KR101464267B1 - 파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 - Google Patents
파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조각자 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 골개형(bone remodeling)에 있어서 골생성(bone formation)에 대한 골흡수(bone resorption)의 증가로 인한 불균형에 따라 초래되는 골질환의 주된 원인이 되는 파골세포 활성 증가를 효과적으로 억제할 수 있는 조각자 추출물을 이용하여 노인들의 골질환이나 여성들의 폐경기로 인해 발생하는 골질환 개선에 도움을 줄 수 있는 약학조성물, 발효유, 건강기능식품에 유용하게 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 골개형(bone remodeling)에 있어서 골생성(bone formation)에 대한 골흡수(bone resorption)의 증가로 인한 불균형에 따라 초래되는 골질환의 주된 원인이 되는 파골세포 활성 증가를 효과적으로 억제할 수 있는 조각자 추출물(Gleditsia sinensis Lam.) 및 상기 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 골강화 또는 성장발육 촉진용 약제학적 조성물, 식품조성물 등에 관한 것이다.
뼈(bone)는 세포와 콜라겐성 기질 그리고 무기질 성분으로 구성되어진 매우 복잡한 조직이다. 이들은 중요한 장기의 보호, 조혈화에 필요한 미세 환경제공과 같은 기본적이며 다양한 기능을 제공하여 준다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉, 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적· 지속적으로 반복 재생 하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골재형성(bone remodeling) 이라고 한다(Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso., 50(6Suppl), pp.664-669, 2005). 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다(Cohen-Solal M. et al., Therapie., 58(5), pp.391-393, 2003).
골재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK(receptor activator of nuclear factor-κB)에 결합하면 파골 전구세포가 거대 다핵 파골세포로 성숙화(maturation)되어 골 흡수(bone resorption)가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다(Theill LE. et al., Annu Rev Immunol., 20, pp.795-823, 2002; Wagner EF. et al., Curr Opin Genet Dev., 11, pp.527-532, 2001). 이러한 파골세포의 활성으로 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴가 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다(William J. et al., Nature., 423, pp.337342, 2003).
한편 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침척물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다(Stains JP. et al., Birth Defects Res C Embryo Today., 75(1), pp.72-80, 2005). 뼈가 파괴되기 시작하여 다시 새로운 뼈로 재형성되기까지는 약 100일 정도 걸린다(Schwarz EM. et al., Curr Opin Orthop., 11, pp.329-335, 2000). 유아에서는 1년 내에 뼈의 칼슘이 100% 바뀌지만 성인에서는 매년 골격의 약 10~30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다.
이러한 두 과정 즉, 골흡수와 골형성은 서로 밀접하게 연결되어 이루어지고 골의 정상적인 구조를 유지하는 데 중요하다. 한편, 고령화 사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증(osteoporosis)은 여러 가지 원인에 의하여 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조의 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하는 질환으로 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다(Iqbal MM., South Med J., 93(1),pp.2-18, 2000). 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 수 있는 상태로 진행된다(Stepan JJ. et al., Endocr Regul., 37(4), pp.225-238, 2003). 골다공증은 폐경기의 시작과 동시에 급속한 골 손실(년간 2~3%)이 나타나며 척추의 압박 및 손목뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 폐경기 이후의 골다공증(Postmenopausal osteoporosis), 70세 이상의 남녀 노인에게 서서히 발생하며(연간 0.5~1%) 골반골(hip bone)과 척추뼈의 점진적인 골손실을 가져오는 노년기의 골다공증(Senile osteoporosis), 그리고 연령에 상관없이 질병(내분비질환, 위장관질환, 악성종양)이나 약물(부신피질호르몬, 항암화학요법, 갑상선호르몬, 항경련제, 항응고제, methotexate, cyclosporine, GnRH 등), 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 2차 골다공증(Secondary osteoporosis)으로 분류된다(Rosen CJ., N Engl J Med., 353(6), pp.595-603, 2005; Davidson M., Clinicain Reviews., 12(4), pp.75-82, 2002).
평균 수명이 70세를 넘어서서 선진국 수준에 도달하고 있는 우리나라도 골다공증에 대한 사회적· 의학적 관심이 증가하고 있다. 그리하여 부작용이 적은 천연 물질의 골다공증 억제에 대한 관심이 증대되고 있다. 조각자는 조각자 나무의 가시부분으로써 조각자 나무(Gleditsia sinensis Lam.;GS)는 콩과에 속하는 낙엽 교목으로 곳곳에 가시가 존재하며 잎은 어긋나고 1~2회 깃꼴 겹이다. 특히 가시는 조각자라 하여 시기와 상관없이 채취가 가능하며, 외용약으로 쓰는 경우 가루를 내어 뿌리거나 기초제에 개어 바른다. 약리 실험 결과 평활근 진경 작용, 혈압 강하 작용, 호흡 중추에 대한 흥분 작용이 밝혀졌으며, 항암 효과, 항균 효과, 미백 효과, 항 HIV효과 등의 활성이 보고되었다. 그러나 조각자 추출물의 파골세포 억제 활성에 의한 골다공증과 같은 골질환 예방 또는 치료 효과에 대해서는 개시되거나 교시된 바 없다.
이에 본 발명자들은 일상생활에서 약용 또는 식용으로 이용되고 있는 천연물에 대한 생리활성 물질을 규명하기 위해 마우스의 골수세포를 이용한 파골세포 분화과정 중 천연물 추출물을 처리하여 파골세포 분화 및 TRAP(Tartrate-resistance acid phosphatase; 이하, "TRAP"라 약칭한다) 활성을 측정하는 방법을 통해 파골세포의 분화억제능을 검색하던 중 조각자 추출물이 이러한 활성이 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물 및 상기 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물, 식품조성물, 발효유, 건강기능식품 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물 및 상기 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물, 식품조성물, 발효유, 건강기능식품을 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 유효성분으로 이용되는 추출물의 소스(source)로서의 조각자 나무(Gleditsia sinensis Lam.)는 콩과의 갈잎큰키나무이다. 본 발명의 조각자 추출물은 조각자나무의 다양한 기관(예컨대, 잎, 줄기, 뿌리 또는 가시)로부터 추출하여 얻은 것으로서, 가장 바람직하게는 조각자나무의 가시로부터 추출하여 얻은 것을 말한다.
본 발명의 조각자 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는, (a)물, (b)탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c)상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d)아세톤, (e)에틸 아세테이트, (f)클로로포름, (g)1,3-부틸렌글리콜, (h)헥산, (i)디에틸에테르, 또는 (j)부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조각자 추출물은 물 또는 저급 알코올, 보다 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올, 가장 바람직하게는 에탄올을 용매로 하여 얻어진 것이나, 이에 한정되는 것이 아니다.
상기 조각자 추출물은 추출에 의해 수득되는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 수득되는 건조물 또는 추출액의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.
에탄올을 이용하여 조각자 추출물을 얻는 방법을 구체적으로 살펴보면, 시료인 조각자를 5~10배 가량의 70% 에탄올을 이용하여 70℃에서 3회 반복 환류추출한다. 상기 추출액을 여과지를 사용하여 1회 이상 여과하고 회전감압농축기로 농축하여 동결건조한 후 분말화하여 이를 시료로 사용하는 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 조각자 추출물을 제조할 수 있는 어떤 통상적인 방법을 사용하더라도 무방하다.
본 발명의 파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하여 약학 조성물로 제제화될 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다.
상기 골질환은 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 신부전 환자의 신성골이영양증, 류마티스성 또는 퇴행성 골질환, 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 구성된 그룹에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 골강화 또는 성장발육 촉진용 식품 조성물은 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 등의 형태로 제공될 수 있으며, 식품 조성물에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제가 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 발효유는 유산균 배양액, 혼합과즙시럽 및 본 발명의 조각자 추출물을 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 제조한다.
상기 본 발명의 파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 본 발명의 조각자 추출물에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합한 후 상기 혼합물에 멸균 정제수를 첨가· 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형한다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조한다.
본 발명의 조각자 추출물은 TRAP 효소의 활성을 저해하여 궁극적으로는 파골세포의 분화를 억제함으로써 골개형(bone remodeling)에 있어서 골생성(bone formation)에 대한 골흡수(bone resorption)의 증가로 인한 불균형에 따라 초래되는 골질환, 예를 들어 노인들의 골질환이나 여성들의 폐경기로 인해 발생하는 골 질환을 개선할 수 있는 약학적 조성물, 기능성 식품 등에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 마우스 두개골 골아세포의 세포독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 열수 추출물의 마우스 두개골 골아세포의 세포독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 마우스 두개골 골아세포주인 MC3T3-E1 세포주의 세포 독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 열수 추출물의 마우스 두개골 골아세포주인 MC3T3-E1 세포주의 세포 독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 인간 조골세포주인 HOS 세포주의 세포 독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 열수 추출물의 인간 조골세포주인 HOS 세포주의 세포 독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 RANKL-유도 파골세포 분화 억제 영향을 사진으로 나타낸 것이다.
도 8은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 열수 추출물의 RANKL-유도 파골세포 분화 억제 영향을 사진으로 나타낸 것이다.
도 9는 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 공동배양-유도 파골세포 분화 억제 영향을 사진으로 나타낸 것이다.
도 10은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 RANKL-유도 파골세포 분화 억제된 거대 다핵 파골세포 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 RANKL-유도 파골세포의 TRAP 활성 억제를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 열수 추출물의 마우스 두개골 골아세포의 세포독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 마우스 두개골 골아세포주인 MC3T3-E1 세포주의 세포 독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 열수 추출물의 마우스 두개골 골아세포주인 MC3T3-E1 세포주의 세포 독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 인간 조골세포주인 HOS 세포주의 세포 독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 열수 추출물의 인간 조골세포주인 HOS 세포주의 세포 독성에 대한 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 RANKL-유도 파골세포 분화 억제 영향을 사진으로 나타낸 것이다.
도 8은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 열수 추출물의 RANKL-유도 파골세포 분화 억제 영향을 사진으로 나타낸 것이다.
도 9는 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 공동배양-유도 파골세포 분화 억제 영향을 사진으로 나타낸 것이다.
도 10은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 RANKL-유도 파골세포 분화 억제된 거대 다핵 파골세포 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 조각자 70% 에탄올 추출물의 RANKL-유도 파골세포의 TRAP 활성 억제를 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것인 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
조각자 추출물의 제조
1-1. 조각자의 열수추출물의 제조
조각자에 5~10배의 물을 가하여 100℃에서 2시간 가열하는 과정을 2회 반복하여 추출한 다음, 상기 추출액을 와트만 No.3. 여과지를 사용하여 2회 여과하고 동결 건조하여 분말화하여 시료(GS Wt)로서 사용하였다.
1-2. 물과 에탄올의 혼합용매(70% 에탄올)에 의한 조각자의 추출물의 제조
조각자에 5~10배의 물과 에탄올의 혼합액(70% 에탄올)을 가하여 70~80℃에서 2~5시간 동안 2회 반복하여 추출한 다음, 상기 추출액을 와트만 No.3. 여과지를 사용하여 2회 여과하고 회전감압 농축기(EYELA,NE-1001, Japan)로 농축하여 동결 건조하여 분말화하여 시료(GS Et)로서 사용하였다.
<실시예 2>
조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조
액제의 제조
상기 실시예 1의 조각자 열수 추출물의 동결건조분말 혹은 조각자 70% 에탄올 추출물의 동결건조분말 100㎎, 이성화당 10g, 만니톨 5g을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
캡슐제의 제조
상기 실시예 1의 조각자 열수 추출물의 동결건조분말 혹은 조각자 70% 에탄올 추출물의 동결건조분말 100㎎에 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<실시예 3>
조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
본 발명의 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.65~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brixo)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP 배지에서의 총 유산균수가 1.0 ⅹ 109 cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.
그런 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그런 다음, 상기 유산균배양액 69.5중량%와 상기 실시예 1의 조각자 열수 추출물의 동결건조분말 혹은 조각자 70% 에탄올 추출물의 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 발효유를 제조하였다.
<실시예 4>
조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 1의 조각자 열수 추출물의 동결건조분말 혹은 조각자 70% 에탄올 추출물의 동결건조분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기의 실시예 1의 조각자 추출물 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<시험예 1>
조각자 추출물에 대한 조골세포의 세포독성 측정
1-1. 마우스 두개골 골아세포의 세포독성 측정
가. 골아세포의 준비
1 내지 2일령 된 신생 ICR 마우스로부터 전구골과 두정골을 무균적으로 적출하여 인산염완충용액(PBS)으로 씻어준 후, 0.1% 콜라게나제(collagenase, Gibco), 0.1% 디스파제(dispase, Gibco)가 포함된 효소용액에 연속적으로 6회 처리하고 조골세포의 특성을 지닌 세포들이 많이 존재하는 3 내지 6회군의 세포를 집중적으로 수집하여 배양액(serum free α-MEM)으로 세척하였다. 세척된 세포들을 10% FBS가 포함된 α-MEM에서 2일 정도 배양한 후 1차 계대 배양하여 모은 세포들을 실험에 사용하였고, 회수한 세포들을 1X106세포/㎖의 농도가 되도록 희석하여 -70℃에서 보관하였다.
나. 세포독성 측정
시료의 세포독성을 측정하기 위해 Green 등의 방법(Green LM, Reade JL, Ware CF. Rapid colometric assay for cell viability: Application to the quantitation of cytotoxic and growth inhibitory lympokines. J. Immunal. Meth. 70:257(1984))에 준하여 3-(4,5-디메틸-티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드[3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, MTT]분석을 실시하여 측정하였다.
구체적으로는 먼저 상기 배양한 마우스의 두개골 골아세포를 96 웰 플레이트(Well Plate)에 각 웰(well)당 1X104세포/200㎕ 농도로 분주하고 24시간 배양 후 배지를 제거하였다.
이와는 별도로 새로운 MEM 배지 200㎕에 상기 실시예 1의 조각자 열수 추출물의 동결건조분말 혹은 조각자 70% 에탄올 추출물의 동결건조분말을 각각 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100㎍/㎖의 농도로 녹이고, 이들을 상기 준비한 각 웰(Well)에 첨가하였다. 시료가 첨가된 배양액에서 48시간 배양한 후, MTT(5㎎/㎖) 용액 10㎕를 각 웰(Well)에 가하고 4시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 상등액을 제거하고 각 웰(Well)에 100㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 포마잔(formazan) 결정을 용해시켜 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내어 그 결과를 도 1과 도 2에 나타내었다. 대조군(Con)으로는 본 발명의 조각자 추출물을 첨가하지 않은 것을 사용하였다.
1-2. 마우스의 두개골 골아세포주인 MC3T3-E1 세포주의 세포독성 측정
가. 세포주의 준비
세포주로 사용된 MC3T3-E1(mouse pre-osteoblast)은 ATCC(CRL-2594)에서 분양받아 10% FBS(fetal bovine serum)와 1X 항생물질(antibiotics, Anti-Anti, Gibco 15240)을 첨가한 α-MEM(alpha-minimum essential medium, Gibco A10490) 배지를 이용하여 5% 이산화탄소(CO2)가 존재하는 인큐베이터에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다.
나. 세포독성 측정
마우스의 두개골 골아세포 대신 마우스의 두개골 골아세포주인 MC3T3-E1 세포주를 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 1-1의 세포독성 측정방법과 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다.
1-3. 인간 조골세포주인 HOS 세포주의 세포독성 측정
가. 세포주의 준비
세포주로 사용된 Hos cell(Human osteosarcoma cell)은 한국세포주 은행(KCLB-21543)으로부터 분양받아 10% FBS(fetal bovine serum)와 1X 항생물질(antibiotics, Anti-Anti, Gibco 15240)을 첨가한 α-MEM(alpha-minimum essential medium, Gibco A10490) 배지를 이용하여 5% 이산화탄소(CO2)가 존재하는 인큐베이터에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다.
나. 세포독성 측정
마우스의 두개골 골아세포 대신 인간 조골세포주인 HOS 세포주를 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 1-1의 세포독성 측정방법과 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과를 도 5와 도 6에 나타내었다.
도 1 부터 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 조각자 열수 추출물(GS Wt) 또는 조각자 70% 에탄올 추출물(GS Et)은 높은 농도로 처리하였을 때도 세포독성이 없음을 알 수 있었다.
<시험예 2>
조각자 추출물에 의한 파골세포 분화 억제 분석
본 발명의 조각자 추출물이 파골세포의 성장 및 활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 파골세포 전구세포를 배양하여 파골세포의 표지효소인 TRAP 염색 및 활성을 분석하였다.
2-1. 세포의 준비
가. 골수세포의 순수 분리
마우스 골수세포를 분리하기 위하여 6~9주 된 웅성 마우스를 경부염전으로 희생시킨 후, 대퇴골과 경골을 무균적으로 적출하고 연조직을 제거하며 장골의 양끝을 절단한 후 26G 주사침을 이용하여 한쪽 끝의 골수강에 0.1% 콜라게나제(Gibco), 0.05% 트립신 및 0.5mM EDTA(Gibco)가 포함된 효소용액 1㎖를 주사하여 골수를 꺼낸 후 30분간 교반하고 골수세포를 모아 10% FBS가 포함된 α-MEM(alpha-minimum essential medium)에 24시간 전 배양한 후 미부착 세포들을 모았다. 이 세포들을 후속 파골세포 분화를 위한 실험에 사용하였다.
나. 골아세포의 준비
1 내지 2일령 된 신생 ICR 마우스로부터 전구골과 두정골을 무균적으로 적출하여 인산염완충용액(PBS)으로 씻어준 후, 0.1% 콜라게나제(collagenase, Gibco), 0.1% 디스파제(dispase, Gibco)가 포함된 효소용액에 연속적으로 6회 처리하고 조골세포의 특성을 지닌 세포들이 많이 존재하는 3 내지 6회군의 세포를 집중적으로 수집하여 배양액(serum free α-MEM)으로 세척하였다. 세척된 세포들을 10% FBS가 포함된 α-MEM에서 2일 정도 배양한 후 1차 계대 배양하여 모은 세포들을 실험에 사용하였고, 회수한 세포들을 1X106 세포/㎖의 농도가 되도록 희석하여 -70℃에서 보관하였다.
2-2. 파골세포 분화
가. RANKL을 이용한 성숙한 파골세포로의 분화 유도
파골세포의 전구세포를 96웰 플레이트에 웰당 1X105개의 세포가 되도록 분주하여 배양하였다. 5일간 배양하는 동안 30ng/㎖ 대식세포집락자극인자(macrophage-colony stimulating factor; M-CSF, sigma)와 100ng/㎖ RANKL(Sigma)이 포함된 α-MEM에 상기 실시예 1의 조각자 열수추출물(GS Wt) 또는 조각자 70% 에탄올 추출물(GS Et)을 처리하며 배양하였다. 배양이 끝난 후 파골세포의 생성을 검사하기 위하여 세포를 고정하여 TRAP 염색을 시행하였다.
그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
나. 공동배양을 이용한 성숙한 파골세포로의 분화 유도
마우스의 두개골 세포와 파골세포 전구세포를 공동배양하기 위하여 각각을 따로 준비하여 공동배양 하였다. 마우스 두개골에서 뽑아낸 골아세포를 96웰 플레이트에 웰당 3X103개의 세포가 되도록 분주하여 배양하였다.
또한 파골세포의 전구세포가 되는 미부착 세포를 96웰 플레이트에 웰당 1X105개의 세포가 되도록 분주하여 골아세포와 공동배양하였다. 14일간 공동배양하는 동안 덱사메타손(dexamethasone, 10-7M, Sigma)과 비타민 D3(1α,25 dihydroxyvitamin D3, 10-8M, Sigma)가 포함된 α-MEM에 상기 실시예 1의 조각자 70% 에탄올 추출물(GS Et)을 처리하며 배양하였다. 배양이 끝난 후 파골세포의 생성을 검사하기 위하여 세포를 고정하여 TRAP 염색을 시행하였다.
그 결과를 도 9에 나타내었다.
2-3. TRAP 효소 이용한 파골세포 분화 억제 효과의 측정
TRAP 효소는 파골세포가 골 흡수작용을 할 때 효소의 분비가 증가되고 ATP, 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate)가 존재할 때 높은 활성을 가지는 효소로서 파골분화 정도를 측정할 수 있는 파골세포의 세포 화학적 표지효소(marker enzyme)이다. 한편, 파골세포는 골 내막에 위치하며 골 조직에 존재하는 유일한 다핵세포로, RANKL에 의해 분화 초기에는 단핵의 전 파골세포를 형성하지만 세포가 융합되어 다핵의 성숙 파골세포로 분화되면 골 표면에 흡착하여 주름막을 형성하는 특징을 가진다.
가. TRAP(+)인 다핵세포 형성 측정
TRAP 염색액에 양성반응을 가진 파골세포의 특성을 이용하여 성숙한 파골세포를 측정하는 마커(biomarker)로서 TRAP을 이용하였다. TRAP 염색액의 조제는 기질 나프톨 AS-MX 포스페이트(naphtol AS-MX phosphate, sigma) 5mg 및 색소(Fast Red Violet LB salt) 25mg을 N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide) 0.5㎖에 녹였다. 50mM 타르타르산(tartaric acid)을 포함하는 0.1N NaHCO3 완충액 50㎖(pH 5.0)을 첨가한 후 냉장보관하며 염색액으로 이용하였다. 10% 포름알데히드로 고정한 세포에 상기 제조한 염색액을 70㎕씩 분주하고 현미경으로 관찰하였다.
그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 7 내지 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 조각자 열수추출물 및 조각자 70% 에탄올 추출물은 저농도부터 고농도까지 농도 의존적으로 파골세포 분화 억제 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.
나. TRAP 활성 분석
TRAP 염색은 기질인 나프톨 AS-MX 포스페이트(naphtohol AS-MX phosphate)와의 반응산물을 fast red violet LB로 염색하여 확인하는 방법으로 다핵의 파골세포를 관찰할 수 있다.
96웰 플레이트에 웰당 1×105 개의 세포가 되도록 접종하고 분화인자인 100ng/㎖ RANKL 및 30ng/㎖ M-CSF와 상기 실시예 1의 조각자 70% 에탄올 추출물(GS Et)을 처리하여 4일간 배양하였다. 배지를 제거하여 dulbecco's PBS(phosphate buffer saline)로 세척한 다음 10% 포름알데히드로 고정한 세포에 기질 용액[1.36 mg/mL 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, 10 mM tartrate, 50mM citrate buffer(pH 4.6)]을 100㎕씩 분주하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 효소 반응액을 새로운 플레이트(plate)에 옮기고 0.1 N-NaOH로 반응을 중지시켜 405nm에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.
그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 조각자 70% 에탄올 추출물은 비교적 낮은 농도에서도 우수한 파골세포의 TRAP 활성 억제 효과를 가짐을 알 수 있었다.
Claims (7)
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- 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화억제 활성에 의한 골다공증 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
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- 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화억제 활성에 의한 골다공증 개선용 식품 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 식품 조성물은 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화억제 활성에 의한 골다공증 개선용 식품 조성물.
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