KR20160015440A

KR20160015440A - 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품

Info

Publication number: KR20160015440A
Application number: KR1020140097135A
Authority: KR
Inventors: 김태열; 라제현; 심재헌
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2014-07-30
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2016-02-15
Also published as: WO2016017851A1

Abstract

본 발명은 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물은 파골세포의 형성 및 활성을 효과적으로 억제하므로 골다공증 예방 및 치료에 유용한 의약품, 건강기능식품 등으로 널리 이용될 수 있다.

Description

자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품{Complex of Gleditsia sinensis Lam. extracts and Perillae semen extracts and Products containing thereof as a effective component}

본 발명은 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 발명으로서, 보다 상세하게는 파골세포 분화억제 활성을 갖는 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물, 발효유, 기능성 음료 및 건강기능식품에 관한 것이다.

골다공증은 골흡수와 골형성의 균형이 무너져 발생하는 것으로 과다하게 골흡수가 진행되는데 기인한 질환으로, 골다공증은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지고, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골조직은 조골세포에 의해 형성되고 파골세포에 의해 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다.

인체를 지지하는 조직으로 200여개의 뼈(bone)와 각기 다른 뼈를 연결하는 조직인 연골(cartilage)로 구성되어 있다. 이들은 중요한 장기의 보호, 조혈화에 필요한 미세 환경제공과 같은 기본적이며 다양한 기능을 제공하여 준다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉, 인 또는 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적· 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골재형성(bone remodeling) 이라고 한다(Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso., 50(6Suppl), pp.664-669, 2005). 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다(Cohen-Solal M. et al., Therapie., 58(5), pp.391-393, 2003).

골재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 이들은 서로 다른 세포에서 유래하는데 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)가 분화되어 조골세포(osteoblast), 근원세포(myoblast), 지방세포(adipocyte), 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte)로 분화되고, 조혈모세포(hematopoietic stem cell)가 분화되어 파골세포(osteoclast), 대식세포(macrophage), T 세포(T cell), B 세포(B cell), 수지상세포(dentritic cell), 호염구(basophile), 호산구(eosinophile), 호중구(neutrophile), 혈소판(platelet), 적혈구(Red blood cell)로 분화된다. 조골세포 주요 분화인자인 Runx2, 근원세포 주요 분화인자인 MyoD, 지방세포 주요 분화인자인 PPARγ, 연골세포 주요 분화인자인 Sox9 등은 서로의 발현을 억제조절하며 분화를 유도한다(Yamashita S. et al., Exp Cell Res., 315(13), pp.2231-40, 2009, Charles A. et al., Exp Cell Res., 300(2), pp.406-17, 2004, David V. et al., Endocrinology., 148(5), pp.2553-62, 2007, Hill TP. et al., Dev Cell., 8(5), pp.727-38, 2005, Wang H. et al., J Bone Miner Res., 23(6), pp.939-48, 2008, Lengner CJ. et al., J Biol Chem., 280(16), pp.15872-9, 2005).

조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK(receptor activator of nuclear factor-κB)에 결합하면 파골 전구 세포가 거대 다핵 파골세포로 성숙화(maturation)되어 골 흡수(bone resorption)가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다(Theill LE. et al., Annu Rev Immunol., 20, pp.795-823, 2002; Wagner EF. et al., Curr Opin Genet Dev., 11, pp.527-532, 2001). 이러한 파골세포의 활성으로 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴가 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다(William J. et al., Nature., 423, pp.337342, 2003). 한편 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침척물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다(Stains JP. et al., Birth Defects Res C Embryo Today., 75(1), pp.72-80, 2005). 뼈가 파괴되기 시작하여 다시 새로운 뼈로 재형성되기까지는 약 100일 정도 걸린다(Schwarz EM. et al., Curr Opin Orthop., 11, pp.329-335, 2000). 유아에서는 1년 내에 뼈의 칼슘이 100% 바뀌지만 성인에서는 매년 골격의 약 10~30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다.

이러한 두 과정 즉, 골흡수와 골형성은 서로 밀접하게 연결되어 이루어지고 골의 정상적인 구조를 유지하는 데 중요하다. 한편, 고령화 사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증(osteoporosis)은 여러 가지 원인에 의하여 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조의 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하는 질환으로 뼈를 구성하는 미네랄(특히, 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다(Iqbal MM., South Med J., 93(1),pp.2-18, 2000). 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 수 있는 상태로 진행된다(Stepan JJ. et al., Endocr Regul., 37(4), pp.225-238, 2003). 골다공증은 폐경기의 시작과 동시에 급속한 골 손실(년간 2~3%)이 나타나며 척추의 압박 및 손목뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 폐경기 이후의 골다공증(Postmenopausal osteoporosis), 70세 이상의 남녀 노인에게 서서히 발생하며(연간 0.5~1%) 골반골(hip bone)과 척추뼈의 점진적인 골손실을 가져오는 노년기의 골다공증(Senile osteoporosis), 그리고 연령에 상관없이 질병(내분비질환, 위장관질환, 악성종양)이나 약물(부신피질호르몬, 항암화학요법, 갑상선호르몬, 항경련제, 항응고제, methotexate, cyclosporine, GnRH 등), 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 2차 골다공증(Secondary osteoporosis)으로 분류된다(Rosen CJ., N Engl J Med., 353(6), pp.595-603, 2005; Davidson M., Clinicain Reviews., 12(4), pp.75-82, 2002). 평균 수명이 70세를 넘어서서 선진국 수준에 도달하고 있는 우리나라도 골다공증에 대한 사회적·의학적 관심이 증가하고 있다. 그리하여 부작용이 적은 천연물질의 골다공증 억제에 대한 관심이 증대되고 있다.

조각자는 조각자 나무의 가시부분으로써 조각자 나무(Gleditsia sinensis Lam.; GS)는 콩과에 속하는 낙엽 교목으로 곳곳에 가시가 존재하며, 잎은 어긋나고 1~2회 깃꼴 겹이다. 특히, 가시는 조각자라 하여 시기와 상관없이 채취가 가능하며, 외용약으로 쓰는 경우에 가루를 내어 뿌리거나 기초제에 개어 바른다. 약리 실험 결과 평활근 진경 작용, 혈압 강하 작용, 호흡 중추에 대한 흥분 작용이 밝혀졌으며, 항암 효과, 항균 효과, 미백 효과, 항 HIV효과 등의 활성이 보고되었다. 그러나, 조각자 추출물의 파골세포 억제 활성에 의한 골다공증과 같은 골질환 예방 또는 치료 효과에 대해서는 개시되거나 교시된 바 없다.

또한, 자소자(Perillae semen; PS)는 차조기(Perilla frutescens L. Britton var. acuta KUDO.)의 열매로써 난원형 또는 구형에 가까우며 지름 0.6~2mm이다. 바깥면은 회갈색 또는 진한 회갈색이고 약간 융기된 그물무늬가 있다. 기부는 약간 뾰족하고 흰색의 점 모양인 열매꼭지 자국이 있다. 열매껍질은 얇고 누르면 쉽게 부서진다. 씨껍질은 막질이고 떡잎은 기름이 풍부하다. 거의 냄새가 없으나 씹으면 특유한 향기가 있고 맛은 텁텁하고 약간 맵다. 외용약으로 쓰는 경우 가루를 내어 뿌리거나 기초제에 개어 바른다. 약리 실험 결과 평활근 진경 작용, 혈압 강하 작용, 호흡 중추에 대한 흥분 작용이 밝혀졌으며, 항암 효과, 항균 효과, 미백 효과, 항 HIV효과 등의 활성이 보고되었다. 강활, 인진, 소엽 혼합 추출물의 연골세포 재생에 관하여 등록된 특허(대한민국 등록번호 제10-0595735호)는 있으나, 자소자 추출물의 파골세포 분화억제에 의한 골질환 예방 또는 치료 효과에 대해서는 개시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 일상생활에서 약용 또는 식용으로 이용되고 있는 천연물에 대한 생리활성 물질을 규명하기 위해 파골세포 분화 억제 효과를 시험하던 중 자소자와 조각자의 추출복합물이 이러한 활성이 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 특허등록 제0595735호(발명의 명칭: 연골재생 및 골관절염 치료용 생약 조성물, 2006.06.30 공고)

본 발명은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 자소자와 조각자 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물, 식품 조성물, 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 식품 조성물, 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 등을 제공하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

자소자 추출물은 차조기의 다양한 기관(예컨대, 잎, 줄기, 뿌리 또는 종자)로부터 추출하여 얻은 것으로서, 가장 바람직하게는 차조기의 종자로부터 추출하여 얻은 것을 말한다. 자소자 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는, (a)물, (b)탄소수1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c)상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d)아세톤, (e)에틸 아세테이트, (f)클로로포름, (g)1,3-부틸렌글리콜, (h)헥산, (i)디에틸에테르 또는 (j)부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 자소자 추출물은 물 또는 저급 알코올, 보다 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올, 가장 바람직하게는 물을 용매로 하여 얻어진 것이다. 그러나 이에 한정되는 것이 아니다.

상기 자소자 추출물은 추출에 의해 수득되는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 수득되는 건조물 또는 추출액의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.

물을 이용하여 자소자 추출물을 얻는 방법을 좀 더 구체적으로 살펴보면, 시료인 자소자를 5~10배 가량의 물을 이용하여 100℃ 1회 내지 2회 반복 추출한다. 추출액을 여과지를 사용하여 1회 이상 여과하고 동결건조한 후 분말화하여 이를 시료로 사용하는 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 자소자 추출물을 제조할 수 있는 어떤 통상적인 방법을 사용하더라도 무방하다.

또한, 조각자 추출물은 조각자나무의 다양한 기관(예컨대, 잎, 줄기, 뿌리 또는 가시)로부터 추출하여 얻은 것으로서, 가장 바람직하게는 조각자나무의 가시로부터 추출하여 얻은 것을 말한다. 조각자 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는, (a)물, (b)탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c)상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d)아세톤, (e)에틸 아세테이트, (f)클로로포름, (g)1,3-부틸렌글리콜, (h)헥산, (i)디에틸에테르 또는 (j)부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 조각자 추출물은 물 또는 저급 알코올, 보다 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올, 가장 바람직하게는 에탄올을 용매로 하여 얻어진 것이나, 이에 한정되는 것이 아니다.

상기 조각자 추출물은 추출에 의해 수득되는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 수득되는 건조물 또는 추출액의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.

에탄올을 이용하여 조각자 추출물을 얻는 방법을 구체적으로 살펴보면, 시료인 조각자를 5~10배 가량의 70%　에탄올을 이용하여 70℃ 1회 내지 2~3회 반복 환류추출한다. 상기 추출액을 여과지를 사용하여 1회 이상 여과하고 회전감압농축기로 농축하여 동결건조한 후 분말화하여 이를 시료로 사용하는 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 조각자 추출물을 제조할 수 있는 어떤 통상적인 방법을 사용하더라도 무방하다.

본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물은 자소자 추출물과 조각자 추출물을 9:1의 중량비로 혼합하여 제조한다. 왜냐하면, 상기 자소자 추출물은 조골세포 분화촉진과 파골세포 분화억제 활성을 모두 가지나, 파골세포 분화 억제 활성에 비하여 조골세포 분화 촉진 활성이 더 우수한데 반하여, 상기 조각자 추출물은 파골세포 분화 억제 활성은 매우 뛰어나나 조골세포에는 영향이 없기 때문에 파골세포에 의한 뼈 파괴 억제와 조골세포에 의한 뼈 형성 효과를 극대화하기 위하여 자소자 추출물과 조각자 추출물의 혼합비율을 9:1로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제활성에 의한 골다공증의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하여 약학 조성물로 제제화될 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다.

본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제활성에 의한 골다공증 개선용 식품 조성물은 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 등의 형태로 제공될 수 있으며, 식품 조성물에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제가 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 발효유는 유산균 배양액, 혼합과즙시럽 및 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물을 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 제조한다.

상기 본 발명의 기능성 음료는 혼합과즙시럽, 자소자와 조각자의 추출복합물 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성 음료를 제조한다.

상기 본 발명의 건강기능식품은 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물에 영양보조성분(비타민 B₁, B₂, B₅, B₆, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합한 후 상기 혼합물에 멸균 정제수를 첨가·혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형한다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조한다.

본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물은 파골세포의 형성 및 활성을 효과적으로 억제하므로 골다공증 예방 및 치료에 유용한 의약품, 건강기능식품 등으로 널리 이용될 수 있다.

도 1은 염증성 두개골 흡수 모델의 두개골에 있는 파골세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 염증성 두개골 흡수 모델의 두개골에 파골세포에 의하여 골흡수된 영역을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 염증성 두개골 흡수 모델의 두개골 절편을 나타낸 것이다.
도 4는 난소제거 골다공증 모델의 장골을 microCT 방법을 사용하여 나타낸 것이다.
도 5는 난소제거 골다공증 모델의 뼈의 부피를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 난소제거 골다공증 모델의 무층골의 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 난소제거 골다공증 모델의 골밀도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 난소제거 골다공증 모델의 장골을 조직형태학적으로 무층골을 100배 확대하여 찍은 것이다.
도 9는 난소제거 골다공증 모델의 장골을 조직형태학적으로 장골 전체를 40배로 확대하여 찍은 것이다.
도 10은 난소제거 골다공증 모델의 장골에 있는 파골세포 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 난소제거 골다공증 모델의 혈액 내 TRAP5b를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

자소자와 조각자의 추출복합물의 제조

1-1. 자소자 열수 추출물의 제조

자소자에 5~10배의 물을 가하여 100℃에서 2시간 가열하는 과정을 2회 반복하여 추출한 다음, 상기 추출액을 와트만 No.3. 여과지를 사용하여 2회 여과하고 동결 건조하여 분말화하여 제조하였다.

1-2. 70% 에탄올에 의한 조각자 추출물의 제조

조각자에 5~10배의 물과 에탄올의 혼합액(70% 에탄올)을 가하여 70~80℃에서 2~5시간 동안 2회 반복하여 추출한 다음, 상기 추출액을 와트만 No.3. 여과지를 사용하여 2회 여과하고 회전감압 농축기(EYELA,NE-1001, Japan)로 농축하여 동결 건조하여 분말화하여 제조하였다.

1-3. 자소자와 조각자의 추출복합물의 제조

상기 실시예 1-1의 자소자 추출물과 실시예 1-2의 조각자의 추출물을 9:1의 중량비로 혼합하여 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS: Gleditsia sinesis + Perilla semen)을 제조하여 시료로 사용하였다.

<실시예 2>

자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물의 제조

액제의 제조

상기 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 100㎎, 이성화당 10g, 만니톨 5g을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

캡슐제의 제조

상기 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 100㎎에 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<실시예 3>

자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조

본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.65~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brix^o)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP 배지에서의 총 유산균수가 1.0 ⅹ 10⁹cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.

그런 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix^o 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.

그런 다음, 상기 유산균배양액 69.5중량%와 상기 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 발효유를 제조하였다.

<실시예 4>

자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조

본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 및 혼합과즙시럽으로 구성된 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix^o 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.

그리고 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.

<실시예 5>

자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조

상기 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B₁, B₂, B₅, B₆, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기의 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.

<시험예 1>

염증성 두개골 흡수 모델을 통한 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)의 파골세포 수 및 뼈의 소실 억제정도 측정

염증성 두개골 흡수모델을 사용하여 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)의 골다공증 예방 및 치료에 대한 효능을 관찰하였다.

5~6주된 C57BL/6J 수컷 마우스를 (주)중앙실험동물을 통해 일본의 SLC, Inc.로 부터 구입하여 SPF 시설에서 2~3일 동안 안정화하였다. 본 시험에 사용된 마우스는 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 조명시간 12시간(08:00 점등~20:00 소등)으로 자동 온·습도 조절 장치가 설치된 이화여자대학교 자연과학부 동물실에서 순화 및 사육되었다. 사육 환경은 전 시험기간 동안 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 인정하지 않았다. 시험기간 중 동물실의 온·습도는 자동 온·습도 조절장치에 의해 조절되었으며 환경조건은 정기적으로 측정하였다. 실험동물은 전 시험기간 동안 폴리카보네이트제 사육상자에 5마리 이하씩 수용하였다. 개체식별은 유성매직펜을 이용한 미부표식법과 사육상자별 개체식별카드표지법을 이용하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(PMI Nutritional International, 505 North 4th street Richmond, In 47374, USA)를 방사선조사(13.2 kGy)로 멸균하여 자유 섭취시키고, 물은 상수도수를 물병을 이용하여 자유섭취시켰다.

Sham	LPS+	LPS+GPS
PBS	LPS 12.5mg/kg + PBS	LPS 12.5mg/kg + PBS + GPS 25mg/kg

상기 표 1과 같이, 'Sham'은 음성대조군으로서 용매로 사용된 인산완충식염수(Phosphate buffer saline; PBS)를 마우스의 두개골과 표피 사이에 주입하였고, 'LPS+'은 양성대조군으로서 지질다당체(Lipopolysaccharide; LPS)를 용매인 PBS로 녹여 12.5mg/kg의 농도로 마우스의 두개골과 표피 사이에 주입하였으며, 'LPS+GPS'은 상기 'LPS+'과 같은 조건에 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)을 25mg/kg의 농도로 마우스의 두개골과 표피 사이에 주입하였다.

LPS의 두개골 주입은 실험 첫날과 셋째 날에 2회 투여하였고, 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)의 두개골 주입은 실험 첫날부터 하루 간격으로 5회 투여하였다. 마지막 투여 후, 다음 날에 마우스의 두개골을 적출하여 뼈 파괴 정도를 분석하였다.

실험 종료 후 적출한 두개골의 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 양성 세포(파골세포)의 수 및 뼈의 소실 정도를 측정하여 통계적 유의성 검정을 통해 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여군인 'LPS+GPS'과 대조군인 'Sham'과 'LPS+'의 차이를 비교하였다.

적출한 두개골은 탈석회 과정을 거친 후 파라핀에 넣어서 블락을 만들어 굳히고 마이크로톰(microtom)을 사용하여 4μm 두께로 절편을 제작하였다. 절편된 시료는 크실렌(xylene)과 에탄올(ethanol)을 이용하여 파라핀을 녹인 후, 파골세포 표지인자인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 실시하였다. TRAP staining kit은 SIGMA에서 구입하여 사용하였다. 대조 염색으로는 핵을 염색하는 헤마톡실린(hematoxylin) 염색을 실시한 후, 마운팅(mounting) 용액으로 고정하여 현미경으로 관찰하였다.

그 결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 파골세포 수는 평균 약1.8개였으나, 양성대조군(LPS+)의 파골세포 수는 약 13.7개로 증가한 것을 알 수 있었다. 이렇게 증가된 파골세포의 수가 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(LPS+GPS)에서 약 2.1개로 감소된 것을 확인할 수 있었다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 골표면당 마모된 비율은 약 21% 정도였으나, 양성대조군(LPS+)의 골표면당 마모된 비율은 약 77%로 증가한 것을 알 수 있었다. 이렇게 증가된 골표면당 마모된 비율이 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(LPS+GPS)에서 약 23%로 감소된 것을 확인할 수 있었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 두개골 절편을 보면 붉은색으로 염색(TRAP 염색)된 파골세포가 거의 보이지 않으며 두개골이 파괴되지 않은 온전한 모양을 갖추고 있으나, 양성대조군(LPS+)의 두개골 절편을 보면 붉은색으로 염색(TRAP 염색)된 파골세포가 많이 보이며 골흡수로 온전한 모양을 유지하지 못하고 뼈 안의 빈공간이 많이 보이는 것을 알 수 있었다. 이렇게 늘어난 파골세포와 뼈 안의 빈공간은 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(LPS+GPS)에서는 거의 없어진 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 2>

난소제거 골다공증 모델을 통한 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)의 BV, BV/TV, Tb.N, BMD 및 골흡수도 측정

난소제거 골다공증모델을 사용하여 표 2와 같은 방식으로 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)의 골다공증 예방 및 치료에 대한 효능을 관찰하였다.

음성대조군	난소절제 양성대조군	에스트라디올 처리 양성대조군	실험군
Sham	OVX	OVX mice + Estradiol10㎍/kg	OVX mice + GPS 50mg/kg

실험동물로는 8주령 C57BL/6J 암컷 생쥐를 ㈜중앙실험동물을 통해 일본의 SLC, Inc로부터 구입하여 SPF 동물시설에서 사육하였다. 사육실에서 적응기간을 거친 후 난소제거수술 후 1주간의 회복 기간을 주었다.

회복기 이후, 상기 표 2와 같이 수술한 흔적만 남긴 음성대조군 'Sham', 난소제거 수술을 한 난소절제 양성대조군 'OVX', 난소절제수술 후 뼈 파괴 억제 효능이 알려진 에스트라디올(estradiol)을 10㎍/kg 처리한 에스트라디올 처리 양성대조군 'OVX+Estradiol', 상기 난소절제 양성대조군 'OVX'에 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물을 50mg/kg으로 구강 투여한 실험군 'OVX+GPS'의 4개의 실험군(각 군당 n=10)으로 실험하였다. 이때, 에스트라디올과 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물은 매주 6회씩 8주간 경구투여하였다.

각 동물은 케이지당 5마리씩 사육하고 사육실의 환경은 항온, 항습 및 12시간 간격의 광주기로 일정한 조건을 유지하였다. 사육 기간 동안 4주 및 8주차에서 eye bleeding을 통하여 소량의 혈액을 채취하였다. 실험 종료 후 적출한 장골(다리뼈)의 밀도 차이를 측정하여 통계적 유의성 검정을 통해 본 발명의 자소자와 조각자 추출복합물 투여군 'OVX+GPS와 대조군 'Sham', 'OVX', 'OVX+Estradiol'의 차이를 비교분석하였다.

적출한 장골은 microcomputed tomography(micro-CT)를 통하여 BV(Bone volume), BV/TV(Percent bone volume), Tb.N(Trabecular number), BMD(Bone mineral density)를 측정하여 통계처리를 통해 분석하였다.

그리고, 장골의 조직염색 슬라이드를 Osteomeasure 소프트웨어를 이용하여 bone histomorphometry 분석을 실시하였다. 이 결과를 통해 육안으로 골조직을 관찰함으로써 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물의 효과를 측정하였다. 즉, 장골 조직편의 파라핀 block을 만들어 5μm 두께로 절단하여 TRAP과 헤마톡실린(hematoxylin) 염색을 실시하였다. TRAP은 파골세포를 표지하고 헤마톡실린(hematoxylin)은 핵을 염색함으로써 조직편 내에 있는 세포의 확인을 가능하게 한다. 획득된 각각의 영상은 X100 배율로 얻은 것이며 실험군별로 무층골(trabecular bone)의 변화를 잘 보여주고 있다.

또한, 파골세포의 활성도 지표인 Tartrate-resistant acid phosphatase 5b(TRAP5b)를 혈청으로부터 분석하여 골흡수도를 측정하였다. 분석은 Immunodiagnostic Systems Ltd., Boldon, UK에서 나온 ELISA kit를 사용하였다.

그 결과를 도 4 내지 도 11에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 Micro CT 사진을 보면 정상적인 뼈의 모습을 확인할 수 있으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 골소실이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 이러한 골소실이 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 회복되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 골소실이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 Bone volume/Total volume(BT/TV)을 보면 약 4.8%인 것을 알 수 있으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 약 2.5%로 감소한 것을 알 수 있었다. 이렇게 난소절제로 인하여 감소된 BT/TV는 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 약 3.9%로 증가한 것을 알 수 있었으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 약 3.7%로 증가한 것을 알 수 있었다.

도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 무충골(Trabecular bone)의 수는 약 0.61개였으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 0.33개로 감소된 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 감소된 무층골의 수(Tb.N)는 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 0.49개로 증가하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 약 0.47개로 증가한 것을 알 수 있었다.

도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 골밀도(Bone mineral density)는 약 0.09였으나 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 약 0.053으로 감소된 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 감소된 골밀도(BMD)는 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 약 0.075로 증가하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 약 0.072로 증가한 것을 알 수 있었다.

도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 무충골을 100배로 확대하여 살펴보면, 음성대조군(Sham)의 무충골은 수직으로 길게 뻗어져 있는 것을 확인할 수 있으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 거의 잘 보이지 않는 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 감소된 무충골은 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 수직으로 길게 뻗어져 증가하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 무층골이 길게 뻗어져 증가한 것을 알 수 있었다.

도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 장골 전체를 40배로 확대하여 살펴보면, 음성대조군(Sham)의 무층골은 전반적으로 수직으로 길게 있는 것을 확인할 수 있으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 거의 잘 보이지 않는 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 감소된 무충골은 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 수직으로 길게 뻗어져 증가하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 무층골이 길게 뻗어져 증가한 것을 알 수 있었다.

도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 장골의 파골세포를 세어보면, 음성대조군(Sham)의 파골세포 수는 약 5.5개인 것을 확인할 수 있으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 약 9.3개로 증가된 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 증가된 파골세포는 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 약 6.0개로 감소하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 약 7.1개로 감소된 것을 알 수 있었다.

도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혈청 내 파골세포의 바이오마커인 TRAP5b를 측정하면, 음성대조군(Sham)의 혈청 내 TRAP5b은 약 5.8이었으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 약 6.6으로 증가된 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 증가된 혈청 내 TRAP5b는 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 약 5.1로 감소된 것을 확인하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 약 5.3으로 감소된 것을 알 수 있었다.

Claims

자소자 추출물과 조각자 추출물을 9:1의 중량비로 혼합하여 제조된 파골세포 분화 억제활성을 갖는 자소자와 조각자의 추출복합물.
제1항에 있어서,
상기 자소자 추출물은 열수 추출물이고, 조각자 추출물은 70% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 파골세포 분화 억제활성을 갖는 자소자와 조각자의 추출복합물.
제1항 또는 제2항의 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제활성에 의한 골다공증 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제1항 또는 제2항의 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제활성에 의한 골다공증 개선용 식품 조성물.
제4항에 있어서,
상기 식품 조성물은 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제활성에 의한 골다공증 개선용 식품 조성물.