WO2021221457A1 - 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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preventing
functional food
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하현일
장선아
김태수
황윤환
양현
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한국 한의학 연구원
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    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention, improvement or treatment of bone diseases, which contains an extract of peppermint ( Mentha arvensis ) as an active ingredient.
  • Bone supports the soft tissue and body weight of the human body and surrounds the internal organs to protect the internal organs from external impact. In addition, it is one of the important parts of the human body that not only structurally supports muscles or organs, but also stores substances such as calcium and other essential minerals in the body, such as phosphorus and magnesium.
  • Bone is a very complex tissue composed of cells, collagenous matrix and mineral components. They not only protect organs, but also provide basic and diverse functions such as providing a microenvironment necessary for hematopoiesis. In addition, it is one of the important parts of the human body that not only structurally supports muscles or organs, but also stores substances such as calcium and other essential minerals in the body, such as phosphorus and magnesium.
  • Bone remodeling Adult bones that have completed growth do not stop, and the old bone is removed and replaced with new bone until the day of death. This is called bone remodeling.
  • Osteoblasts produce RANKL (receptor activator of nuclear factor- ⁇ B ligand) and its inducible receptor (decoy receptor) OPG (osteoprotegerin).
  • osteoclast progenitor cells When RANKL binds to receptor activator of nuclear factor- ⁇ B (RANK), a receptor on the surface of osteoclast progenitor cells, the osteoclast progenitor cells mature into giant multinucleated osteoclasts, and bone resorption occurs. .
  • OPG binds to RANKL
  • the binding between RANKL and RANK is blocked, suppressing the formation of osteoclasts and preventing excessive bone resorption.
  • the activity of these osteoclasts leads to resorption or destruction of old bone, which makes a hole in the bone and releases a small amount of calcium into the bloodstream, which is used to maintain body functions.
  • peppermint Mentha arvensis
  • Mentha arvensis is a dicotyledonous plant, a perennial succulent plant of the order Lamiaceae, which has an orientation in the plant itself and is erected and branched from the top.
  • the main ingredients of mint are alpha-pinene (+,-), anisaldehyde, Daucosterol, Eugenol, Linalool, Menthone, (+ )-Neomenthol ((+)-Neomenthol) and the like.
  • Mint emits a refreshing and refreshing scent, and has sterilizing and antibacterial action against pathogenic fungi, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus that cause eczema and scabies on the skin and scalp. In addition, it has the action of constricting the mucous membrane and blood vessels of the skin, paralyzing the nerve peripherals, stopping pain, and stopping the pruritus.
  • Menthol the main component of peppermint oil, is used medicinally as a liniment, analgesic, stimulant, or stomach agent, and is used as a flavoring or refreshing agent in toothpaste, candy, jam, cosmetics, and tobacco.
  • Korean Patent No. 1864719 discloses a composition for preventing and treating osteoporosis containing a mixed herbal medicine extract, and Korean Patent No. 2063962 for preventing or treating osteoporosis containing camphen as an active ingredient
  • a pharmaceutical composition for use has been disclosed, a composition for preventing, improving or treating bone disease containing the mint extract of the present invention as an active ingredient has not been disclosed.
  • the present invention has been derived from the above needs, and the present invention provides a composition for preventing, improving, or treating bone diseases containing a peppermint extract as an active ingredient, wherein the peppermint extract inhibits osteoclast differentiation and inhibits osteoblast differentiation.
  • the present invention was completed by confirming that it has an effect of promoting differentiation, increasing the survival rate of osteoclast progenitors, and increasing cancellous bone density and bone volume in an ovariectomized animal model.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving bone disease containing mint ( Mentha arvensis ) extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of bone diseases containing the mint extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts containing the mint extract as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for the prevention, improvement or treatment of bone diseases containing a peppermint extract as an active ingredient, wherein the peppermint extract has the effect of inhibiting osteoclast differentiation and promoting osteoblast differentiation, and improving the survival rate of osteoclast progenitors. It has the effect of increasing cancellous bone density and bone volume in an ovariectomized animal model.
  • 3 is a result of confirming the cell viability of osteoclast progenitor cells according to the treatment concentration of peppermint hot water extract (A) and peppermint 70% ethanol extract (B). * and ** indicate that the cell viability of the experimental group treated with the peppermint extract compared to the control group not treated with the peppermint extract of the present invention was statistically significantly increased, * is p ⁇ 0.05, and ** is p ⁇ 0.01.
  • BMD bone density
  • BV/TV bone volume
  • the present invention relates to a health functional food composition for the prevention or improvement of bone diseases containing mint ( Mentha arvensis ) extract as an active ingredient.
  • the mint extract may be prepared by a method comprising the following steps, but is not limited thereto:
  • step (3) Concentrating the filtered extract of step (2) under reduced pressure and drying to prepare an extract.
  • the extraction solvent in step (1) is preferably selected from water, C 1 to C 4 lower alcohols or mixtures thereof, more preferably water or ethanol, and still more preferably water, but is not limited thereto.
  • the extraction method may use all conventional methods known in the art, such as filtration, hot water extraction, immersion extraction, reflux cooling extraction, and ultrasonic extraction.
  • the extraction solvent is preferably extracted by adding 1 to 20 times the weight of the dried mint, and more preferably 5 to 15 times the weight of the dried mint.
  • the extraction temperature is preferably 20 ⁇ 110 °C, but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 0.5 to 10 hours, more preferably 0.5 to 5 hours, but is not limited thereto.
  • the vacuum concentration in step (3) is preferably, but not limited to, a vacuum vacuum concentrator or a vacuum rotary evaporator.
  • drying under reduced pressure, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying is preferable, but is not limited thereto.
  • the mint extract is preferably extracted from mint leaves, but is not limited thereto.
  • the peppermint extract is characterized by inhibiting the differentiation of osteoclasts and promoting bone formation, the bone disease may be caused by bone loss, and the bone disease is osteoporosis, osteoporotic fracture, bone loss, bone defect, nonunion. It is preferable that any one selected from among fractures, osteodystrophy, osteomalacia, osteomalacia fractures, osteogenesis disorders, neoplastic bone destruction, periodontal diseaes, and degenerative bone diseases is preferable. It is not limiting.
  • composition is preferably prepared in any one formulation selected from powder, granules, pills, tablets, capsules, candy, syrup, and beverages, but is not limited thereto.
  • the mint extract When the health functional food composition of the present invention is used as a food additive, the mint extract may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be suitably determined according to the purpose of its use (prophylactic, health or therapeutic treatment).
  • the composition of the present invention is added in an amount of 15 parts by weight or less, preferably 10 parts by weight or less, based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • Examples of foods to which the extract can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health functional foods in the ordinary sense.
  • composition of the present invention When used as a health drink, it may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as an additional component like a conventional drink.
  • natural carbohydrates are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclotenstrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • sweetener natural sweeteners such as taumarin and stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin or aspartame, and the like can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 g of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal agents, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonic acid It may contain a carbonation agent used in beverages, and the like.
  • the composition of the present invention may contain the pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, and vegetable beverage. These components may be used independently or in combination. The proportion of these additives is not very important, but the composition of the present invention is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of bone diseases containing mint (Mentha arvensis) extract as an active ingredient.
  • mint Mex arvensis
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the active ingredient, and may be in various oral or parenteral formulations.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include capsules, powders, granules, tablets, pills, etc., and such solid preparations include at least one excipient in one or more compounds, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose ( lactose), gelatin, etc.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., and various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, preservatives, etc. in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilisates, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspending solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • a base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycero gelatin, and the like can be used.
  • parenteral administration it is preferable to select external or intraperitoneal, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebrovascular injection.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the level of the effective amount is determined by the type, severity, and drug activity of the patient. , sensitivity to drugs, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the dosage of the composition of the present invention varies depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease.
  • the composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers.
  • the present invention relates to a composition for differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts containing a peppermint extract as an active ingredient.
  • Mesenchymal stem cells in the bone marrow differentiate into cartilage, bone tissue, ligament, and bone marrow matrix, and are stem cells suitable for tissue regeneration with immunomodulatory and inhibitory functions.
  • Mesenchymal stem cells refer to stem cells present in cartilage, bone tissue, adipose tissue, and bone marrow stroma, which are differentiated from the live mesoderm by division of a fertilized egg.
  • the mesenchymal stem cells in the present invention should grow attached to the bottom in culture conditions, have the ability to differentiate into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes in vitro, express CD73, CD90 and CD105, and c-kit , is characterized by the absence of expression of CD11b, CD19, CD14, CD34, CD45, CD14, CD79 and HLA-DR.
  • composition of the present invention means that it can promote bone regeneration or bone formation.
  • ethanol extract of mint 500 g of mint leaves are put in 3.5 liters of 70% (v/v) ethanol, extracted under reflux for 3 hours (Heating mantle), filtered with Qualitative Filter Paper ( ⁇ 185 mm), and then filtered with a rotary evaporator. and then freeze-dried. After dissolving in dimethyl sulfoxide, ethanol extract of peppermint was used for the experiment.
  • the purpose of this study was to determine whether peppermint extract inhibits the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts.
  • the osteoclast progenitor cells were treated with peppermint hot water extract and peppermint ethanol extract by concentration, and the number of osteoclasts was analyzed accordingly.
  • bone marrow cells of mice were cultured in ⁇ -MEM medium containing M-CSF (60 ng/ml) and 10% FBS for 3 days to obtain bone marrow cell-derived macrophages (BMM), which were then transformed into osteoclast progenitors. was used.
  • BMM bone marrow cell-derived macrophages
  • the obtained BMM was placed in 1 ⁇ 10 4 per well of a 96-well plate and then cultured in a medium containing M-CSF (60 ng/ml) and RANKL (50 ng/ml) for 4 days.
  • TRAP Sterate-resistant acid phosphatase
  • TRAP-positive cells having three or more nuclei (osteoclasts) cells, osteoclast) were counted.
  • the osteoclast differentiation inhibitory effect was statistically significant by the treatment with 33.3, 100, and 200 ⁇ g/ml peppermint hot water extract, and the osteoclast differentiation inhibitory effect was also statistically significant by the treatment with the ethanol extract of 100 ⁇ g/ml peppermint. was significantly (Fig. 1).
  • the purpose of this study was to determine whether peppermint extract promotes osteoblast differentiation.
  • the mesenchymal stem cells were treated with hot peppermint extract by concentration, and the degree of differentiation into osteoblasts was analyzed by Alizarin Red S staining.
  • the bone marrow cell-derived macrophages (BMM) of Example 2 were put in 2 ⁇ 10 4 per well of a 96-well plate, and then in a medium containing M-CSF (60 ng/ml), peppermint hot water at various concentrations for 1 day. Extracts or ethanol extract samples of peppermint were added and incubated. Cell viability was confirmed by measuring the absorbance at 450 nm using a cell counting kit-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo Inc.).
  • the progenitor cell viability of osteoclasts was increased by treatment with hot water extract of peppermint at 33.3, 100 and 200 ⁇ g/ml ( FIG. 3A ).
  • Bone mineral density (BMD) and bone volume (bone volume/total volume, BV/TV) of cancellous femoral bone were analyzed by oral administration of peppermint hot water extract to ovariectomized mice.
  • mice 24 6-week-old female C57BL/6J mice (Central Experimental Animal, Seoul) were acclimatized for 1 week, and bilateral ovariectomy (OVX, 18 mice) and provisional surgery (Sham, 6 mice) were performed on 7-week-old mice. did. After 1 week, they were allowed to freely ingest a low-fat diet (D12450B, Research diet), and among the bilateral ovariectomy (OVX) mice, 6 mice were optionally given 0.1 g/kg of hot peppermint extract dissolved in sterile distilled water for 5 weeks. It was orally administered once a day for 6 animals, and 0.3 g/kg of mint hot water extract dissolved in sterile distilled water was orally administered once daily for 5 weeks.
  • OVX bilateral ovariectomy
  • mice provisional surgery (Sham, 6 mice) group and the remaining bilateral ovariectomy (OVX) control group (6 mice) were orally administered with sterile distilled water once daily for 5 weeks. Then, the femur was removed and fixed with 10% neutral formalin. After micro-computed tomography (micro-CT, SkyScan 1276, Bruker) of the femur, bone mineral density (BMD) and bone volume (BV/TV) of trabecular bone were analyzed.
  • micro-CT micro-computed tomography
  • BMD bone mineral density
  • BV/TV bone volume
  • bone density (BMD) and bone volume (BV/TV) of the ovariectomized (OVX) control group were statistically significantly decreased compared to the non-ovariectomized (Sham) group, and 0.1 and 0.3 g compared to the ovariectomized control group.
  • Bone density (BMD) and bone volume (BV/TV) of cancellous bone in the group administered with peppermint hot water extract at /kg were statistically significantly increased ( FIG. 4 ).
  • Example 2 The data obtained in Examples 2 to 4 of the present invention were expressed as mean ⁇ standard deviation, and in the statistical analysis obtained in Example 5, the data were expressed as mean ⁇ standard error. Calculated by one-way ANOVA with Dunnett's test.

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Abstract

본 발명은 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 박하 추출물이 파골세포 분화 억제 및 조골세포의 분화 촉진 효과가 있으며, 파골세포의 전구세포의 생존율을 증가시키고, 난소절제 동물모델에서 해면골 골밀도 및 골체적을 증가시키는 효과가 있는 것이다. 따라서 본 발명의 박하 추출물은 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 건강기능식품 또는 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 박하( Mentha arvensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.
뼈(bone)는 세포, 콜라겐성 기질 및 무기질 성분으로 구성된 매우 복잡한 조직이다. 이들은 장기의 보호뿐만 아니라, 조혈화에 필요한 미세 환경제공과 같은 기본적이며 다양한 기능을 제공하여 준다. 또한, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉, 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.
성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적이고, 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골재형성(bone remodeling)이라고 한다.
오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다. 골재형성은 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려졌다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK(receptor activator of nuclear factor-κB)에 결합하면 파골 전구세포가 거대 다핵 파골세포로 성숙화(maturation)되어 골 흡수(bone resorption)가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK 사이의 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다. 이러한 파골세포의 활성으로 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴가 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다.
한편, 박하( Mentha arvensis)는 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 여러해 살이 숙근초로서, 식물자체에 방향성을 가지고 있고 직립하여 상부에서 분지되어있다. 박하의 주요성분으로는 알파-피넨(alphapinene(+,-)), 아니스알데히드(anisaldehyde), 다우코스테롤 (Daucosterol), 유제놀(Eugenol), 리날롤(Linalool), 멘톤(Menthone), (+)-네오멘톨((+)-Neomenthol) 등이 있다. 박하는 청량하면서도 산뜻한 향을 발산하고, 피부나 두피에 존재하는 습진, 옴 등을 일으키는 병원성 진균, 대장균, 포도상구균 등의 미생물에 대해서 살균 및 항균작용을 갖는다. 또한, 피부의 점막과 혈관을 수축하는 작용, 신경말초를 마비시키는 작용, 통증을 멎게 하는 작용, 소양감을 멈추게 하는 작용 등이 있어서 피부에 특유의 청량감을 주어 피부병을 개선하고 피부 진정작용과 항산화 효과를 가지는 것으로 알려져 있으며, 박하유의 주성분인 멘톨은 도포제, 진통제, 흥분제, 또는 건위제 등으로 약용되며 치약, 사탕, 잼, 화장품, 담배 등에 향료나 청량제로서 사용된다.
골질환 관련 선행기술로, 한국등록특허 제1864719호에 혼합 한약재 추출물을 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2063962호에 캄펜을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 상기 박하 추출물이 파골세포 분화 억제 및 조골세포의 분화 촉진 효과가 있으며, 파골세포의 전구세포의 생존율을 증가시키고, 난소절제 동물모델에서 해면골 골밀도 및 골체적을 증가시키는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 박하( Mentha arvensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 중간엽줄기세포의 조골세포로의 분화용 조성물을 제공한다.
본 발명은 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 박하 추출물이 파골세포 분화 억제 및 조골세포의 분화 촉진 효과가 있으며, 파골세포의 전구세포의 생존율을 증가시키고, 난소절제 동물모델에서 해면골 골밀도 및 골체적을 증가시키는 효과가 있는 것이다.
도 1은 박하 열수 추출물(A) 및 박하 70% 에탄올 추출물(B)의 처리 농도에 따른 파골세포 형성 억제효과를 확인한 결과이다. **은 본 발명의 박하 추출물을 처리하지 않은 대조군 대비 박하 추출물을 처리한 실험군의 파골세포 수가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.01이다.
도 2는 박하 열수 추출물의 처리에 따른 조골세포 분화 촉진 효과를 확인한 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S) 염색 결과이다. **은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 박하 열수 추출물을 처리한 군의 조골세포 분화가 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.01이다.
도 3은 박하 열수 추출물(A) 및 박하 70% 에탄올 추출물(B)의 처리 농도에 따른 파골세포 전구세포의 세포생존율을 확인한 결과이다. *, **은 본 발명의 박하 추출물을 처리하지 않은 대조군 대비 박하 추출물을 처리한 실험군의 세포생존율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이다.
도 4는 난소절제(OVX) 마우스 모델에서 박하 열수 추출물의 경구 투여에 따른 대퇴 해면골의 골밀도(BMD)(A) 및 골체적(BV/TV)(B) 변화를 확인한 결과이다. ##는 난소를 절제하지 않은 정상 마우스군(Sham) 대비 난소를 절제한 마우스 군(OVX)의 대퇴 해면골의 골밀도(BMD) 및 골체적(BV/TV)이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.01이고, *, **은 난소절제 마우스군(OVX) 대비 난소절제 후 0.1 및 0.3g/kg의 박하 열수 추출물을 투여한 군의 해면골 골밀도 또는 골체적이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이다.
본 발명은 박하( Mentha arvensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 박하 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
(1) 박하에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
(2) 단계 (1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
(3) 단계 (2)의 여과한 추출물을 감압 농축하고 건조하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C 1~C 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 물 또는 에탄올이고, 더욱더 바람직하게는 물이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 건조된 박하 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이다. 추출온도는 20~110℃인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 0.5~10시간인 것이 바람직하며, 0.5~5시간이 더욱 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 (3)의 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 박하 추출물은 박하 잎을 추출한 것이 바람직하지만 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 박하 추출물은 파골세포의 분화를 억제하고 골생성을 촉진하는 특징이 있고, 상기 골질환은 골소실에 의해 야기될 수 있으며, 상기 골질환은 골다공증, 골다공증성 골절, 골소실증, 골결손, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 종양에 의한 골파괴 (Neoplastic bone destruction), 치주질환(Periodontal diseaes)에 의한 골파괴 및 퇴행성 골질환 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 박하 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량부 이하, 바람직하게는 10중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합체 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 조성물을 건강 음료로 사용할 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 텍스트린, 사이클로텐스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마린, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린 또는 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100g당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g이다. 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물은 100중량부 당 0.01~0.1중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 박하( Mentha arvensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 환제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량의 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 중간엽줄기세포의 조골세포로의 분화용 조성물에 관한 것이다.
뼈속 골수에서의 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 연골, 골조직, 인대, 골수기질로 분화하며 면역조절 및 억제기능이 있는 조직 재생에 적합한 줄기세포이다. 중간엽줄기세포는 수정란이 분열하여 생기 중배엽에서 분화된 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질(stroma) 등에 존재하는 줄기세포를 의미한다. 본 발명에서의 중간엽줄기세포는 배양조건에서 바닥에 부착되어 자라야 하며, 시험관내에서 뼈모세포, 지방세포, 연골세포로 분화하는 능력이 있는 것이며, CD73, CD90 및 CD105를 발현하고, c-kit, CD11b, CD19, CD14, CD34, CD45, CD14, CD79 및 HLA-DR의 발현이 없는 것이 특징이다.
본 발명의 조성물에 의한 중간엽줄기세포의 조골세포로의 분화 촉진은 골재생 또는 골형성을 촉진할 수 있음을 의미한다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 박하( Mentha arvensis ) 추출물 제조
박하의 열수 추출물은 박하잎 500g을 증류수 3.5ℓ에 넣고 3시간 동안 환류추출(Heating mantle) 후 정성여과지(Qualitative Filter Paper, Ø185mm)로 여과하여 동결 건조하였다. 세포 실험에서는 증류수로 녹인 박하 열수 추출물을 0.22㎕ 필터로 여과 후 실험에 사용하였고, 동물 실험에서는 동결 건조된 추출물을 멸균증류수로 녹여 사용하였다.
박하의 에탄올 추출물은 박하잎 500g을 70%(v/v) 에탄올 3.5ℓ에 넣고 3시간 동안 환류추출(Heating mantle) 후 정성여과지(Qualitative Filter Paper, Ø185mm)로 여과한 후 회전 농축기(Rotary evaporator)로 농축한 다음 동결 건조하였다. 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide)로 녹인 후 박하 에탄올 추출물을 실험에 사용하였다.
실시예 2. 박하 추출물의 파골세포 분화에 대한 효과 분석
박하 추출물이 파골세포의 전구세포가 파골세포로 분화하는 것을 억제하는지 여부를 확인하고자 하였다. 파골세포 전구세포에 박하 열수 추출물과 박하 에탄올 추출물을 농도별로 처리하고 이에 따른 파골세포 수를 분석하였다.
구체적으로, 마우스의 골수 세포를 M-CSF(60ng/㎖)와 10% FBS를 함유한 α-MEM 배지에 3일 동안 배양하여 골수세포 유래 대식세포(BMM)를 수득하여 이를 파골세포 전구세포로 사용하였다. 파골세포를 생성하기 위해, 상기 수득한 BMM을 96-웰 플레이트의 웰당 1×10 4개 넣은 후 M-CSF(60ng/㎖) 및 RANKL(50ng/㎖)을 포함하는 배지에 4일 동안 배양하였고, 같은 배양조건에서 BMM에 11.1, 33.3, 100 및 200㎍/㎖의 박하 열수 추출물 및 11.1, 33.3 및 100㎍/㎖의 에탄올 추출물 처리하였다. 세포를 10% 포르말린으로 고정한 후 나프톨 AS-MS 포스페이트 및 패스트 레드 바이올렛 LB 염(Fast red violet LB salt)을 이용하여 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색하였고, 핵이 3개 이상인 TRAP 양성세포(파골세포, osteoclast)를 계수하였다.
그 결과, 33.3, 100 및 200㎍/㎖의 박하 열수 추출물 처리에 의해서 파골세포 분화 억제 효과가 통계적으로 유의미하게 나타났고, 100㎍/㎖의 박하 에탄올 추출물 처리에 의해서도 파골세포 분화 억제 효과가 통계적으로 유의미하게 나타났다(도 1).
실시예 3. 박하 추출물의 조골세포 분화에 대한 효과 분석
박하 추출물이 조골세포 분화를 촉진하는지 여부를 확인하고자 하였다. 중간엽줄기세포에 박하 열수 추출물을 농도별로 처리하고 이에 따른 조골세포로의 분화 정도를 Alizarin Red S 염색으로 분석하였다.
구체적으로, 96웰 플레이트의 웰당 1.7×10 4개의 마우스의 골수 유래 중간엽줄기세포(D1 ORL UVA)를 넣은 후 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에 2일 동안 배양하였다. 10% FBS를 함유한 α-MEM 배지로 교체 후 아스코르브산(ascorbic acid, 50㎍/㎖) 및 β-글리세롤포스페이트(β-glycerophosphate, 5mM)를 8일 동안 처리하여 조골세포 분화를 유도하였고, 동일한 배양조건에서 11.1 및 33.3㎍/㎖의 박하 열수 추출물을 처리하였다. 세포를 10% 포르말린으로 고정한 후 조골세포 분화에 따른 석회화(mineralization) 정도를 확인하기 위해 Alizarin red S로 염색하였다. 10% 아세트산을 이용하여 염색된 Alizarin red S를 추출하여 농도를 측정하였다.
그 결과, 33.3㎍/㎖의 박하 열수 추출물을 처리함으로써, 통계적으로 유의미하게 조골세포 분화를 촉진하는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 4. 박하 추출물의 세포 생존에 대한 효과 분석
박하 추출물의 파골세포의 전구세포의 생존을 억제하는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2의 골수세포 유래 대식세포(BMM)를 96웰 플레이트의 웰당 2×10 4개 넣은 후 M-CSF(60ng/㎖)를 함유하는 배지에 1일 동안 다양한 농도의 박하 열수 추출물 또는 박하 에탄올 추출물 시료를 첨가하여 배양하였다. 세포 계수 키트-8(Cell counting Kit-8, Dojindo Inc.)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율(Cell viability)을 확인하였다.
그 결과, 33.3, 100 및 200㎍/㎖의 박하 열수 추출물 처리에 의해서 파골세포의 전구세포 생존율이 증가하였다(도 3A).
또한, 11.1, 33.3 및 100㎍/㎖의 박하 에탄올 추출물 처리에 의해서 파골세포의 전구세포 생존율이 증가하였다(도 3B).
실시예 5. 박하 열수 추출물의 골 소실에 대한 영향 분석
난소 절제 마우스에 박하 열수 추출물을 경구투여해서 대퇴 해면골의 골밀도(bone mineral density, BMD) 및 골체적(bone volume/total volume, BV/TV)을 분석하였다.
구체적으로, 6주령의 암컷 C57BL/6J 마우스 24마리(중앙실험동물, 서울)를 1주 순화 후, 7주령 마우스를 양측난소절제(OVX, 18마리) 및 가수술(Sham, 6마리)을 실시하였다. 1주일 후 저지방사료(D12450B, Research diet사)를 자유롭게 섭취하게 하고, 상기 양측난소절제(OVX) 마우스 중에서, 임의 선택적으로 6마리에게는 멸균증류수에 녹인 박하 열수 추출물을 마우스 kg당 0.1g씩 5주 동안 매일 1회 경구 투여하였고, 다른 6마리에게는 멸균증류수에 녹인 박하 열수 추출물을 마우스 kg당 0.3g을 5주 동안 매일 1회 경구 투여하였다. 한편, 가수술(Sham, 6마리)군과 나머지 양측난소절제(OVX) 대조군(6마리)은 멸균증류수를 5주 동안 매일 1회 경구 투여하였다. 이후, 대퇴골을 적출하고 10% 중성 포르말린으로 고정하였다. 대퇴골의 마이크로 컴퓨터단층촬영(micro-CT, SkyScan 1276, Bruker) 후, 해면골(trabecular bone)의 골밀도(bone mineral density, BMD) 및 골체적(bone volume/total volume, BV/TV)을 분석하였다.
그 결과, 난소 절제를 하지 않은 가수술(Sham)군 대비 난소절제(OVX) 대조군의 골밀도(BMD) 및 골체적(BV/TV)가 통계적으로 유의미하게 감소하였고, 난소절제 대조군 대비 0.1 및 0.3g/kg의 박하 열수 추출물을 투여한 군의 해면골 골밀도(BMD) 및 골체적(BV/TV)이 통계적으로 유의미하게 증가하였다(도 4).
[통계처리]
본 발명의 실시예 2~4에서 획득한 데이터는 평균±표준편차로 나타냈으며, 실시예 5에서 획득한 통계분석은 데이터는 평균±표준오차로 나타냈다. 던네트 테스트를 수반하는 일원배치 분산분석으로 계산하였다.

Claims (11)

  1. 박하( Mentha arvensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 박하 추출물의 추출용매는 물, C 1~C 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 박하 추출물은 박하 잎 추출물인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 박하 추출물은 파골세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제1항 있어서, 상기 박하 추출물은 골생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 골질환은 골소실에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 골다공증성 골절, 골소실증, 골결손, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 종양에 의한 골파괴 (Neoplastic bone destruction), 치주질환(Periodontal diseaes)에 의한 골파괴 및 퇴행성 골질환 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 박하( Mentha arvensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 박하( Mentha arvensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 중간엽줄기세포의 조골세포로의 분화용 조성물.
PCT/KR2021/005361 2020-04-29 2021-04-28 박하 추출물을 유효성분으로 함유하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 WO2021221457A1 (ko)

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