2和实施例3中得到的草本药物组合物治疗具有由脂多糖-细胞因子混合物(LCM)引起的骨关节炎的小鼠巨噬细胞后的前列腺素E2产生，并且CM表示对照组中的前列腺素E2产生。
图4A至4C表示以0.8、4、20微克/毫升的量使用在实施例1-4、实施例2和实施例3中得到的草本药物组合物治疗具有由LCM引起的骨关节炎的兔软骨组织后的一氧化氮(NO)产生，并且图4A和4B中的CM表示对照组中的NO产生。
图5A至5C表示以0.8、4、20微克/毫升的量根据试验实施例5使用在实施例1-4、实施例2和实施例3中得到的草本药物组合物治疗具有由LCM引起的骨关节炎的兔软骨组织后的前列腺素E2产生，并且图中的CM表示在对照组中使用LCM引起骨关节炎后的前列腺素E2产生。
图6A至6C表示以0.8、4、20微克/毫升的量根据试验实施例6使用在实施例1-4、实施例2和实施例3中得到的草本药物组合物治疗具有由LCM引起的骨关节炎的软骨组织后的分解的蛋白多糖，并且图中的CM表示在对照组中使用LCM引起骨关节炎后产生的蛋白多糖。
图7表示以0.8、4、20微克/毫升的量根据试验实施例7使用在实施例1-4、实施例2和实施例3中得到的草本药物组合物治疗具有由LCM引起的骨关节炎的软骨组织后的活化MMP-9和MMP-2的总量，并且CM表示在对照组中使用LCM引起骨关节炎后活化的MMP-9。
图8表示以0.8、4、20微克/毫升的量根据试验实施例8使用在实施例1-4、实施例2和实施例3中得到的草本药物组合物治疗具有由LCM引起的骨关节炎的兔软骨组织后表达的COX-2的总量，并且CM表示在对照组中使用LCM引起骨关节炎后表达的COX-2的总量。
图9表示在实施例1-4和实施例2中得到的草本药物组合物根据试验实施例9对大鼠足部水肿的抑制效果。
图10表示在实施例1-4和实施例2中得到的草本药物组合物根据试验实施例10对疼痛的抑制效果。
图11表示在实施例2中得到的草本药物组合物在患有骨关节炎的动物软骨组织再生方面的影响。
图12表示在实施例2中得到的草本药物组合物在患有骨关节炎的动物关节滑液量改变方面的影响。
图13表示在实施例2中得到的草本药物组合物对患有骨关节炎的动物关节滑液中蛋白多糖的影响。
图14表示在实施例2中得到的草本药物组合物对患有骨关节炎的动物关节滑液中总蛋白质的影响。
图15表示在实施例2中得到的草本药物组合物对患有骨关节炎的动物关节滑液中前列腺素E2的影响。
图16表示使用在实施例2中得到的草本药物组合物处理的患有骨关节炎的动物关节组织中滑液膜的番红O染色分析结果和细胞分布结果。
优选实施方案的详细说明
本发明将如下详细说明。
在本发明中，用于再生软骨组织和治疗骨关节炎的组合物包括作为有效药剂的朝鲜当归萃取物、茵陈蒿萃取物和白苏萃取物，并且更优选通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取制备的朝鲜当归萃取物、通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取制备的茵陈蒿萃取物、和通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取制备的白苏萃取物。
在本发明中用作活性剂的毛果芍药(Ostericum Koreanum max.)含有例如柠檬烯、邻甲酚和α-蒎烯、欧芹酚和佛手素的油状组分，并且因此可有效用于感冒、头痛、神经痛等等。
菊科植物茵陈蒿(Artemisiae Capillaris Thunb.)为属于玛格丽特菊(Chrysanthemum frutescens)的多年生植物，还称为Artemisa sacrorumsubsp.Kitamura，Artemisa sacrorum subsp.manshuria var.vestitaKitamura等等。由于其独特的味道和效力，首先注意到茵陈蒿。通常其广泛用作食物、药物和单一医学处方。如《东医宝鉴》(一种古朝鲜东方医学手册)和本草纲目(一种古中国植物药材列表)所述，茵陈蒿具有以下临床作用：肝损伤恢复；例如脂肪肝、肝癌、肝炎和黄疸病的肝脏疾病的预防和治疗；例如轻度腹泻、消化不良、胆囊炎和胃肠病的胃肠疾病的治疗；循环系统疾病例如卒中的治疗和增强血液循环和血液纯化；糖尿病的治疗。茵陈蒿中的主要组分为葡糖苷的东莨菪内酯、油类组分、香豆素、氧碳酸、皂角苷、单宁、谷甾醇树脂等，并且因此茵陈蒿预计具有解毒、抗菌活性、免疫活性等。其降低血脂，并且由此用于预防和治疗高血压、糖尿病、肥胖症和脑中风。
本发明中使用的紫苏(perilla herba)为白苏，属于唇形科植物的一年生植物。在东方医学中，通常使用叶子和种子。紫苏油含有55％紫苏醛、20-30％1-柠檬烯和少量α-蒎烯、精氨酸、枯酸和矢车菊素-3-(6-p-香豆酰-β-D-葡糖苷)-5-β-D-葡糖苷。紫苏叶的纯化油中含有isoegoma酮。白苏用作发汗药、止咳药、健胃药、利尿药、镇静药和镇痛药。紫苏草的成熟茎位于根部或根部附近，并且已知用于消除痛风、出汗和化痰，并且用于治疗眩晕、疼痛、充血和咳嗽。
本发明组合物优选含有5-50重量份的朝鲜当归萃取物、3-30重量份的茵陈蒿萃取物和2-20重量份的白苏萃取物。朝鲜当归萃取物、茵陈蒿萃取物和白苏萃取物可以1-10∶1-6∶1-4的重量比存在于组合物中。考虑到所需效力、副作用和生产成本确定萃取物的混合比例。如果量在该范围之外，该草本药物组合物有毒并且不能提供所需效果。本发明组合物具有抗炎活性、抗炎和镇痛活性、对关节组织蛋白酶、炎性酶、足部水肿、关节滑液的增加以及关节滑液总蛋白的增加的抑制作用等等中具有活性，并且因此可用作再生软骨组织的药物和治疗骨关节炎的药物。炎性疾病的实例包括骨关节炎、风湿性关节炎、肩关节炎、腱炎、腱鞘炎、肌炎等等。该组合物对骨关节炎非常有效。
朝鲜当归、茵陈蒿和白苏被萃取的植物部分可为花、叶、茎、叶鞘、花蕾、根、果实、种子和植物体，然而优选朝鲜当归的根、茵陈蒿的茎和叶和白苏的叶。
朝鲜当归、茵陈蒿和白苏萃取的萃取物通常如下制备：将每种植物或干燥的植物粉碎、在超声处理或回流下以1∶5-1∶10的重量比加入溶剂萃取，并且过滤或离心以得到上清液。溶剂为选自水、C1-C5醇、乙酸乙酯和己烷的至少一种，并且优选水、乙醇以及其混合物。超声处理进行2-5小时。
组合物优选通过使用蒸馏水或含水乙醇萃取朝鲜当归、茵陈蒿和白苏的每种或其混合物并且过滤或离心以得到上清液制备。制备方法更优选包括使用乙酸乙酯分馏萃取的步骤以制备乙酸乙酯馏分。分馏萃取可以进行至少3次。
草本药物组合物可以液体使用、真空浓缩，或者通过冻干得到的粉末的形式使用。
草本药物组合物可以药学上有效的剂型提供。合适的剂型为粉末、液体、peel、片剂、糖包衣片、硬或软胶囊、溶液、分散体、乳剂、注射液、栓剂等等，但不限于以上剂型。组合物合适的剂型可使用药学上可接受的盐和药学上惰性的有机或无机载体制备。当制剂为片剂、包衣片剂、糖包衣片和硬胶囊的形式时，其包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石，或硬脂酸或其盐。在软片剂的情况下，制剂可含有植物油、蜡、脂质、半固体和液体多元醇。在溶液或糖浆的情况下，可使用水、多元醇、甘油和植物油。栓剂载体包括天然油、硬化油、蜡、脂质、液体多元醇等。
本发明组合物任选此外含有防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、溶剂、甜味剂、着色剂、渗透稳定剂、抗氧化剂等等。可根据剂型合适地选择制剂的给药方法，例如通过口服或肠胃外给药。
草本药物组合物此外可用作用于预防或治疗炎性疾病的食品组合物，或用作再生软骨组织的功能食品。该组合物可为市售任何食物而又不限于这些食物。
由于存在于软骨破坏所致骨关节炎的过程中的炎性反应产生炎性相关的酶，其加速软骨损伤。一氧化氮(NO)的过量产生通常存在于炎性区域，由此加速细胞坏死[Moncada，S等人，Pharmacol.Rev.43：109-142(1991)]。在炎性疾病的治疗期间重要的是抑制可诱导的一氧化氮合成酶(iNOS)的活性或其表达。iNOS在短时间内过量产生NO以抵御外部刺激。然而，NO的过量产生引起次级有害反应，例如细胞坏死或疼痛。因此在骨关节炎的治疗中iNOS过度表达的抑制为关键步骤。
当骨关节炎发生时，关节中的疼痛和炎性反应增加。疼痛由滑液中前列腺素E2浓度的增加引起。为了治疗骨关节炎，滑液中前列腺素E2的浓度必须降低。
蛋白多糖为含有蛋白和糖的络合分子，并且在软骨中形成具有胶原纤维的缩合结构以弯曲或展开身体。此外，蛋白多糖类似于海绵保持软骨组织中的水分，由此使得软骨连续活动。
在骨关节炎的过程中，软骨破坏和炎症反应向滑液中释放蛋白多糖，由此增加滑液的量和滑液中蛋白多糖的浓度。因此，滑液中蛋白多糖的浓度降低为测量骨关节炎改善的重要指标。如果抑制了蛋白多糖向滑液中的释放，蛋白多糖在软骨中产生，由此影响软骨细胞生长。软骨组织的再生作用可通过释放到滑液中的蛋白多糖的抑制测定(Ailson M.Badger等人，Inhibition of lnterleukin-1-inducedProteoglycan Degradation and Nitric Oxide Production in Bovine ArticularCartilage/Chondrocyte Cultures by the Natural Product，Hymenialdisine.The Journal of Pharmacology and Experimental exampleal Therapeutics.Vol.290，587-593))。
骨关节炎中的软骨组织由MMP的产生和活化而被破坏，其中MMP-1(胶原酶-1)、MMP-2、MMP-3(溶基质素-1)、MMP-8(中性胶原酶)、MMP-9(明胶酶)和MMP-13(胶原酶-3)等的表达和活性提高。滑液中MMP9降低的浓度也是测量骨关节炎改善的标志。
酶COX-2为合成引起疼痛的前列腺素E2的酶。由于COX-2合成通过包括NO的其它刺激促进，COX-2活性和表达的抑制对于治疗骨关节炎重要。
引起炎症的活性氧物质可通过SOD的抗氧化酶除去，因而SOD为测量骨关节炎改善的标志。
在预防或治疗如上所述骨关节炎的基本因素方面，本发明草本药物组合物通过抑制其分离降低软骨组织中蛋白多糖和前列腺素E2的浓度，因为这样抑制CO的产生和MMP-9和COX-2表达降低乙酸引起的扭曲和足部水肿，并且增加了SOD以除去活性氧物质。
草本药物组合物降低了滑液量、软骨损伤期间释放到滑液中蛋白的总量以及滑液中蛋白多糖的浓度，由此预防骨关节炎的发病。
通过再生损伤的软骨细胞，该草本药物组合物可彻底治疗骨关节炎。再生的软骨细胞可通过外观和显示滑液膜细胞分布和表面的番红(safranin)O染色观察。通常观察软骨组织的光滑表面以确定骨关节炎软骨组织中软骨细胞是否再生。在番红O染色中，软骨细胞不能在骨关节炎中观察到，然而软骨细胞生长和骨关节炎减轻可通过在着色区域观察软骨组织形成并且将以红色显示的着色度与对照组相比确定。
组合物可口服或肠胃外给药。用于口服给药的固体制剂包括片剂，peels，粉剂，粒剂，胶囊等等。除了草本药物组合物外，固体制剂含有至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶。制剂中另外包括例如硬脂酸镁或滑石的润滑剂。用于口服给药的液体制剂的实例为分散体、液体、乳剂、糖浆等等。液体制剂含有水、液体石蜡，以及其它作为简单稀释剂的各种稀释剂，以及其它润湿剂、甜味剂、调味剂和防腐剂。用于肠胃外给药的制剂含有灭菌水溶液、丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油的植物油、作为非水溶剂的可注射酯例如油酸乙酯和分散剂。剂量单元含有例如1/2、1/3、1/4、1、2、3或4倍以上的剂量。剂量单位的量指的是每次给药的活性药物的量，并且通常1天给药全部、1/2、1/3或1/4的量。
当组合物用作药物组合物时，活性剂的量为1-1000毫克/千克，并且优选50-300毫克/千克，并且可以每天给药1或4次。剂量可以考虑到需要患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食情况、给药的次数和方法、排泄速率、疾病严重程度等确定。
此外，本发明涉及含有朝鲜当归萃取物、茵陈蒿萃取物萃取物和白苏萃取物作为有效剂的食品组合物或食品添加剂。
在食品组合物的情况下，根据现有技术中使用的常规方法，萃取物单独使用或者与其它食品添加剂组合使用。有效剂以全部食品组合物1-99.9重量％，并且优选10-70重量％的量存在。有效剂的量可以考虑到其应用(例如预防、治疗或保健)选择。为了在较长时间内将组合物用于保持和控制健康，该量可以比以上范围更低。这是由于有效药剂没有稳定性问题，并且因而可以含有多于以上范围。
在本发明中没有限制可以使用的食品。这些食品的实例为肉、香肠、面包、巧克力、糖果、小吃、甜味小吃、比萨、方便面、其它面条、香口胶、乳制品例如冰淇淋、调味品、汤、茶、饮料、醇饮料，以及复合维生素。
本发明根据以下实施例进一步详细说明。然而这些实施例不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：草本药物组合物的制备
实施例1-1：朝鲜当归的萃取
将使用自来水洗涤以除去杂质并在阴凉处干燥1天的280克朝鲜当归切碎，并且加入2升70％(体积/体积)含水乙醇溶液。然后通过使用回流提取器[Heating mantle(GLASS-COL)，Flask(Corning)，Condenser(Corning)]提取2小时、使用滤纸(Whatman No.2)过滤，并且真空浓缩以得到朝鲜当归的乙醇提取物。加入250毫升水合乙酸乙酯将乙醇提取物分馏萃取三次。然后仅仅收集乙酸乙酯馏分，并且在60-70℃真空浓缩以12.75克产量得到朝鲜当归的干萃取物。
实施例1-2：茵陈蒿的萃取
85克茵陈蒿根据基本上与实施例1-1相同的方法萃取以得到1.74克干萃取物。
实施例1-3：白苏的萃取
85克白苏根据基本上与实施例1-1相同的方法萃取以得到2.45克干萃取物。
实施例1-4：草本药物组合物的制备制备
在实施例1-1至1-3中的得到朝鲜当归、茵陈蒿和白苏的萃取物以5∶3∶2的重量比混合以制备100克混合物。将混合物溶于250毫升水合乙酸乙酯中，匀化并真空浓缩。
实施例2：草本药物组合物的制备
重量比为5∶3∶2的50克干燥朝鲜当归、30克干燥茵陈蒿和20克干燥白苏使用2.5升70％的含水乙醇溶液在回流提取器[Heating mantle(GLASS-COL)，Flask(Corning)，Condenser(Corning)]提取2小时、使用滤纸(Whatman No.2)过滤，并且真空浓缩以得到24.46克乙醇提取物。加入250毫升水合乙酸乙酯将乙醇提取物分馏萃取三次。然后仅仅收集乙酸乙酯馏分，并且在60-70℃真空浓缩以得到干萃取物。最后将干提取物分散在50毫升蒸馏水中，并且冻干以提供3.88克粉状草本药物组合物。
实施例3：草本药物组合物的制备
重量比为1∶1∶1的30克干燥朝鲜当归、30克干燥茵陈蒿和30克干燥白苏使用2.5升70％的含水乙醇溶液在回流提取器[Heating mantle(GLASS-COL)，Flask(Corning)，Condenser(Corning)]提取2小时、使用滤纸(Whatman No.2)过滤，并且真空浓缩以得到21.04克乙醇提取物。加入250毫升水合乙酸乙酯将乙醇提取物分馏萃取三次。然后仅仅收集乙酸乙酯馏分，并且在60-70℃真空浓缩以得到干萃取物。最后将干提取物分散在50毫升蒸馏水中，并且冻干以提供4.02克粉状草本药物组合物。
试验实施例1：朝鲜当归萃取物、茵陈蒿萃取物和白苏萃取物以及草本药物组合物的抗炎作用
Raw 264.7细胞，得自小鼠的巨噬细胞，购自韩国细胞系库。2×106细胞在含有包括10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum 26140-079，Gibco)、100单位/毫升青霉素和10微克/毫升链霉素的DMEM培养基的24孔板中培养，并且在潮湿条件下在5％CO2下在37℃培养24小时。
为了在Raw 264.7中引起NO产生，向培养的细胞中注射1微克/毫升LPS，其为细菌细胞壁组分。然后将在实施例1-1、1-2、1-3、1-4、2和3中得到的每个组合物加入到测试组以达到20微克/毫升的浓度，然而在对照组中仅仅处理二甲亚砜(DMSO)。处理的细胞培养16小时。将培养基与油脂混合，在室温下放置10分钟，并且在540纳米波长测量其吸光度。所得结果如图1所示。
试验实施例2：小鼠巨噬细胞中NO产生的抑制
为了研究在实施例1-4、2和3中得到的草本药物组合物的抗炎活性，测试了小鼠巨噬细胞中NO产生的抑制。Raw 264.7细胞，得自小鼠的巨噬细胞，购自韩国细胞系库。2×106细胞在含有包括10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum 26140-079，Gibco)、100单位/毫升青霉素和10微克/毫升链霉素的DMEM培养基的24孔板中培养，并且在潮湿条件下在5％CO2下在37℃培养24小时。
为了在Raw 264.7中引起NO产生，向培养的细胞中注射1微克/毫升LPS。然后将在实施例1-4、2和3中得到的每个组合物加入到测试组以分别达到0.8、4、20微克/毫升的浓度，然而在对照组中仅仅处理二甲亚砜(DMSO)。处理的细胞培养16小时。将培养基与油脂混合，在室温下放置10分钟，并且在540纳米波长测量其吸光度。所得结果如图2A至2C所示。
如图2A至2C所示，本发明草本药物组合物以浓度依赖的方式在小鼠巨噬细胞Raw 264.7中抑制了NO产生。此外，实施例1-4和实施例2的草本药物组合物具有比实施例3的组合物更大的抗炎活性。
试验实施例3：小鼠巨噬细胞中前列腺素E2(PGE2)的抑制
为了研究在实施例1-4、实施例2和实施例3中得到的草本药物组合物的抗炎活性，使用PGE2免疫测定试剂盒(Cayman，No.514010)测试小鼠巨噬细胞中前列腺素E2产生的抑制。
根据基本上与试验实施例2相同的方法，将在实施例1-4、2和3中得到的每个组合物加入到测试组以分别达到0.8、4、20微克/毫升的浓度，然而在对照组中仅仅处理DMSO。将处理的细胞培养16小时。将50微升培养溶液、50微升PGE2-AChE示踪剂和50微升PGE2单克隆抗体加入到酶联免疫测定试剂盒中，并且在4℃培养18小时。然后将每个孔洗涤，加入200微升Ellman′s试剂后在阴凉中培养60-90分钟，然后在405纳米波长进行吸光度测定。所得结果如图3A至3C所示，其中LPS标记与对照组中骨关节炎后产生的前列腺素E2总量有关。
如图3A至3C所示，实施例1-4的草本药物组合物以浓度依赖的方式在小鼠巨噬细胞中抑制了PGE2产生。
试验实施例4：兔软骨组织中NO产生的抑制
为了研究在实施例1-4、2和3中得到的草本药物组合物的抗炎活性，测试了兔软骨组织中NO产生的抑制。
通过从2-3周龄新西兰白兔的后腿关节分离软骨组织得到软骨细胞。1×106软骨细胞在含有包括10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum26140-079，Gibco)、100单位/毫升青霉素和10微克/毫升链霉素的DMEM培养基的24孔板中培养，并且在潮湿条件下在5％CO2下在37℃培养5-6天。当软骨细胞已经增加至80％时，培养基变为不含血清的DMEM。然后，培养的细胞中加入LCM。然后，将在实施例1-4、2和3中得到的每个组合物加入到测试组以分别达到0.8、4、20微克/毫升的浓度，然而在对照组中仅仅处理DMSO。处理的细胞培养16小时。将培养基与油脂以1∶1的比例混合，在室温下放置10分钟，并且在540纳米波长测量其吸光度。所得结果如图4A至4C所示。
如图4A至4C所示，实施例1-4、2和3的草本药物组合物以浓度依赖的方式在兔软骨组织中抑制了NO产生。这种发现表明该草本药物组合物对骨关节炎具有炎性活性。
试验实施例5：兔软骨组织中前列腺素E2(PGE2)的抑制
为了研究在实施例1-4、2和3中得到的草本药物组合物的抗炎活性，使用PGE2免疫测定试剂盒(Cayman，No.514010)测试兔软骨组织中前列腺素E2产生的抑制。
根据基本上与试验实施例4相同的方法，除了对照组外，培养的细胞加入LCM并培养20分钟。然后，将在实施例1-4、实施例2和实施例3中得到的每个组合物加入到测试组以分别达到0.8、4、20微克/毫升的浓度，然而在对照组中仅仅处理DMSO。将处理的细胞培养16小时。将50微升培养溶液、50微升PGE2-AChE示踪剂和50微升PGE2单克隆抗体加入到酶联免疫测定试剂盒中，并且在4℃培养18小时。然后将每个孔洗涤，加入200微升Ellman′s试剂后在阴凉中培养60-90分钟，然后在405纳米波长进行吸光度测定。所得结果如图5A至5C所示，
如图5A至5C所示，实施例1-4的草本药物组合物以浓度依赖的方式在兔软骨组织中抑制了前列腺素E2产生。
试验实施例6：兔软骨组织中蛋白多糖分解的抑制
为了研究在实施例1-4、2和3中得到的草本药物组合物对关节组织的保护作用，测试了对蛋白多糖分解的抑制。
根据试验实施例3，通过从2-3周龄新西兰白兔的后腿关节分离软骨组织得到软骨细胞。1×106软骨细胞在含有包括10％胎牛血清(FetalBovine Serum 26140-079，Gibco)、100单位/毫升青霉素和10微克/毫升链霉素的DMEM培养基的24孔板中培养，并且在潮湿条件下在5％CO2下在37℃培养5-6天。当软骨细胞已经增加至80％时，培养基变为不含血清的DMEM。然后，除了对照组外，培养的细胞中加入LCM并且培养20分钟。然后，将在实施例1-4、2和3中得到的每个组合物加入到测试组以分别达到0.8、4、20微克/毫升的浓度，然而在对照组中仅仅处理DMSO。处理的细胞培养16小时。
在培养液中促使蛋白多糖分解后，通过测量1，9-二甲基亚甲基蓝在525纳米波长的颜色并且使用硫酸软骨素标准化分析葡糖胺多糖(GAG)的量。所得结果如图6所示。
如图6A至6C所示，实施例1-4、2和3的草本药物组合物抑制了蛋白多糖分解并且提高了滑液中蛋白多糖浓度。
试验实施例7：兔软骨组织中MMP-9活性的抑制
为了研究在实施例1-4中得到的草本药物组合物的抑制活性，测试了草本药物组合物对关节组织蛋白酶MMP-9的活性。
根据试验实施例4，通过从2-3周龄新西兰白兔的后腿关节分离软骨组织得到软骨细胞。1×106软骨细胞在含有包括10％胎牛血清(FetalBovine Serum 26140-079，Gibco)、100单位/毫升青霉素和10微克/毫升链霉素的DMEM培养基的24孔板中培养，并且在潮湿条件下在5％CO2下在37℃培养5-6天。当软骨细胞已经增加至80％时，培养基变为不含血清的DMEM。然后，除了对照组外，培养的细胞中加入LCM并且培养20分钟。然后，将在实施例1-4中得到的组合物加入到测试组以分别达到0.8、4、20微克/毫升的浓度，然而在对照组中仅仅处理DMSO。处理的细胞培养16小时。
通过离心培养细胞并且除去细胞碎片得到上清液。上清液与染料混合，在37℃培养1小时，然后使用10％Zymogram gel(NovexEC61752)在100V电压下通过SDS-PAGE进行3小时。通过将其震动三次30分钟将凝胶洗涤，浸渍在显影缓冲剂中，并且在37℃在烘箱中显影48小时。然后凝胶使用Coomassie G蓝色染料染色，并且将带状区域以外漂白。确定包括92kD MMP-9的带以显示图7中的结果。
如图7所示，实施例1-4的草本药物组合物以浓度依赖的方式抑制MMP-9活性。
试验实施例8：兔软骨组织中急性炎症病因的抑制
为了研究在实施例1-4中得到的草本药物组合物对COX-2合成前列腺素的抑制作用，进行蛋白质印迹法。
根据试验实施例4，得到兔软骨细胞。从细胞中除去培养基，使用实施例1-4的草本药物组合物和LCM处理，并且细胞通过加入萃取缓冲溶液(0.32M蔗糖[S0389，Sigma]，0.2M HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸)[H3375，Sigma]，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)[808288，BM]，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)[P7627，Sigma]，10微克/毫升Aprotinin[A1153，Sigma]，和10微克/毫升亮肽素[L0649，Sigma])以进行蛋白的定量分析。然后，20微克蛋白使用含有SDS(十二烷基硫酸钠)和10％聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE处理。处理的蛋白转入到PVDF(聚偏氟乙烯)膜(IPVH00010，Millipore)，与5％NFDM(脱脂奶粉)溶液、第一抗体然后和第二抗体反应，并且通过与ECL试剂(Amersham Biosciences)的显色反应以将其暴露于X射线。2微克/毫升COX-2(sc-1745，Santacruze)和Anti-Rabbit-lgG-HRP(sc-2004，Santacruze)80纳克/毫升分别用作第一抗体和第二抗体。结果如图8所示。
如图8所示，在实施例1-4得到的草本药物组合物将兔软骨组织中的COX-2表达抑制到正常程度。
试验实施例9：小鼠中醋酸扭体的抑制
为了研究实施例1-4和实施例2的镇痛作用，根据Whittle′s法(1957)进行醋酸扭体测试。
实施例1-4和实施例2的草本药物组合物分别以每千克小鼠体重100、500和1000毫克的量给药到小鼠(ICR，癌症研究学会)。30分钟后，0.1毫升/10克0.7％乙酸-盐水注入到小鼠的腹腔。注射10-20分钟后，观察扭动的数目如表1所示。除了给药草本药物组合物以外，使用测试组相同的方法处理对照组。
表1
 组   剂量(毫克/千克)   平均扭动数目   抑制率(％)
 对照组   -   20   -
 实施例1-4   200   15   25
 实施例1-4   400   8.3   58.3
 实施例2   200   15.7   22
 实施例2   400   8   60
如表1所示，实施例1-4和实施例2得到的草本药物组合物降低扭动数20-60％，这表示良好的镇痛活性。
试验实施例10：大鼠中急性炎症的抑制
为了研究在实施例1-4和实施例2得到的草本药物组合物的抗炎活性，草本药物组合物在足部水肿的抑制作用通过草本药物组合物治疗大鼠角叉菜胶所致炎症测试。
分别以200和400毫克/千克的量向饥饿整夜的SD(Spraque-Dawley)大鼠口服给药草本药物组合物。1小时后，0.1毫升溶于食盐水的1％角叉菜胶皮下给药到大鼠右后足的脚掌。5小时后，以1小时间隔使用体积测量计(plethymometer)测量足部水肿。水肿的抑制速率如图9所示。对照组没有使用口服给药处理。
如图9所示，在实施例1-4和实施例2得到的草本药物组合物通过降低足部水肿抑制炎症。
试验实施例11：活性氧物质的分解
为了研究在实施例1-4和实施例2得到的草本药物组合物的活性氧的分解，SOD，其通过除去伴随黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生的活性氧来保护身体，使用超氧化物歧化酶测试试剂盒(Cat No.706002，Cayman)根据活性氧的分解度测量。阳性对照组使用Joins
Figure A20068002489000171
(SK PHARMA CO.，LTD.)，并且阴性对照组没有使用草本药物组合物处理。
含有200微升重拨检测器(redial detector)的每个孔加入10微升在实施例1-4和
实施例2得到的草本药物组合物和10微升SOD标准，使用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶处理以生成活性氧，并且在室温下培养20分钟。使用分光光度计在540纳米测量产品的吸光度。通过分析表2中切线的斜率表明分解度。在表2中，SOD值在阴性对照组中测量的0.7值作为修正值。如表2所示，在实施例1-4和实施例2得到的草本药物组合物具有良好的活性氧分解活性。
表2
  SOD(微克/毫升)   实施例1-4   实施例2   对比实施例
  20   0.59   0.48   0.69
  40   0.98   1.02   0.92
  80   1.55   1.51   1.15
  100   2.18   2.42   1.47
试验实施例12：福尔马林测试
为了研究在实施例1-4和实施例2得到的草本药物组合物的镇痛作用，进行福尔马林测试。对照组没有使用草本药物组合物给药处理。
小鼠在其右后足的脚掌皮下给药草本药物组合物，并且在丙烯酸观察室(20厘米高，20厘米直径)中观察40分钟。在图10中记录小鼠的行为，例如其足部脚掌的轻轻拍打或敲打。第一个5分钟至40分钟为第一阶段，并且剩余的20分钟为第二阶段。
如图10所示，实施例1-4和实施例2的草本药物组合物具有极好的镇痛作用。
试验实施例13：软骨细胞生长
为了研究在实施例2中得到的草本药物组合物对软骨细胞再生的影响，新西兰白兔两个后腿的软骨组织用于膝关节前交叉韧带切断(ACLT)。3天后，白兔在5×5平方米室内连续运动2周以产生关节炎，然后给药在实施例2中得到的草本药物组合物1个月。在试验结束后，从白兔取出软骨以比较软骨细胞生长。含有软骨组织的对照组没有进行草本药物组合物的治疗。
如图11所示，从使用在实施例2中得到的草本药物组合物治疗的白兔得到的关节软骨具有表面光滑的软骨区域。然而对照组软骨组织的表面粗糙并且不规则。这种结果表明实施例2的草本药物组合物对损伤的软骨细胞具有极好的再生作用。
试验实施例14：骨关节炎动物模型中关节滑液的总量
已经报道了滑液的量取决于骨关节炎的严重程度。已经根据试验实施例13的方法诱发骨关节炎后，滑液的总量在口服后2周和4周测量以确定滑液的量。使用测试组相同的方法处理对照组，而没有口服草本药物组合物。
滑液的量通过Arsenazo III络合法确定滑液中Ca2+浓度测量[Micaylova V.等人，Anal.Chim.Acta，53(194)，1971]，并且滑液的总量使用Donnan平衡方程式计算。0.01毫升滑液与1毫升Arsenazo III试剂(Sigma)混合，在室温培养5分钟，然后在600纳米波长测量其吸光度。该试验实施例的结果如图12和表3所示。
如图12和表3所示，对照组的滑液增加到0.76毫升，然而测试组的滑液为0.29毫升。因此与对照组相比，口服使用实施例2草本药物组合物在兔子内抑制了滑液增加。
表3
  0周(毫升)   2周(毫升)  4周(毫升)
  正常组   0.23   -  -
  对照组   0.58   0.39  0.76
  实施例2   0.36   0.38  0.29
试验实施例15：骨关节炎动物模型中滑液中蛋白多糖浓度的测量
为了研究草本药物组合物的保护效果，得自试验实施例14测试组和对照组的关节滑液用于根据试验实施例6测量滑液中蛋白多糖浓度。该试验实施例的结果如图13和表4所示。
如图13和表4所示，对照组蛋白多糖浓度增加60.12％，然而测试组仅仅为7.33微克/微升，仅仅增加35.98％。这种结果表明该草本药物组合物为关节提供良好的保护。
表4
  0周(微克/微升)   2周(微克/微升)   4周(微克/微升)
  正常组   8.20   -   -
  对照组   10.23   11.96   16.38
  实施例2   11.45   10.65   7.33
试验实施例16：骨关节炎动物模型中滑液中总蛋白含量的测量
在骨关节炎发病时，全蛋白由于软骨破裂进入滑液。为了研究骨关节炎抑制，测量滑液中总蛋白含量。
使用得自试验实施例14测试组和对照组的关节滑液并且根据Bradford法通过在595纳米测量吸光度得到总蛋白含量。该试验实施例的结果如图14和表5所示。
如图14和表5所示，对照组总蛋白量为52.71微克/微升，基于正常范围25.67微克/微升已经增加24.99％，然而实验组为38.62微克/微升，其基于对照组图形已经降低26.68％。
表5
  0周(微克/微升)   2周(微克/微升)   4周(微克/微升)
  正常组   25.67   -   -
  对照组   42.17   46.96   52.71
  实施例2   52.67   41.68   38.62
试验实施例17：骨关节炎动物模型的滑液中前列腺素E2含量的测量
为了研究草本药物组合物的抗炎作用，得自试验实施例14测试组和对照组的关节滑液根据与试验实施例5相同的方法测量滑液中前列腺素E2的浓度。该试验实施例的结果如图15和表6所示。
如图15和表6所示，对照组滑液中前列腺素E2的浓度已经由0.65微克/微升增加至2.1微克/微升，增加221.78％。然而试验组滑液中前列腺素E2的浓度增加25.21％。因此，测试组具有比对照组更强的抑制作用。
表6
  0周(微克/微升)   2周(微克/微升)   4周(微克/微升)
  正常组   0.33   -   -
  对照组   0.65   0.96   2.10
  实施例2   0.63   0.44   0.79
试验实施例18：滑液膜中细胞分布测量和番红O染色结果
根据试验实施例13的方法诱发骨关节炎后，实施例2草本药物组合物以200毫克/千克的量口服给药到兔子一个月。然后从兔子中切除趾部股骨，固定在4％福尔马林(Sigma，F0507)中24小时以上，切成5毫米厚样品，使用5％硝酸脱钙24小时以制备石蜡块。根据组织化学分析将4μm样品使用番红O(Sigma，S2255)染色，以研究滑液膜和表面的细胞分布。该试验实施例的结果如图16所示。没有使用草本药物组合物处理的从兔子中切除的趾部股骨用作对照组。如图16所示，与对照组相比，已经口服给药实施例2草本药物组合物的测试组具有与骨关节炎的红色着色区域重叠的蓝色染色区域。因此该结果表明草本药物组合物具有软骨再生作用。
制剂1：片剂
2100毫克实施例2得到的草本药物组合物、90毫克玉米淀粉、180毫克乳糖、18毫克L-羟丙基纤维素、5毫克聚乙烯吡咯烷酮和余量乙醇均匀混合，通过湿法造粒粒化，并且加入1.8毫克硬脂酸镁进行压片，得到每片400毫克的片剂。
制剂2：软胶囊
根据药物制剂的一般需要，将100毫克实施例2得到的草本药物组合物、180毫克大豆油、40毫克黄石蜡、128毫克氢化椰树油、20.5毫克磷脂大豆、212毫克明胶、50毫克甘油(密度为1.24)、76毫克d-山梨糖醇、0.54毫克对羟基苯甲酸甲酯、0.90毫克对羟基苯甲酸丙酯、0.56毫克甲基香荚兰醛和适量黄色素203混合以得到软胶囊。
制剂3：胶囊
100毫克实施例2得到的草本药物组合物、83毫克玉米淀粉、175毫克乳糖和2毫克硬脂酸镁均匀混合，并以360毫克填充到胶囊中。
制剂4：保健食品和饮品
如下制备含有实施例2得到的草本药物组合物的保健食品和饮品。
制剂4-1：保健食品
1.000毫克实施例2得到的草本药物组合物、70微克维生素A乙酸酯、1毫克维生素E、0.15毫克维生素B1、0.15毫克维生素B2、0.5毫克维生素B6、0.2微克维生素B12、10毫克维生素C、10微克生物素、1.7毫克烟酸、50微克叶酸、0.5毫克泛酸钙、1.75毫克硫酸亚铁(FeSO4)、0.82毫克氧化锌、25.3毫克碳酸镁、15毫克磷酸二氢钾、55毫克磷酸氢二钾、90毫克柠檬酸钾、100毫克碳酸钙和24.8毫克氯化镁根据生产保健食品的通用方法制备。
维生素和矿物质的混合比表示优选比例，不过可以改变。食品可根据通用方法通过混合和粒化制备。
制剂4-2：保健饮品
100毫克实施例2得到的草本药物组合物、15克维生素C、100克维生素E(粉状)、19.75克乳酸亚铁、3.5克烟酸、3.5克氧化锌、0.2克维生素A、0.25克维生素B1、0.3克维生素B2和水根据通用方法混合并制备以产生保健饮品。
根据制备保健饮品的通用方法，将组分混合，在85℃加热搅拌1小时，过滤并收集倒入2升杀菌容器。将容器储存在冰箱中，并且用于制备保健饮品。
上述组合物表示合适的实例，并且可以根据需要的人群、国家、用途、口味等改变。
制剂4-3：口香糖
根据制备口香糖的通用方法，通过混合0.24-0.64％的实施例2得到的草本药物组合物、20％胶基、76.36-76.76％糖、1％果味香料和2％水制备口香糖。
制剂4-4：冰淇淋
根据制备冰淇淋的通用方法，使用0.24-0.64％的实施例2得到的草本药物组合物、10.0％乳脂、10.8％脱脂固体、12.0％糖、3.0％淀粉糖浆、0.5％乳液稳定剂(斯盘)、0.15％香料(草莓)和62.91-63.31％水制备冰淇淋。
制剂4-5：饮料
根据制备饮料的通用方法，使用0.48-1.28毫克实施例2得到的草本药物组合物、522毫克蜂蜜、5毫克硫辛酰胺(thioctanamide)、10毫克烟酸、3毫克氯化核黄素钠、2毫克氯酸吡哆醇、30毫克肌醇、50毫克乳清酸和200毫升水制备饮料。
包括朝鲜当归萃取物、茵陈蒿萃取物和白苏萃取物的本发明草本药物组合物具有抗炎活性、抗炎和镇痛活性、对关节组织蛋白酶、炎性酶、足部水肿、关节滑液的增加以及关节滑液总蛋白的增加等等的抑制作用中具有活性，并且因此可用作再生软骨组织的药物和治疗骨关节炎的药物。此外，该组合物可用作药物组合物或食品组合物。

Claims (10)

1.用于再生软骨组织的组合物，包括通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取制备的朝鲜当归萃取物、通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取制备的茵陈蒿萃取物、和通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取制备的白苏萃取物。
2.根据权利要求1的组合物，其中组合物中包括5-50重量份的朝鲜当归萃取物、3-30重量份的茵陈蒿萃取物和2-20重量份的白苏萃取物。
3.根据权利要求1的组合物，其中该组合物通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取朝鲜当归、茵陈蒿和白苏中每种植物或植物混合物，
并且另外使用乙酸乙酯分馏萃取以产生乙酸乙酯馏分而制备。
4.根据权利要求1的组合物，其中该组合物抑制蛋白多糖的分解。
5.根据权利要求1的组合物，其中该组合物为选自口服片剂、口服软胶囊、膏剂、注射剂和透皮剂型的剂型。
6.用于治疗骨关节炎的组合物，包括通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取制备的5-50重量份的朝鲜当归萃取物、通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取制备的3-30重量份的茵陈蒿萃取物、和通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取制备的2-20重量份的白苏萃取物。
7.根据权利要求6的组合物，其中该组合物通过使用乙醇、蒸馏水或其混合物萃取朝鲜当归、茵陈蒿和白苏中每种植物或植物混合物，
并且另外使用乙酸乙酯分馏萃取以产生乙酸乙酯馏分而制备。
8.根据权利要求6的组合物，其中该组合物降低蛋白多糖、前列腺素、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和环加氧酶(COX-2)的增加的血量，其为骨关节炎的标志。
9.根据权利要求6的组合物，其中该组合物为选自口服片剂、口服软胶囊、膏剂、注射剂和透皮剂型的剂型。
10.制备用于再生软骨组织的组合物或用于治疗骨关节炎的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：使用选自蒸馏水、C1-C5醇、乙酸乙酯以及其混合物的至少一种溶剂萃取朝鲜当归、茵陈蒿和白苏中每种植物或植物混合物；和
通过进行分馏萃取浓缩萃取物并且分离乙酸乙酯馏分。
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