WO2016017851A1 - 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 - Google Patents

자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 Download PDF

Info

Publication number
WO2016017851A1
WO2016017851A1 PCT/KR2014/008739 KR2014008739W WO2016017851A1 WO 2016017851 A1 WO2016017851 A1 WO 2016017851A1 KR 2014008739 W KR2014008739 W KR 2014008739W WO 2016017851 A1 WO2016017851 A1 WO 2016017851A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
extract
bone
engraver
jajaja
active ingredient
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/008739
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김태열
라제현
심재헌
Original Assignee
주식회사 한국야쿠르트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 한국야쿠르트 filed Critical 주식회사 한국야쿠르트
Publication of WO2016017851A1 publication Critical patent/WO2016017851A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/483—Gleditsia (locust)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender

Definitions

  • the present invention relates to an extract complex of porcelain and engraver and a product containing the same as an active ingredient, more specifically, an extract complex of porcelain and engraver having osteoclast differentiation inhibitory activity and a pharmaceutical containing the same as an active ingredient A composition, fermented milk, a functional beverage, and a nutraceutical.
  • Osteoporosis is a disease caused by the excessive balance of bone resorption and bone formation, which is caused by excessive bone resorption. Osteoporosis is caused by a decrease in the amount of lime in bone tissue, resulting in thinning of the bone. As your symptoms progress, your bones will weaken and you will be able to fracture even with a small impact. Bone tissue is a dynamic tissue that is formed by osteoblasts and constantly breaks down and absorbed by osteoclasts.
  • Bone remodeling Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso., 50 (6Suppl), pp.
  • osteoblast that produces bone
  • osteoblast that destroys bone
  • mesenchymal stem cells are differentiated into osteoblasts, myoblasts, adipocytes, fibroblasts and chondrocytes.
  • Hematopoietic stem cells are differentiated, osteoclasts, macrophages, T cells, B cells, dentritic cells, basophils, eosinophils. (eosinophile), neutrophile (neutrophile), platelets (platelet), red blood cells (Red blood cells).
  • Runx2 a major osteoblast differentiation factor, MyoD, a major differentiation factor for myoblasts, PPAR, a major differentiation factor for adipocytes, and Sox9, a major differentiation factor for chondrocytes, inhibit the expression of each other and induce differentiation (Yamashita S. et al. Exp Cell Res., 315 (13), pp.2231-40, 2009, Charles A. et al., Exp Cell Res., 300 (2), pp.406-17, 2004, David V. et al. , Endocrinology., 148 (5), pp.2553-62, 2007, Hill TP. Et al., Dev Cell., 8 (5), pp.727-38, 2005, Wang H. et al., J Bone Miner Res., 23 (6), pp. 939-48, 2008, Lengner CJ. Et al., J Biol Chem., 280 (16), pp. 15872-9, 2005).
  • Osteoblasts produce RANKL (receptor activator of nuclear factor-B ligand) and osteoprotegerin (OPG), which is its decoy receptor.
  • RANKL receptor activator of nuclear factor-B ligand
  • OPG osteoprotegerin
  • BAN nuclear factor
  • osteoclast progenitors mature into giant multinucleated osteoclasts, resulting in bone resorption.
  • OPG binds to RANKL, the binding between RANKL and RANK is blocked, which suppresses the formation of osteoclasts and prevents more bone resorption than necessary (Theill LE. Et al., Annu Rev Immunol., 20, pp.795-823). , 2002; Wagner EF.
  • osteoclasts results in the absorption or destruction of old bone, which punctures the bone and releases a small amount of calcium into the bloodstream to maintain body function (William J. et al., Nature., 423, pp.337342, 2003). Osteoblasts produced from bone cells, on the other hand, fill the pores with collagen and cover the calcium and phosphorus hydroxyapatite to reconstruct the bones to form new bones (Stains JP. Et al., birth Defects Res C Embryo Today., 75). (1), pp. 72-80, 2005).
  • osteoporosis which is a big problem in an aging society, is a disease in which bone mass decreases due to various causes and the risk of fracture is continuously increased due to the degeneration of the microstructure of bone tissue. In particular, calcium and substrates are reduced, and the balance of aggregate formation is broken, resulting in an increase in osteoclasts than osteoblasts (Iqbal MM., South Med J., 93 (1), pp.2-18, 2000).
  • Bone inside has a dense structure like a net, but in the case of osteoporosis, the gap between the structures becomes wider and the microstructure becomes thinner and weaker, so that the bone can be easily fractured even with a small impact (Stepan JJ. Et al. , Endocr Regul., 37 (4), pp. 225-238, 2003). Osteoporosis occurs rapidly in postmenopausal postmenopausal osteoporosis, with rapid bone loss (2% to 3% per year) at the beginning of menopause, increasing the risk of compression of the spine and fracture of the carpal bone.
  • Senile osteoporosis which causes progressive bone loss in the hip and vertebrae, and age-related diseases (endocrine diseases, gastrointestinal diseases, malignancies) Drugs (adrenal cortical hormones, chemotherapy, thyroid hormones, anticonvulsants, anticoagulants, methotexate, cyclosporine, GnRH, etc.), alcohol, smoking, and accidental secondary osteoporosis (Secondary osteoporosis) caused by accident (Rosen CJ., N Engl J Med., 353 (6), pp. 595-603, 2005; Davidson M., Clinicain Reviews., 12 (4), pp. 75-82, 2002). In Korea, where the average lifespan exceeds 70 years and reaches the level of developed countries, social and medical attention to osteoporosis is increasing. Thus, there is a growing interest in inhibiting osteoporosis of natural substances with few side effects.
  • the sculptor is a thorny part of the sculptor tree.
  • the sculptural tree Gleditsia sinensis Lam .; GS
  • GS Gleditsia sinensis Lam .
  • GS a deciduous tree belonging to the legume, and there are thorns everywhere.
  • the thorns are called sculptors and can be collected at any time.
  • smooth muscle mycelial action, blood pressure lowering effect, and excitatory effect on the respiratory center were found, and anti-cancer effect, antibacterial effect, whitening effect and anti-HIV effect were reported.
  • bone diseases such as osteoporosis due to the osteoclast inhibitory activity of the sculptor extract.
  • Perillae semen is the fruit of perilla frutescens L. Britton var. Acuta KUDO. It is oval or spherical and has a diameter of 0.6-2 mm. The outer side is grayish brown or dark grayish brown with a slightly raised net pattern. Base has slightly pointed, white spots on peduncle. Fruit peel is thin and easily broken when pressed. Seeds are membranous and the cotyledon is rich in oil. Almost no smell, but chew has a distinctive scent and tastes hot and slightly spicy. If you use it as a topical medicine, sprinkle it with powder or apply it to the base.
  • the present inventors found that the extract complexes of zirconia and engraver have such activity while testing the inhibitory effect of osteoclast differentiation to identify bioactive substances for natural products that are used for medicinal or edible use in daily life. To complete.
  • An object of the present invention is to provide a self-organizing and extract fragments having osteoclast differentiation inhibitory activity and a pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient, food composition, fermented milk, functional beverage, health functional food and the like.
  • the present invention provides an extract complex of scavenger and engraver having osteoclast differentiation inhibitory activity, and a pharmaceutical composition, food composition, fermented milk, functional beverage, health functional food, etc. containing the same as an active ingredient. Characterized in that.
  • Jajaja extract is obtained by extracting from various organs (eg, leaves, stems, roots or seeds) of the perilla, most preferably refers to the extract obtained from the seeds of perilla.
  • Jajaja extract is a common extraction solvent known in the art, preferably (a) water, (b) anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (e.g.
  • the perilla extract is obtained by using water or a lower alcohol, more preferably water, methanol or ethanol, most preferably water as a solvent. However, it is not limited thereto.
  • the Jajaja extract may be an extract obtained by extraction, a diluent or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract or a crude or purified product of the extract.
  • the extract may be prepared by filtering the filter solution one or more times using a filter paper, lyophilizing and pulverizing the same, but using the same as a sample, but the present invention is not limited thereto. It may be used.
  • the engraver extract is obtained by extracting from various organs (eg, leaves, stems, roots or thorns) of the engraver, most preferably refers to the extract obtained from the thorns of the engraver.
  • the flake extract is a conventional extraction solvent known in the art, preferably, (a) water, (b) anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (e.g.
  • the flake extract is obtained by using water or lower alcohol, more preferably water, methanol or ethanol, most preferably ethanol as a solvent, but is not limited thereto.
  • the flake extract may be an extract obtained by extraction, a diluent or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract or a crude or purified product of the extract.
  • Jajaja and engraver extract of the present invention is prepared by mixing Jajaja extract and engraver extract in a weight ratio of 9: 1. Because, the extract of Jajaja has both osteoblast differentiation and osteoclast differentiation inhibitory activity, but osteoclast differentiation promoting activity is superior to osteoclast differentiation inhibitory activity, whereas the fragment extract is very osteoclast differentiation inhibitory activity Excellent because it has no effect on osteoblasts, it is desirable to set the ratio of the mixture of Jajaja extract and Sculpture extract to 9: 1 in order to suppress bone destruction by osteoclasts and maximize the bone formation effect by osteoblasts.
  • the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of osteoporosis by osteoclast differentiation inhibitory activity containing the extract complex of Jajaja and engraver of the present invention as an active ingredient can be formulated into a pharmaceutical composition including a pharmaceutically acceptable carrier, According to conventional methods, it may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, and sterile injectable solutions.
  • Food composition for osteoporosis improvement by osteoclast differentiation inhibitory activity containing the extract complex of Jajaja and engraver of the present invention as an active ingredient may be provided in the form of fermented milk, functional drinks, health functional foods, food composition Pharmaceutically acceptable food supplement additives may be included.
  • the fermented milk of the present invention is prepared by combining lactic acid bacteria culture medium, mixed juice syrup and the extract complex of porcelain and engraver of the present invention at 150 bar and then cooled to below 10 ° C.
  • the functional beverage of the present invention is a mixture of juice and syrup, jaeja and sculptural extracts and a combination of water homogeneous at a constant rate at 150bar and then cooled to 10 °C or less and then packed in a small packaging container such as glass bottles, plastic bottles and functional drinks To prepare.
  • the health functional food of the present invention is a high-speed diet by adding nutritional supplements (vitamins B 1 , B 2 , B 5 , B 6 , E and acetate esters, nicotinic acid amides) and oligosaccharides to the extract complex of Jajaja and flakes of the present invention After mixing in a rotary mixer, the mixture is added and mixed with sterile purified water and molded into granules having a diameter of 1 to 2 mm. The molded granules are dried in a vacuum dryer at 40 to 50 ° C., and then passed through 12 to 14 meshes to produce granules uniformly, which are extruded by appropriate amounts into tablets or powders or filled into hard capsules. To manufacture.
  • nutritional supplements vitamins B 1 , B 2 , B 5 , B 6 , E and acetate esters, nicotinic acid amides
  • oligosaccharides to the extract complex of Jajaja and flakes of the present
  • the extract complex of the egoja and engraver of the present invention effectively inhibits the formation and activity of osteoclasts, it can be widely used as medicines, health functional foods and the like useful for the prevention and treatment of osteoporosis.
  • Figure 1 graphically shows the number of osteoclasts in the skull of the inflammatory cranial uptake model.
  • Figure 2 graphically shows the area of bone absorption by the osteoclasts in the skull of the inflammatory cranial uptake model.
  • FIG. 3 shows cranial sections of an inflammatory cranial uptake model.
  • Figure 4 shows the iliac bone of ovarian osteoporosis model using a micro CT method.
  • Figure 5 graphically shows the volume of bone in ovarian osteoporosis model.
  • Figure 6 graphically shows the number of lamella in the model of ovarian osteoporosis.
  • Figure 7 graphically shows the bone density of ovarian osteoporosis model.
  • FIG. 8 is a 100-fold magnification of the iliac bone of the iliac bone of the ovarian osteoporosis model.
  • 9 is an enlarged histology of the iliac bone of the ovarian osteoporosis model by 40 times.
  • 10 is a graph showing the number of osteoclasts in the long bone of the ovarian osteoporosis model.
  • 11 is a graph showing the measurement of TRAP5b in the blood of the ovarian osteoporosis model.
  • 100 mg of lyophilized powder, 10 g isomerized sugar, and 5 g of mannitol were extracted and dissolved in purified water according to a conventional method of preparing a liquid solution.
  • the solution was prepared by sterilizing by adjusting the total amount to 100ml and then filling the brown bottle.
  • 100 mg of lyophilized powder of the extract complex of Jajaja and engraver of Example 1 was mixed with 100 mg of corn starch, 100 mg of lactose, and 2 mg of magnesium stearate, and then to the hard gelatin capsule according to the method of preparing a conventional capsule.
  • the capsule was prepared by filling.
  • Method for producing a fermented milk containing the extract of Jajaja and engraver of the present invention as an active ingredient is as follows.
  • the lactic acid bacteria culture medium was stirred at 95.36% by weight of crude milk and 4.6% by weight of skim milk powder (or mixed milk powder), and the specific gravity at 15 ° C was 1.0473 to 1.0475, the titratable acidity was 0.200 to 0.220%, and the pH was 6.65 to 6.70, 20 ° C. Brix o was mixed to be 16.3 ⁇ 16.5%. After mixing, it was UHT heat-treated (sterilized at 135 ° C for 2 seconds), cooled to 40 ° C, and then Streptococcus thermophilus and Lactobacillus (Valley laboratory, USA) were added at 0.02% by weight, respectively, and incubated for 6 hours, followed by BCP. Total lactic acid bacteria in the medium was 1.0 x 10 9 cfu / ml or more, the titratable acidity was 0.89 ⁇ 0.91%, pH was prepared to be 4.55 ⁇ 4.65.
  • the mixed fruit syrup is 13% by weight of liquid fructose, 5% by weight of white sugar, 56% by weight of mixed juice concentrate 56Brix o , 1.0% by weight pectin, 0.1% by weight of fresh fruit mix essence and 70% by weight of purified water at 30 ⁇ 35 °C
  • UHT heat treatment sterilized for 2 seconds at 135 °C
  • Method for producing a functional beverage consisting of the extract of Jajaja and engraver of the present invention and mixed juice syrup is as follows.
  • mixed fruit syrup is 13% by weight of liquid fructose, 2.5% by weight of white sugar, 2.5% by weight of brown sugar, 56% by weight of mixed juice concentrate 56Brix o , 1.0% by weight pectin, 0.1% by weight of fresh fruit mix essence and 70% by weight of purified water
  • UHT heat treatment sterilized for 2 seconds at 135 °C
  • the lyophilized powder (vitamin B 1 , B 2 , B 5 , B 6 , E and acetic acid ester, nicotinic acid amide) and oligosaccharide were added to 0.1% by weight of the lyophilized powder of the extract of Jajaja and flakes of Example 1.
  • 10 parts by weight based on 100 parts by weight of the freeze-dried powder of the extract complex of porcelain and engraver of Example 1 was added and mixed in a high speed rotary mixer. 10 parts by weight of sterile purified water was added to the mixture, mixed, and molded into granules having a diameter of 1 to 2 mm.
  • the molded granules were dried in a vacuum dryer at 40 to 50 ° C., and then passed through 12 to 14 meshes to prepare granules uniformly.
  • the granules prepared as described above were extruded by appropriate amounts into tablets or powders or filled into hard capsules to produce hard capsule products.
  • Inflammatory skull uptake model was used to observe the efficacy of osteoporosis prevention and treatment of the extract complex (GPS) of the porridge and engraver of the present invention.
  • mice Five to six week old C57BL / 6J male mice were purchased from SLC, Inc. of Japan through a central laboratory animal and stabilized for two to three days in an SPF facility. The mice used in this test were tested in the animal room of the Department of Natural Sciences, Ewha Mans University, which had an automatic temperature and humidity control device with a temperature of 22 ⁇ 3 °C, a relative humidity of 50 ⁇ 10% and an illumination time of 12 hours Purified and bred. The breeding environment did not recognize variations that would affect the trials throughout the trial. The temperature and humidity of the animal room were controlled by the automatic temperature and humidity control device during the test period, and the environmental conditions were measured regularly. Experimental animals were housed in up to 5 animals in a polycarbonate breeding box during the entire test period.
  • LPS + is a positive control group lipopolysaccharide (LPS) solvent Phosphorus was dissolved in PBS and injected between the skull and the epidermis of the mouse at a concentration of 12.5 mg / kg, and LPS + GPS contained 25 mg / kg of the extract mixture (GPS) of porcelain and engraver of Example 1 under the same conditions as LPS +. Concentrations were injected between the skull and epidermis of the mouse.
  • the extracted skull was subjected to the deliming process and then placed in paraffin to form a block and hardened, and a section of 4 ⁇ m thickness was prepared using a microtom.
  • the sectioned samples were dissolved in paraffin using xylene and ethanol, and then stained with osteoclast marker, TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase).
  • TRAP staining kit was purchased from SIGMA. As control staining, hematoxylin staining was performed to stain nuclei, and then fixed with a mounting solution and observed under a microscope.
  • the average number of osteoclasts of the negative control group (Sham) was about 1.8
  • the number of osteoclasts of the positive control group (LPS +) was found to increase to about 13.7
  • the increased number of osteoclasts was found to be reduced to about 2.1 in the experimental group (LPS + GPS) of the extract complex administration of porcine device and engraver of the present invention.
  • the wear rate per bone surface of the negative control group was about 21%, but the wear rate per bone surface of the positive control group (LPS +) increased to about 77%. .
  • This increased wear rate per bone surface was confirmed to be reduced to about 23% in the experimental group (LPS + GPS) of the extract complex administration of the self-jagi and engraver of the present invention.
  • mice 8-week-old C57BL / 6J female mice were purchased from SLC, Inc. of Japan through a central laboratory animal, and reared at SPF animal facilities. After a period of adaptation in the nursery, a one week recovery period was given after ovarian removal.
  • the estradiol and the extract complex of Jajaja and flakes of the present invention was administered orally six times a week for 8 weeks.
  • the extracted long bone was analyzed by statistical processing by measuring BV (Bone volume), BV / TV (Percent bone volume), Tb.N (Trabecular number) and BMD (Bone mineral density) through microcomputed tomography (micro-CT). It was.
  • bone histomorphometry analysis was performed on the tissue staining slides of the iliac bone using Osteomeasure software.
  • the effect of the extraction complex of the porcelain and the engraver of the present invention was measured. That is, paraffin blocks of iliac tissue were made and cut into 5 ⁇ m thicknesses, followed by TRAP and hematoxylin staining.
  • TRAP labels osteoclasts and hematoxylin stains the nucleus to allow identification of cells within the tissue fragments.
  • Each image obtained was obtained by X100 magnification and shows well the change of trabecular bone in each experimental group.
  • bone resorption was measured by analyzing Tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRAP5b), an activity index of osteoclasts, from serum. Analysis was performed using an ELISA kit from Immunodiagnostic Systems Ltd., Boldon, UK.
  • the micro-CT picture of the negative control can confirm the normal bone appearance, it was confirmed that bone loss occurred in the ovarian ablation positive control (OVX). It was confirmed that the bone loss is recovered in the estradiol-treated positive control group (OVX + Estradiol), and also the bone loss is recovered in the extract complex administration test group (OVX + GPS) of the jasper and engraver of the present invention. I could confirm it.
  • the negative control group (Sham) Bone volume / Total volume (BT / TV) can be seen that about 4.8%, but in the ovarian ablation positive control group (OVX) was reduced to about 2.5% could know.
  • the BT / TV decreased by ovarian ablation increased to about 3.9% in the estradiol-treated positive control group (OVX + Estradiol), and also the experimental group administered with the extract complexes of the jasper and flakes of the present invention (OVX). + GPS) also increased to about 3.7%.
  • the number of trabecular bones (Sham) of the negative control group (Sham) was about 0.61, it was confirmed that reduced to 0.33 in the ovarian ablation positive control group (OVX).
  • the number of foliar bone (Tb.N) decreased by ovarian ablation increased to 0.49 in the estradiol-treated positive control group (OVX + Estradiol), and also the experimental group administered with the extract complexes of the porridge and engraver of the present invention ( OVX + GPS) also increased to about 0.47.
  • the bone mineral density of the negative control group was about 0.09, but was reduced to about 0.053 in the ovarian ablation positive control group (OVX).
  • This decrease in bone mineral density (BMD) due to ovarian ablation increased to about 0.075 in the estradiol-treated positive control group (OVX + Estradiol), and also in the extract complex administration group (OVX + GPS) It can be seen that also increased to about 0.072.
  • the number of osteoclasts of the negative control group can be confirmed that about 5.5, but in the ovarian ablation positive control group (OVX) was confirmed to increase to about 9.3 It was.
  • the osteoclasts increased due to ovarian ablation were reduced to about 6.0 in the estradiol-treated positive control group (OVX + Estradiol), and also in the extract complex administration group (OVX + GPS) of sperm and engraver of the present invention. It was found that the number was reduced to 7.1.
  • TRAP5b when measuring TRAP5b, a biomarker of osteoclasts in serum, TRAP5b in serum of a negative control group was about 5.8, but increased to about 6.6 in an ovarian ablation positive control group (OVX). Confirmed. This increased serum TRAP5b due to ovarian ablation was confirmed to be reduced to about 5.1 in the estradiol-treated positive control group (OVX + Estradiol), and also the experimental group administration of the extract complex of the self-jaja and flakes of the present invention (OVX + GPS) also decreased to about 5.3.
  • OVX + Estradiol estradiol-treated positive control group
  • GPS experimental group administration of the extract complex of the self-jaja and flakes of the present invention

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

본 발명은 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 식품조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물은 파골세포의 형성 및 활성을 효과적으로 억제하므로 골다공증 예방 및 치료에 유용한 의약품, 건강기능식품 등으로 널리 이용될 수 있다.

Description

자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
본 발명은 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 발명으로서, 보다 상세하게는 파골세포 분화억제 활성을 갖는 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 발효유, 기능성 음료 및 건강기능식품에 관한 것이다.
골다공증은 골흡수와 골형성의 균형이 무너져 발생하는 것으로 과다하게 골흡수가 진행되는데 기인한 질환으로, 골다공증은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지고, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골조직은 조골세포에 의해 형성되고 파골세포에 의해 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다.
인체를 지지하는 조직으로 200여개의 뼈(bone)와 각기 다른 뼈를 연결하는 조직인 연골(cartilage)로 구성되어 있다. 이들은 중요한 장기의 보호, 조혈화에 필요한 미세 환경제공과 같은 기본적이며 다양한 기능을 제공하여 준다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉, 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생 하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골재형성(bone remodeling) 이라고 한다(Yamaguchi A. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso., 50(6Suppl), pp.664-669, 2005). 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다(Cohen-Solal M. et al., Therapie., 58(5), pp.391-393, 2003).
골재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 이들은 서로 다른 세포에서 유래하는데 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)가 분화되어 조골세포(osteoblast), 근원세포(myoblast), 지방세포(adipocyte), 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte)로 분화되고, 조혈모세포(hematopoietic stem cell)가 분화되어 파골세포(osteoclast), 대식세포(macrophage), T 세포(T cell), B 세포(B cell), 수지상세포(dentritic cell), 호염구(basophile), 호산구(eosinophile), 호중구(neutrophile), 혈소판(platelet), 적혈구(Red blood cell)로 분화된다. 조골세포 주요 분화인자인 Runx2, 근원세포 주요 분화인자인 MyoD, 지방세포 주요 분화인자인 PPAR, 연골세포 주요 분화인자인 Sox9 등은 서로의 발현을 억제조절하며 분화를 유도한다(Yamashita S. et al., Exp Cell Res., 315(13), pp.2231-40, 2009, Charles A. et al., Exp Cell Res., 300(2), pp.406-17, 2004, David V. et al., Endocrinology., 148(5), pp.2553-62, 2007, Hill TP. et al., Dev Cell., 8(5), pp.727-38, 2005, Wang H. et al., J Bone Miner Res., 23(6), pp.939-48, 2008, Lengner CJ. et al., J Biol Chem., 280(16), pp.15872-9, 2005).
조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-B ligand)과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK(receptor activator of nuclear factor-B)에 결합하면 파골 전구 세포가 거대 다핵 파골세포로 성숙화(maturation)되어 골 흡수(bone resorption)가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다(Theill LE. et al., Annu Rev Immunol., 20, pp.795-823, 2002; Wagner EF. et al., Curr Opin Genet Dev., 11, pp.527-532, 2001). 이러한 파골세포의 활성으로 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴가 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다(William J. et al., Nature., 423, pp.337342, 2003). 한편 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침척물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다(Stains JP. et al., Birth Defects Res C Embryo Today., 75(1), pp.72-80, 2005). 뼈가 파괴되기 시작하여 다시 새로운 뼈로 재형성되기까지는 약 100일 정도 걸린다(Schwarz EM. et al., Curr Opin Orthop., 11, pp.329-335, 2000). 유아에서는 1년 내에 뼈의 칼슘이 100% 바뀌지만 성인에서는 매년 골격의 약 10~30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다.
이러한 두 과정 즉, 골흡수와 골형성은 서로 밀접하게 연결되어 이루어지고 골의 정상적인 구조를 유지하는 데 중요하다. 한편, 고령화 사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증(osteoporosis)은 여러 가지 원인에 의하여 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조의 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하는 질환으로 뼈를 구성하는 미네랄(특히, 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다(Iqbal MM., South Med J., 93(1),pp.2-18, 2000). 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 수 있는 상태로 진행된다(Stepan JJ. et al., Endocr Regul., 37(4), pp.225-238, 2003). 골다공증은 폐경기의 시작과 동시에 급속한 골 손실(년간 2~3%)이 나타나며 척추의 압박 및 손목뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 폐경기 이후의 골다공증(Postmenopausal osteoporosis), 70세 이상의 남녀 노인에게 서서히 발생하며(연간 0.5~1%), 골반골(hip bone)과 척추뼈의 점진적인 골손실을 가져오는 노년기의 골다공증(Senile osteoporosis), 그리고 연령에 상관없이 질병(내분비질환, 위장관질환, 악성종양)이나 약물(부신피질호르몬, 항암화학요법, 갑상선호르몬, 항경련제, 항응고제, methotexate, cyclosporine, GnRH 등), 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 2차 골다공증(Secondary osteoporosis)으로 분류된다(Rosen CJ., N Engl J Med., 353(6), pp.595-603, 2005; Davidson M., Clinicain Reviews., 12(4), pp.75-82, 2002). 평균 수명이 70세를 넘어서서 선진국 수준에 도달하고 있는 우리나라도 골다공증에 대한 사회적·의학적 관심이 증가하고 있다. 그리하여 부작용이 적은 천연 물질의 골다공증 억제에 대한 관심이 증대되고 있다.
조각자는 조각자 나무의 가시부분으로써 조각자 나무(Gleditsia sinensis Lam.; GS)는 콩과에 속하는 낙엽 교목으로 곳곳에 가시가 존재하며 잎은 어긋나고 1~2회 깃꼴 겹이다. 특히 가시는 조각자라 하여 시기와 상관없이 채취가 가능하며, 외용약으로 쓰는 경우 가루를 내어 뿌리거나 기초제에 개어 바른다. 약리 실험 결과 평활근 진경 작용, 혈압 강하 작용, 호흡 중추에 대한 흥분 작용이 밝혀졌으며, 항암 효과, 항균 효과, 미백 효과, 항 HIV 효과 등의 활성이 보고되었다. 그러나 조각자 추출물의 파골세포 억제 활성에 의한 골다공증과 같은 골질환 예방 또는 치료 효과에 대해서는 개시된 바 없다.
또한, 자소자(Perillae semen; PS)는 차조기(Perilla frutescens L. Britton var. acuta KUDO.)의 열매로써 난원형 또는 구형에 가까우며 지름 0.6~2mm이다. 바깥면은 회갈색 또는 진한 회갈색이고 약간 융기된 그물무늬가 있다. 기부는 약간 뾰족하고 흰색의 점 모양인 열매꼭지 자국이 있다. 열매껍질은 얇고 누르면 쉽게 부서진다. 씨껍질은 막질이고 떡잎은 기름이 풍부하다. 거의 냄새가 없으나 씹으면 특유한 향기가 있고 맛은 텁텁하고 약간 맵다. 외용약으로 쓰는 경우 가루를 내어 뿌리거나 기초제에 개어 바른다. 약리 실험 결과 평활근 진경 작용, 혈압 강하 작용, 호흡 중추에 대한 흥분 작용이 밝혀졌으며, 항암 효과, 항균 효과, 미백 효과, 항 HIV 효과 등의 활성이 보고되었다. 강활, 인진, 소엽 혼합 추출물의 연골세포 재생에 관하여 등록된 특허(등록번호 10-0595735)는 있으나, 자소자 추출물의 파골세포 분화억제에 의한 골질환 예방 또는 치료 효과에 대해서는 개시된 바 없다.
이에 본 발명자들은 일상생활에서 약용 또는 식용으로 이용되고 있는 천연물에 대한 생리활성 물질을 규명하기 위해 파골세포 분화 억제 효과를 시험하던 중 자소자와 조각자의 추출복합물이 이러한 활성이 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 자소자와 조각자 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 식품조성물, 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 식품 조성물, 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 등을 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
자소자 추출물은 차조기의 다양한 기관(예컨대, 잎, 줄기, 뿌리 또는 종자)로부터 추출하여 얻은 것으로서, 가장 바람직하게는 차조기의 종자로부터 추출하여 얻은 것을 말한다. 자소자 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는, (a)물, (b)탄소수1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-이로판올 및 노말-부탄올 등), (c)상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d)아세톤, (e)에틸 아세테이트, (f)클로로포름, (g)1,3-부틸렌글리콜, (h)헥산, (i)디에틸에테르 또는 (j)부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 자소자 추출물은 물 또는 저급 알코올, 보다 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올, 가장 바람직하게는 물을 용매로 하여 얻어진 것이다. 그러나 이에 한정되는 것이 아니다.
상기 자소자 추출물은 추출에 의해 수득되는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 수득되는 건조물 또는 추출액의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.
물을 이용하여 자소자 추출물을 얻는 방법을 좀 더 구체적으로 살펴보면, 시료인 자소자를 5~10배 가량의 물을 이용하여 100℃에서 1회 내지 2회 반복 추출한다. 추출액을 여과지를 사용하여 1회 이상 여과하고 동결건조한 후 분말화하여 이를 시료로 사용하는 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 자소자 추출물을 제조할 수 있는 어떤 통상적인 방법을 사용하더라도 무방하다.
또한, 조각자 추출물은 조각자나무의 다양한 기관(예컨대, 잎, 줄기, 뿌리 또는 가시)로부터 추출하여 얻은 것으로서, 가장 바람직하게는 조각자나무의 가시로부터 추출하여 얻은 것을 말한다. 조각자 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는, (a)물, (b)탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c)상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d)아세톤, (e)에틸 아세테이트, (f)클로로포름, (g)1,3-부틸렌글리콜, (h)헥산, (i)디에틸에테르 또는 (j)부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 조각자 추출물은 물 또는 저급 알코올, 보다 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올, 가장 바람직하게는 에탄올을 용매로 하여 얻어진 것이나, 이에 한정되는 것이 아니다.
상기 조각자 추출물은 추출에 의해 수득되는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 수득되는 건조물 또는 추출액의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.
에탄올을 이용하여 조각자 추출물을 얻는 방법을 구체적으로 살펴보면, 시료인 조각자를 5~10배 가량의 70% 에탄올을 이용하여 70℃에서 1회 내지 3회 반복 환류추출한다. 상기 추출액을 여과지를 사용하여 1회 이상 여과하고 회전감압농축기로 농축하여 동결건조한 후 분말화하여 이를 시료로 사용하는 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 조각자 추출물을 제조할 수 있는 어떤 통상적인 방법을 사용하더라도 무방하다.
본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물은 자소자 추출물과 조각자 추출물을 9:1의 중량비로 혼합하여 제조한다. 왜냐하면, 상기 자소자 추출물은 조골세포 분화촉진과 파골세포 분화억제 활성을 모두 가지나, 파골세포 분화 억제 활성에 비하여 조골세포 분화 촉진 활성이 더 우수한데 반하여, 상기 조각자 추출물은 파골세포 분화 억제 활성은 매우 뛰어나나 조골세포에는 영향이 없기 때문에 파골세포에 의한 뼈 파괴 억제와 조골세포에 의한 뼈 형성 효과를 극대화하기 위하여 자소자 추출물과 조각자 추출물의 혼합비율을 9:1로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 자소자와 조각자의 추출 복합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제활성에 의한 골다공증의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하여 약학 조성물로 제제화될 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다.
본 발명의 자소자와 조각자의 추출 복합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제활성에 의한 골다공증 개선용 식품 조성물은 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 등의 형태로 제공될 수 있으며, 식품 조성물에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제가 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 발효유는 유산균 배양액, 혼합과즙시럽 및 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물을 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 제조한다.
상기 본 발명의 기능성 음료는 혼합과즙시럽, 자소자와 조각자의 추출복합물 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성 음료를 제조한다.
상기 본 발명의 건강기능식품은 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합한 후 상기 혼합물에 멸균 정제수를 첨가 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형한다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조한다.
본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물은 파골세포의 형성 및 활성을 효과적으로 억제하므로 골다공증 예방 및 치료에 유용한 의약품, 건강기능식품 등으로 널리 이용될 수 있다.
도 1은 염증성 두개골 흡수 모델의 두개골에 있는 파골세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 염증성 두개골 흡수 모델의 두개골에 파골세포에 의하여 골흡수된 영역을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 염증성 두개골 흡수 모델의 두개골 절편을 나타낸 것이다.
도 4는 난소제거 골다공증 모델의 장골을 micro CT 방법을 사용하여 나타낸 것이다.
도 5는 난소제거 골다공증 모델의 뼈의 부피를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 난소제거 골다공증 모델의 무층골의 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 난소제거 골다공증 모델의 골밀도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 난소제거 골다공증 모델의 장골을 조직형태학적으로 무층골을 100배 확대하여 찍은 것이다.
도 9는 난소제거 골다공증 모델의 장골을 조직형태학적으로 장골 전체를 40배로 확대하여 찍은 것이다.
도 10은 난소제거 골다공증 모델의 장골에 있는 파골세포 수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 난소제거 골다공증 모델의 혈액 내 TRAP5b를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
자소자와 조각자의 추출복합물의 제조
1-1. 자소자 열수추출물의 제조
자소자에 5~10배의 물을 가하여 100℃에서 2시간 가열하는 과정을 2회 반복하여 추출한 다음, 상기 추출액을 와트만 No.3. 여과지를 사용하여 2회 여과하고 동결 건조하여 분말화하여 제조하였다.
1-2. 70% 에탄올에 의한 조각자 추출물의 제조
조각자에 5~10배의 물과 에탄올의 혼합액(70% 에탄올)을 가하여 70~80℃에서 2~5시간 동안 2회 반복하여 추출한 다음, 상기 추출액을 와트만 No.3. 여과지를 사용하여 2회 여과하고 회전감압 농축기(EYELA,NE-1001, Japan)로 농축하여 동결 건조하여 분말화하여 제조하였다.
1-3. 자소자와 조각자의 추출복합물의 제조
상기 실시예 1-1의 자소자 추출물과 실시예 1-2의 조각자의 추출물을 9:1의 중량비로 혼합하여 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS: Gleditsia sinesis + Perilla semen)을 제조하여 시료로 사용하였다.
<실시예 2>
자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조
액제의 제조
상기 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 100㎎, 이성화당 10g, 만니톨 5g을 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
캡슐제의 제조
상기 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 100㎎에 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<실시예 3>
자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.65~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brixo)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 혼합 후에 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여 BCP 배지에서의 총 유산균수가 1.0 x 109cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.
그런 다음, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그런 다음, 상기 유산균배양액 69.5중량%와 상기 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 혼합과즙시럽 30.4중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 발효유를 제조하였다.
<실시예 4>
자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조
본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 및 혼합과즙시럽으로 구성된 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brixo 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
그리고 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 5>
자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조
상기 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기의 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물의 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<시험예 1>
염증성 두개골 흡수 모델을 통한 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)의 파골세포 수 및 뼈의 소실 억제정도 측정
염증성 두개골 흡수모델을 사용하여 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)의 골다공증 예방 및 치료에 대한 효능을 관찰하였다.
5~6주된 C57BL/6J 수컷 마우스를 (주)중앙실험동물을 통해 일본의 SLC, Inc.로 부터 구입하여 SPF 시설에서 2~3일 동안 안정화하였다. 본 시험에 사용된 마우스는 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 조명시간 12시간(08:00 점등~20:00 소등)으로 자동 온습도 조절 장치가 설치된 이화여자대학교 자연과학부 동물실에서 순화 및 사육되었다. 사육 환경은 전 시험기간 동안 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 인정하지 않았다. 시험기간 중 동물실의 온습도는 자동 온습도 조절장치에 의해 조절되었으며 환경조건은 정기적으로 측정하였다. 실험동물은 전 시험기간 동안 폴리카보네이트제 사육상자에 5마리 이하씩 수용하였다. 개체식별은 유성매직펜을 이용한 미부표식법과 사육상자별 개체식별카드표지법을 이용하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(PMI Nutritional International, 505 North 4th street Richmond, In 47374, USA)를 방사선조사(13.2 kGy)로 멸균하여 자유 섭취시키고, 물은 상수도수를 물병을 이용하여 자유섭취 시켰다.
표 1
Sham LPS+ LPS+GPS
PBS LPS 12.5mg/kg + PBS LPS 12.5mg/kg + PBS + GPS 25mg/kg
상기 표 1과 같이, Sham은 음성대조군으로서 용매로 사용된 인산완충식염수(Phosphate buffer saline; PBS)를 마우스의 두개골과 표피 사이에 주입하였고, LPS+은 양성대조군으로서 지질다당체(Lipopolysaccharide; LPS)를 용매인 PBS로 녹여 12.5mg/kg의 농도로 마우스의 두개골과 표피 사이에 주입하였으며, LPS+GPS은 상기 LPS+과 같은 조건에 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출 혼합물(GPS)을 25mg/kg의 농도로 마우스의 두개골과 표피 사이에 주입하였다.
LPS의 두개골 주입은 실험 첫날과 셋째 날에 2회 투여하였고, 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)의 두개골 주입은 실험 첫날부터 하루 간격으로 5회 투여하였다. 마지막 투여 후, 다음 날에 마우스의 두개골을 적출하여 뼈 파괴 정도를 분석하였다.
실험 종료 후 적출한 두개골의 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 양성 세포(파골세포)의 수 및 뼈의 소실 정도를 측정하여 통계적 유의성 검정을 통해 실시예 1의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여군인 LPS+GPS과 대조군인 Sham과 LPS+의 차이를 비교하였다.
적출한 두개골은 탈석회 과정을 거친 후 파라핀에 넣어서 블락을 만들어 굳히고 마이크로톰(microtom)을 사용하여 4㎛ 두께로 절편을 제작하였다. 절편된 시료는 크실렌(xylene)과 에탄올(ethanol)을 이용하여 파라핀을 녹인 후, 파골세포 표지인자인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 실시하였다. TRAP staining kit은 SIGMA에서 구입하여 사용하였다. 대조 염색으로는 핵을 염색하는 헤마톡실린(hematoxylin) 염색을 실시한 후, 마운팅(mounting) 용액으로 고정하여 현미경으로 관찰하였다.
그 결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 파골세포 수는 평균 약 1.8개였으나, 양성대조군(LPS+)의 파골세포 수는 약 13.7개로 증가한 것을 알 수 있었다. 이렇게 증가된 파골세포의 수가 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(LPS+GPS)에서 약 2.1개로 감소된 것을 확인할 수 있었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 골표면당 마모된 비율은 약 21% 정도였으나, 양성대조군(LPS+)의 골표면당 마모된 비율은 약 77%로 증가한 것을 알 수 있었다. 이렇게 증가된 골표면당 마모된 비율이 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(LPS+GPS)에서 약 23%로 감소된 것을 확인할 수 있었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 두개골 절편을 보면 붉은색으로 염색(TRAP 염색)된 파골세포가 거의 보이지 않으며 두개골이 파괴되지 않은 온전한 모양을 갖추고 있으나, 양성대조군(LPS+)의 두개골 절편을 보면 붉은색으로 염색(TRAP 염색)된 파골세포가 많이 보이며 골흡수로 온전한 모양을 유지하지 못하고 뼈 안의 빈공간이 많이 보이는 것을 알 수 있었다. 이렇게 늘어난 파골세포와 뼈 안의 빈공간은 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(LPS+GPS)에서는 거의 없어진 것을 확인할 수 있었다.
<시험예 2>
난소제거 골다공증 모델을 통한 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)의 BV, BV/TV, Tb.N, BMD 및 골흡수도 측정
난소제거 골다공증모델을 사용하여 표 2와 같은 방식으로 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물(GPS)의 골다공증 예방 및 치료에 대한 효능을 관찰하였다.
표 2
음성대조군 난소절제 양성대조군 에스트라디올 처리 양성대조군 실험군
Sham OVX OVX mice + Estradiol 10㎍/㎏ OVX mice + GPS 50㎎/㎏
실험동물로는 8주령 C57BL/6J 암컷 생쥐를 중앙실험동물을 통해 일본의 SLC, Inc로부터 구입하여 SPF 동물시설에서 사육하였다. 사육실에서 적응 기간을 거친 후 난소제거수술 후 1주간의 회복 기간을 주었다.
회복기 이후, 상기 표 2와 같이 수술한 흔적만 남긴 음성대조군 Sham, 난소제거 수술을 한 난소절제 양성대조군 OVX, 난소절제수술 후 뼈 파괴 억제 효능이 알려진 에스트라디올(estradiol)을 10㎍/kg 처리한 에스트라디올 처리 양성대조군 OVX+Estradiol, 상기 난소절제 양성대조군 OVX에 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물을 50mg/kg으로 구강 투여한 실험군 OVX+GPS의 4개의 실험군(각 군당 n=10)으로 실험하였다. 이때, 에스트라디올과 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물은 매주 6회씩 8주간 경구투여하였다.
각 동물은 케이지당 5마리씩 사육하고 사육실의 환경은 항온, 항습 및 12시간 간격의 광주기로 일정한 조건을 유지하였다. 사육 기간 동안 4주 및 8주차에서 eye bleeding을 통하여 소량의 혈액을 채취하였다. 실험 종료 후 적출한 장골(다리뼈)의 밀도 차이를 측정하여 통계적 유의성 검정을 통해 본 발명의 자소자와 조각자 추출복합물 투여군 OVX+GPS와 대조군 Sham, OVX, OVX+Estradiol의 차이를 비교분석하였다.
적출한 장골은 microcomputed tomography(micro-CT)를 통하여 BV(Bone volume), BV/TV(Percent bone volume), Tb.N(Trabecular number), BMD(Bone mineral density)를 측정하여 통계처리를 통해 분석하였다.
그리고, 장골의 조직염색 슬라이드를 Osteomeasure 소프트웨어를 이용하여 bone histomorphometry 분석을 실시하였다. 이 결과를 통해 육안으로 골조직을 관찰함으로써 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물의 효과를 측정하였다. 즉, 장골 조직편의 파라핀 block을 만들어 5㎛ 두께로 절단하여 TRAP과 헤마톡실린(hematoxylin) 염색을 실시하였다. TRAP은 파골세포를 표지하고 헤마톡실린(hematoxylin)은 핵을 염색함으로써 조직편 내에 있는 세포의 확인을 가능하게 한다. 획득된 각각의 영상은 X100 배율로 얻은 것이며 실험군별로 무층골(trabecular bone)의 변화를 잘 보여주고 있다.
또한, 파골세포의 활성도 지표인 Tartrate-resistant acid phosphatase 5b(TRAP5b)를 혈청으로부터 분석하여 골흡수도를 측정하였다. 분석은 Immunodiagnostic Systems Ltd., Boldon, UK에서 나온 ELISA kit를 사용하였다.
그 결과를 도 4 내지 도 11에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 Micro CT 사진을 보면 정상적인 뼈의 모습을 확인할 수 있으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 골소실이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 이러한 골소실이 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 회복되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 골소실이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 Bone volume/Total volume(BT/TV)을 보면 약 4.8%인 것을 알 수 있으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 약 2.5%로 감소한 것을 알 수 있었다. 이렇게 난소절제로 인하여 감소된 BT/TV는 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 약 3.9%로 증가한 것을 알 수 있었으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 약 3.7%로 증가한 것을 알 수 있었다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 무층골(Trabecular bone)의 수는 약 0.61개였으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 0.33개로 감소된 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 감소된 무층골의 수(Tb.N)는 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 0.49개로 증가하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 약 0.47개로 증가한 것을 알 수 있었다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성대조군(Sham)의 골밀도(Bone mineral density)는 약 0.09였으나 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 약 0.053으로 감소된 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 감소된 골밀도(BMD)는 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 약 0.075로 증가하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 약 0.072로 증가한 것을 알 수 있었다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 무충골을 100배로 확대하여 살펴보면, 음성대조군(Sham)의 무충골은 수직으로 길게 뻗어져 있는 것을 확인할 수 있으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 거의 잘 보이지 않는 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 감소된 무충골은 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 수직으로 길게 뻗어져 증가하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 무층골이 길게 뻗어져 증가한 것을 알 수 있었다.
도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 장골 전체를 40배로 확대하여 살펴보면, 음성대조군(Sham)의 무충골은 전반적으로 수직으로 길게 있는 것을 확인할 수 있으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 거의 잘 보이지 않는 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 감소된 무충골은 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 수직으로 길게 뻗어져 증가하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 무층골이 길게 뻗어져 증가한 것을 알 수 있었다.
도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 장골의 파골세포를 세어보면, 음성대조군(Sham)의 파골세포 수는 약 5.5개인 것을 확인할 수 있으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 약 9.3개로 증가된 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 증가된 파골세포는 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 약 6.0개로 감소하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 약 7.1개로 감소된 것을 알 수 있었다.
도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혈청 내 파골세포의 바이오마커인 TRAP5b를 측정하면, 음성대조군(Sham)의 혈청 내 TRAP5b은 약 5.8이었으나, 난소절제 양성대조군(OVX)에서는 약 6.6으로 증가된 것을 확인하였다. 이렇게 난소절제로 인하여 증가된 혈청 내 TRAP5b는 에스트라디올(Estradiol) 처리 양성대조군(OVX+Estradiol)에서 약 5.1로 감소된 것을 확인하였으며, 또한 본 발명의 자소자와 조각자의 추출복합물 투여 실험군(OVX+GPS)에서도 약 5.3으로 감소된 것을 알 수 있었다.

Claims (5)

  1. 자소자 추출물과 조각자 추출물을 9:1의 중량비로 혼합하여 제조된 파골세포 분화 억제활성을 갖는 자소자와 조각자의 추출복합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자소자 추출물은 열수추출물이고, 조각자 추출물은 70% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 파골세포 분화 억제활성을 갖는 자소자와 조각자의 추출복합물.
  3. 제1항 또는 제2항의 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제활성에 의한 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항의 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제활성에 의한 골다공증 개선용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 발효유, 기능성 음료, 건강기능식품 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자소자와 조각자의 추출복합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제활성에 의한 골다공증 개선용 식품 조성물.
PCT/KR2014/008739 2014-07-30 2014-09-19 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 WO2016017851A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140097135A KR20160015440A (ko) 2014-07-30 2014-07-30 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
KR10-2014-0097135 2014-07-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016017851A1 true WO2016017851A1 (ko) 2016-02-04

Family

ID=55217736

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/008739 WO2016017851A1 (ko) 2014-07-30 2014-09-19 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20160015440A (ko)
WO (1) WO2016017851A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030066539A (ko) * 2003-07-15 2003-08-09 김종운 음료형 건강 보조 식품의 제조방법
KR100595735B1 (ko) * 2005-07-08 2006-06-30 주식회사 케이엠에스아이 연골 재생 및 골관절염 치료용 생약 조성물
KR20140061825A (ko) * 2012-11-14 2014-05-22 주식회사한국야쿠르트 조골세포 분화 촉진과 파골세포의 분화 억제 활성을 갖는 자소자 추출물 및 상기 자소자 추출물을 유효성분으로 함유하는 제품

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2285392A4 (en) * 2008-04-11 2012-06-06 Bionovo Inc PROCEDURE AGAINST CANCER WITH EXTRACTS FROM GLEDITSIA SINENSIS LAM
KR101464267B1 (ko) * 2013-03-15 2014-11-21 주식회사한국야쿠르트 파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030066539A (ko) * 2003-07-15 2003-08-09 김종운 음료형 건강 보조 식품의 제조방법
KR100595735B1 (ko) * 2005-07-08 2006-06-30 주식회사 케이엠에스아이 연골 재생 및 골관절염 치료용 생약 조성물
KR20140061825A (ko) * 2012-11-14 2014-05-22 주식회사한국야쿠르트 조골세포 분화 촉진과 파골세포의 분화 억제 활성을 갖는 자소자 추출물 및 상기 자소자 추출물을 유효성분으로 함유하는 제품

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YOUN, YUNA ET AL.: "Screening of Korean Medicinal plants for possible osteoclastogenesis effects in vitro", GENES NUTR., vol. 2, 2008, pages 375 - 380 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160015440A (ko) 2016-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017057881A1 (ko) 인삼 유래의 엑소좀 유사 베지클을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물
US10251824B2 (en) Method for inducing pluripotent stem cells and pluripotent stem cells prepared by said method
KR101382400B1 (ko) 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR20120091995A (ko) 갈조류 추출물을 포함하는 가바 ａ형－벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물 및 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 조성물
WO2021132879A1 (ko) 한국인 영유아 유래 신규한 비피도박테리움 애니멀리스 락티스 lm1017을 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부염의 예방 및 치료용 조성물
KR20080072635A (ko) 에쿠올 농도 조절제
JP2006083151A (ja) 骨粗鬆症予防、改善用組成物
KR101770036B1 (ko) 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 관절염의 예방 또는 개선용 조성물
JP7379152B2 (ja) 筋線維化抑制用組成物
WO2016190566A9 (ko) 아위버섯 물 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능성식품
KR101451755B1 (ko) 상심자와 독활의 혼합 추출물을 함유하는 골다공증 예방 또는 개선을 위한 조성물
JP6360357B2 (ja) 脂肪細胞形成抑制方法
WO2016017851A1 (ko) 자소자와 조각자의 추출복합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
KR101464267B1 (ko) 파골세포 분화 억제활성을 갖는 조각자 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
KR101444760B1 (ko) 우슬과 희렴의 혼합 추출물을 함유하는 골대사 질환 예방 및 골 기능 개선을 위한 조성물
KR101545843B1 (ko) 유산균 발효 천마 추출물을 포함하는 수면유도 조성물
KR101529493B1 (ko) 조골세포 분화 촉진과 파골세포의 분화 억제 활성을 갖는 자소자 추출물 및 상기 자소자 추출물을 유효성분으로 함유하는 제품
WO2021040416A1 (ko) 비쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 골대사성 질환으로 유발된 골소실 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
Kazemi et al. Evaluation the effect of royal jelly on the growth of two members of gut microbiota; Bacteroides fragillis and Bacteroides thetaiotaomicron.
KR101423316B1 (ko) 필란투스 테넬루스의 추출물을 함유하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물
KR101972657B1 (ko) 자화전호 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 골다공증 치료 또는 예방용 조성물
WO2022260479A1 (ko) 생약 혼합 추출물의 장내 미생물 환경 개선용 조성물
JP2019011308A (ja) 経口組成物
KR102228685B1 (ko) 프로폴리스 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2021221457A1 (ko) 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14898670

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14898670

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1