KR20040083466A - 골 성장의 촉진 및 골 건강의 유지용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 골 건강의 유지, 또는 골 장애의 예방, 경감 및/또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 이는 또한 영양제품, 보조식품, 치료제 또는 약제의 제조에서의 상기 조성물의 용도; 및 유효량의 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 골 성장의 촉진 또는 골 건강의 유지 방법에 관한 것이다.
Description
건강한 골은 골 형성과 흡수 간의 평형이 관여되는 효과적인 골 리모델링이 필요하다. 대부분의 골 질환은 증가된 골 흡수로 인한 것이며, 이의 저해가 일차적인 치료 목적이 되므로, 지금까지 개발된 대부분의 약제는 항흡수제이다. 예를 들어, 에스트로겐은 파골세포 생성 및 분화를 촉진하는 사이토킨의 생산을 차단한다. 유방 또는 자궁내막 조직에 대한 호르몬의 부작용의 위험을 감소시키면서 골 건강에 유익한 SERM (선택적 에스트로겐 반응 조절제)가 개발 중이다. 이들은 골 내에서 에스트로겐과 유사한 메카니즘에 의해 작동하는 것으로 생각된다. 비스포스포네이트(알렌드로네이트, 리제드로네이트 등)는 골 내에서 농축되며, 현재까지 가장 효과적인 골 흡수 저해제이다. 이들은 파골세포 활성 및 생존에 필요한 중요한 효소 경로를 저해한다. 칼시토닌은 파골세포 활성을 차단함으로써 골 흡수를 저해하는 폴리펩티드 호르몬이다. TNF 수용체/리간드류 성분 및 이의 신호화 경로, 특히 RANK/RANKL의 차단, 카텝신 K와 같은 골-특이적 메탈로프로테이나제(metalloproteinase)의 저해 또는 특정 키나아제의 저해가 새로운 목표에 포함된다.
골 형성을 자극하는 치료제의 개발은 흡수의 그것에 뒤쳐져 있다. 몇몇 화학물질 또는 약제는 인간에서 골 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, WO 9619246은 부갑상선 호르몬, PHT-관련 단백질 또는 작용제 (agonist) 를 한 달 이상 간헐적으로 투여하여 인간 환자에서 골 성장을 촉진시키는 방법을 기재한다. WO 9619501에서, 췌장효소-유래 인자는 골 흡수를 저해하고 골 세포의 증식을 촉진하며 골의 형성을 증가시킨다.
주요한 최근 발명은, 골 형태형성 단백질 2 (BMP-2) 가 골형성의 자극에 중요한 역할을 하고 스타틴 (콜레스테롤 합성의 저해를 통한 콜레스테롤-저하에 효과적인 약물) 이 부분적으로 BMP-2의 유도에 의해 매개되는 골 형성을 개선시킨다는 것을 입증하였다. 재조합 BMP-2의 전달은 골 또는 연골 형성을 유도하는 것으로 나타났다. US 6150328에는, BMP를 코딩하는 DNA로 형질전환된 세포를 배양하여 제조된 정제된 골 형태형성 단백질을 투여하는 것을 포함하는 골 및 연골 형성의 유도 방법이 기재되어 있다. 또한, WO 9711095는 신경 종양의 치료 및 골 성장 및 상처 치유를 위한 골 형태형성 단백질 조성물의 용도에 관한 것이다. BMP 외에도, 인슐린-유사 GF (IGF-1), 전환 GF-β(TGF-β), 섬유아세포 GF (FGF)와 같은 성장 인자가 골절 및 골 결함의 치유에서의 국부 요법으로 연구 중이다.그러나, 전신 투여는 장에서의 대사 및 또한 다른 조직에 미칠 수 있는 효과로 인해 문제가 있다. 유전자 치료가 하나의 선택권으로 제안되어 있다. 대체법은 조골세포의 유전자 또는 단백질 발현의 식이적 또는 약제학적 조절제에 의해, 조골 세포의 생산 조절을 목표로 한다.
이러한 화학물질 및 약제학적 화합물이 골 장애의 치료에 대해 입증되었다 하더라도, 포유류에서 골 성장을 촉진시키고 골/관절 장애를 예방, 경감 또는 치료하기 위한 안전하고 유효한 영양학적 방법을 제공하는 것은 관심의 대상이 될 것이다.
본 발명은 골 건강의 유지 또는 골 장애의 예방, 경감 및/또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 이는 또한 영양제품, 보조식품 또는 약제의 제조에서의 상기 조성물의 용도; 및 유효량의 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 골 성장의 촉진 또는 골 건강의 유지 방법에 관한 것이다.
도 1: 털조장나무 (Lindera benzoin; P.E. 740, 50 ㎍/㎖) 또는 향부자 (Cyperus Rotundus; P.E. 205, 10 ㎍/㎖)로부터의 추출물로 48시간 동안 처리한 후 RT-PCR에 의한 hPOB-tert 세포에서의 내생 BMP-2 mRNA 발현의 측정, 및 각각 3.8배 및 2.8배의 대조구에 의한 BMP-2 자극의 도시. BMP-2의 2.5배 유도를 나타내는 양성 대조구로 로바스타틴(0.5 ㎍/㎖)을 사용하여 이 분석에 대한 확인을 수행하였다.
도 2: 오시멈 그래티시멈(738), 사스카툰(734), 대두(Glycine max; 768), 향부자(205), 홍화(746)의 추출물에 대해 두개관 분석(A) 및 막공 분석(B)으로 측정한 저해값의 비교.
발명의 개요
따라서, 본 발명은, 첫번째 측면으로, 골 형태형성 단백질 발현을 유도하는 이의 능력에 대해 선택된 유효량의 하나 이상의 식물 또는 식물 추출물을 활성 성분으로 포함하는, 포유류에서의 골 장애의 예방, 경감 및/또는 치료 또는 골 건강의 유지를 위한 조성물을 제공한다.
주목할 만한 것은, 현재 몇몇 식물 또는 식물 추출물이 골 또는 연골 조직에서 내생 성장 인자의 조절을 통해 골 성장을 촉진시키는 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다는 것이다. 이들은 생체 내 및 국부적인 골 환경에서 골 형태형성 단백질 발현을 유도하는 능력을 가지며, 이는 골 형성 및 회복, 골 건강의 유지 또는 골 장애의 예방, 경감 및/또는 치료에 긍정적 영향을 미친다.
본 발명에 따른 조성물은 인간 또는 애완동물용 영양제품, 보조식품, 치료제또는 약제의 제조에 사용될 수 있다.
개체로의 본 발명에 따른 식품 조성물의 투여는 골절 치유 동안 골 재생을 개선시킨다. 본 조성물은 또한 골 흡수를 저해하는 데 도움이 된다. 이는 성장기 동안 골 형성 및 골 무기물 밀도를 증가시키고 최대 골 질량을 최적화하는 데 도움이 된다. 또한, 이러한 식품 조성물은 골 손실, 특히 포유류에서 나이와 관련된 골 손실을 감소시키는 데 도움이 된다. 따라서, 이는 나이에 따른 골 질량을 유지하는 데 도움이 되고 골다공증의 위험을 감소시킨다.
또한 이는 포유류에서 연골을 생성하고, 애완동물 또는 인간에서 골관절염을 예방하여, 개체의 활동성 또는 이동성을 보다 양호하게 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 포유류에서의 골 건강의 유지 및 골 장애의 예방, 경감 및/또는 치료용 조성물의 제조를 위한, 골 형태형성 단백질을 자극하고/하거나 골 흡수를 저해하는 이의 능력에 대해 선택된 식물 또는 식물 추출물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 상기한 바와 같은 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 골 장애의 예방, 경감 및/또는 치료 또는 골 건강의 유지 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 성장기 동안 골 형성, 골 무기물 밀도를 증가시키고 최대 골 질량을 최적화하고, 골다공증을 치료 또는 예방하며, 골절 치유 동안 골 재생을 자극하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 조성물을 개체가 섭식 (feeding) 하도록하는 단계를 포함하는, 애완동물 및 인간에서 골관절염을 치료, 경감 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 조성물을 개체에 공급하는 단계를 포함하는, 골 손실, 특히 인간 또는 애완동물의 나이와 관련된 골 손실을 감소시키는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 첫번째 목적에 관해, 본 발명에 따른 식물 또는 식물 추출물은 골 형태형성 단백질 발현의 유도를 통한 동화 에너지를 갖는 식물화학물질 (phytochemical)을 포함하고 또한 항흡수제일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 식물 또는 식물 추출물은 식물 공급원 (plant source)의 임의의 부분, 예를 들어, 잎, 괴경, 열매, 종자, 뿌리, 곡물, 배 또는 세포 배양물로부터 얻어진다. 식물 또는 식물 추출물은 식물 공급원에 따라 잎, 뿌리 및/또는 열매의 건조, 동결건조된 추출물, 또는 신선한 식물, 또는 당 분야에 공지된 무기 또는 유기 용매 추출 방법으로 수득된 강화된 분획물의 형태로 존재할 수 있다.
식물 또는 식물 추출물은 골 흡수를 저해하고/하거나 골 형성을 유도하는 이의 능력에 대해 선택되고, 특히 이는 생강 (Lindera), 쑥 (Artemisia), 창포 (Acorus), 홍화 (Carthamus), 카룸 (Carum), 천궁 (Cnidium), 채진목 (Amelanchier), 울금 (Curcuma) 민들레 (Taraxacum), 사초과 (Cyperus), 향나무 (Juniperus), 벚나무 (Prunus), 아이리스 (Iris), 치커리 (Cichorium), 도도나에아(Dodonaea), 에피메디엄 (Epimedium), 에리오고넘 (Eriogonum), 소야 (Soya), 박하 (Mentha), 오시멈 (Ocimum), 티무스 (thymus), 타나세텀 (Tanacetum), 질경이 (Plantago), 스피어민트 (Spearmint), 빅사 (Bixa), 비티스 (Vitis), 로즈마리 ( Rosemarinus), 타나세텀, 러스 (Rhus) 및 아네텀 (Anethum)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
가장 바람직한 구현예에서, 이는 예를 들어, 털조장나무 (Lindera benzoin)의 기생부, 쑥(Artemisia vulgaris)의 기생부, 창포(Acorus calamus)의 뿌리줄기, 홍화 (Carthamus tinctorius)의 종자 또는 꽃, 아멜란치어 오발리스 (Amelanchier ovalis)의 열매, 사스카툰 (Amelanchier alnifolia)의 열매, 치커리 (Cichorium intybus)의 뿌리, 울금 (Curcuma longa)의 뿌리줄기, 에피메디엄 브레비코르넘 (Epimedium brevicornum)의 기생부, 에리오고넘 자이갠튬 (Eriogonum giganteum)의 기생부, 서양민들레 (Taraxacum officinalis)의 잎 또는 뿌리, 향부자 (Cyperus rotondus)의 뿌리줄기, 도도네아에 비스코사 (Dodoneae viscosa)의 잎, 아이리스 팔리다 (Iris pallida) 세포 배양물, 저먼아이리스 (Iris germanica), 팔리다 또는 슈다코러스 (pseudacorus)의 뿌리줄기, 두송나무 (Juniperus communis)의 열매, 복사나무 (Prunus persica)의 종자, 소야 세포 배양물, 스피어민트 (Mentha spicata)의 기생부, 오시멈 그래티시멈 (Ocimum gratissimum)의 기생부, 티무스종 (Thymus sp.)의 기생부, 루스 글라브라 (Rhus glabra), 회향풀(aneth), 빅사 (Bixa)의 기생부, 비티스 비니페라(Vitis Vinifera)의 열매, 로즈마리 (Rosmarinus officinalis)의 기생부, 탠지 (Tanacetum vulgare), 캐러웨이 (Carum Carvi), 왕질경이(Plantago major)의 기생부, 옥시덴드론 아르보륨 (Oxydendron arboreum)의 기생부일 수 있다.
식물화학물질은 제니스테인 (genistein), 다이드제인 (daidzein), 락투신 (lactucin), 락투코피크린 (lactucopicrin), 3-데옥시락투신, 제라니올 (geraniol) 또는 카르본 (carvone)일 수 있다.
본 발명에 따른 식물 또는 식물 추출물은 식품 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 상기 조성물은 영양학적으로 균형있는 식품 또는 애완동물 식품, 건강 보조식품 (dietary supplement), 치료제 또는 약제학적 조성물의 형태일 수 있다.
식물 또는 식물 추출물은 단독으로 또는 예를 들어, 치커리, 차, 코코아와 같은 다른 식물과 함께 또는 항산화제, 지방산, 프레바이오틱 (prebiotic) 섬유, 글루코사민, 콘드로이틴 술페이트와 같은 다른 생물활성 분자와 함께 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 인간 소비용 식품 조성물이 제조된다. 이 조성물은 영양학적 완전 식품, 유제품, 냉장 또는 보존 안정성 음료, 수프, 건강보조식품, 식사대용품, 및 영양 바 (bar) 또는 과자가 될 수 있다.
본 발명에 따른 식물 추출물과 달리, 영양배합물은 단백질원을 포함한다. 식이 단백질은 바람직하게 단백질원으로 사용된다. 식이 단백질은 임의의 적합한 식이 단백질; 예를 들어, 동물성 단백질 (우유 단백질, 육류 단백질 및 난 단백질 등); 식물성 단백질 (콩 단백질, 밀 단백질, 쌀 단백질, 및 완두콩 단백질 등); 자유 아미노산의 혼합물; 또는 이의 조합물일 수 있다. 카세인과 같은 우유 단백질, 유장 단백질 및 콩 단백질이 특히 바람직하다. 상기 조성물은 또한 탄수화물원 및 지방원을 포함할 수도 있다.
영양배합물이 지방원을 포함할 경우, 지방원은 바람직하게 영양배합물의 약 5% 내지 약 55%의 에너지: 예를 들어, 약 20% 내지 약 50%의 에너지를 제공한다. 지방원을 구성하는 지질은 임의의 적합한 지방 또는 지방 혼합물일 수 있다. 식물성 지방; 예를 들어, 대두유, 팜유, 야자유, 홍화유, 해바라기유, 옥수수유, 캐놀라유, 레시틴 등이 특히 적합하다. 필요시, 우유 지방과 같은 동물성 지방을 첨가할 수도 있다.
탄수화물원을 영양배합물에 첨가할 수 있다. 이는 바람직하게 영양학적 조성물의 약 40% 내지 약 80%의 에너지를 제공한다. 예를 들어, 수크로스, 락토오스, 글루코스, 프룩토스, 옥수수 시럽 고형물, 및 말토덱스트린, 및 이의 혼합물과 같은 임의의 적합한 탄수화물이 사용될 수 있다. 필요시 식이 섬유를 첨가할 수도 있다. 사용시, 이는 바람직하게 영양배합물의 약 5% 이하의 에너지를 포함한다. 식이 섬유는 예를 들어, 콩, 완두콩, 귀리, 펙틴, 구아검, 아라비아검, 및 프룩토올리고당을 포함하는 임의의 적합한 원천으로부터 유래될 수 있다. 적합한 비타민 및 무기물이 적절한 지침에 맞는 양으로 영양배합물 중에 포함될 수 있다.
필요시 하나 이상의 식품 등급 유화제; 예를 들어, 모노- 및 디- 글리세라이드의 디아세틸 타르타르산 에스테르, 레시틴 및 모노- 및 디-글리세라이드를 영양배합물에 넣을 수 있다. 유사하게 적합한 염 및 안정화제가 포함될 수 있다.또한 비타민 및 무기물이 상기 식물 추출물과 조합될 수 있다.
영양학적 조성물은 바람직하게 장내; 예를 들어, 산제, 정제, 캡슐제, 액체 농축물, 고형 제품 또는 즉시 마실 수 있는 음료의 형태로 투여가능하다. 분말형태의 영양배합물을 제조하고자 할 경우, 균질 혼합물을 분무 건조기 또는 동결 건조기와 같은 적합한 건조 장치로 옮기고 분말로 전환시킨다.
다른 구현예에서, 영양 조성물은 프레바이오틱 제형과 함께 우유를 기재로 한(milk-based) 시리얼을 포함한다. 바람직하게 프레바이오틱 제형용 담체로 작용하는 우유 기재 시리얼은 유아용 시리얼이다.
다른 구현예에서, 통상의 식품 제품은 본 발명에 따른 하나 이상의 식물 또는 식물 추출물로 강화될 수 있다. 예를 들어, 발효유, 요구르트, 신선한 치즈, 응유(renneted milk), 과자의 품목, 예를 들어, 단 음료 또는 감미 음료, 사탕과자 바, 아침식사용 시리얼 플레이크 또는 바, 드링크제, 분유, 콩 기재 제품, 비-우유 발효 제품 또는 임상 영양을 위한 영양 보조식품.
상기 조성물 내의 식물 또는 식물 추출물의 양은 식물 공급원 및 이의 이용에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 유효 일일 투여량은 1일 당 활성 분자 약 1 mg 이상, 및 보다 바람직하게는 1 mg 내지 200 mg이다.
하나의 구현예에서, 상기한 바와 같은 하나 이상의 추출물 또는 식물화학물질을 개체에서 원하는 효과를 달성하는 데 충분한 양으로 포함하는 약제학적 조성물을 제조할 수 있다. 이 조성물은 정제, 액제, 캡슐제, 연질 캡슐제, 페이스트 또는 습제정제(pastille), 검, 또는 음용가능한 용액 또는 에멀젼, 건조된 경구용 보조식품, 습성 경구용 보조식품이 될 수 있다. 약제학적 조성물은 서로 다른 성질의 개별 활성 분자를 표적 조직에 전달하는 데 적합한 담체 및 부형제를 더 포함할 것이다. 담체/부형제의 종류 및 이의 양은 물질의 성질 및 예상되는 약물 전달 및/또는 투여 방식에 근거할 것이다. 당업자는 자신의 지식에 근거하여 적절한 성분 및 갈레누스제제(galenic) 형태를 선택할 것이 이해될 것이다.
본 발명에 따른 식물 또는 식물 추출물은 애완동물 식품 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 상기 조성물은 이의 정상적인 식이에 대한 보조식품으로서 또는 영양학적으로 완전한 애완동물 식품, 및 보다 바람직하게는 저칼로리성 애완동물 식품의 성분으로서 애완동물에 투여될 수 있다. 이는 또한 약제학적 조성물일 수도 있다.
식물 또는 식물 추출물은 단독으로 또는 예를 들어, 치커리, 차, 코코아와 같은 다른 식물과 함께, 또는 예를 들어, 항산화제, 지방산, 프레바이오틱 섬유, 글루코사민, 콘드로이틴 술페이트와 같은 생물활성 분자와 함께 사용될 수 있다.
바람직하게, 애완동물 식품 조성물은 15 kg의 개에 대해 건식 애완동물 식품 1 g 당 건조 식물 약 0.01 내지 0.5 g; 및 15 kg의 개에 대해 습식 애완동물 식품 1 g 당 건조 식물 0.001 내지 0.1 g을 포함한다.
본 발명에 따른 영양학적으로 완전한 애완동물 식품 조성물은 분말, 건조 형태, 치료제 또는 습식, 냉장 또는 보존 안정성 애완동물 식품 제품일 수 있다. 이는 냉장되거나 보존 안정성 제품으로 제공될 수 있다. 이러한 애완동물 식품은 당 분야에 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
애완동물 식품은 또한 선택적으로 프레바이오틱, 프로바이오틱 (probiotic) 미생물 또는 다른 활성제, 예를 들어 장쇄 지방산을 포함할 수 있다. 애완동물 식품 중의 프레바이오틱 물질의 양은 바람직하게 10 중량% 미만이다. 예를 들어, 프레바이오틱 물질은 애완동물 식품의 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량%를 차지할 수 있다. 프레바이오틱물질의 원료로 치커리를 사용한 애완동물 식품에 대해, 치커리는 사료 혼합물의 약 0.5 중량% 내지 약 10 중량%; 보다 바람직하게는 약 1 중량% 내지 약 5 중량%를 차지하도록 포함될 수 있다.
프로바이오틱 미생물을 사용할 경우, 애완동물 식품은 바람직하게는 애완동물 식품의 g 당 프로바이오틱 미생물 약 104내지 약 1010세포; 보다 바람직하게는 g 당 프로바이오틱 미생물 약 106내지 약 108세포를 포함한다. 애완동물 식품은 프로바이오틱 미생물의 혼합물 약 0.5 중량% 내지 약 20 중량%; 바람직하게는 약 1 중량% 내지 약 6 중량%; 예를 들어, 약 3 중량% 내지 약 6 중량%를 포함할 수 있다.
필요시, 영양학적으로 완전하게 하기 위해 애완동물 식품에 무기물 및 비타민을 보충한다. 또한, 필요시 예를 들어, 당류, 염, 향신료, 조미료, 향미제 등과 같은 다양한 다른 성분을 애완동물 식품에 넣을 수도 있다.
다른 구현예에서, 애완동물 식품의 질을 개선하기 위해 식이 보조제를 제조할 수 있다. 식이 보조제로서, 이는 캡슐화될 수 있거나 분말 형태로 제공되고 주식과 함께 또는 개별적으로 포장될 수 있으며, 습식 또는 건식 형태일 수 있다.예로써, 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 분말은 분말 형태로 봉지(sachet)내에 또는 겔 또는 지질 또는 다른 적합한 담체 내에 포장될 수 있다. 이러한 개별 포장 단위는 사용자 지시에 따라, 주식과 함께 또는 주식 또는 치료제와 함께 사용하기 위한 다단위 포장으로 제공될 수 있다.
유익한 효과를 얻기 위해 애완동물이 소비해야 할 애완동물 식품의 양은 애완동물의 크기, 애완동물의 유형, 및 애완동물의 나이에 근거할 것이다. 그러나, 체중 1 kg 당 건조 식물 약 0.5 내지 5 g의 일일 양을 제공하는 애완동물 식품의 양이 통상적으로 개와 고양이에 적절할 것이다.
상기한 바와 같은 식품 또는 애완동물 식품 조성물을 인간 또는 동물에 투여할 경우, 골절 치유 동안 골 재생이 개선된다. 이는 성장기 동안 골 형성 및 골 무기물 밀도를 자극하고 최대 골 질량을 최적화하는 데 도움이 된다. 특히 이는 유년기 동안 최적의 골 성장을 제공할 수 있다. 이러한 식품 조성물은 골 손실, 특히 포유류에서 나이와 관련된 골 손실 또는 장기적인 입원치료와 관련된 골 손실을 예방하는 데 도움이 된다. 이는 골다공증의 위험을 감소시키고 골절 후의 회복을 개선시킨다. 또한, 이는 포유류에서 연골을 생성하고, 애완동물 및 인간에서 골관절염을 예방하는 데 도움이 되어, 개체의 활동성 또는 이동성을 보다 양호하게 한다.
하기의 실시예는 예시의 수단으로만 제공되며 결코 본 발명의 주제를 제한하는 것으로 생각되어서는 안된다. 별다른 지시가 없는 한 모든 백분율은 중량%로 주어진다. 실시예는 도면의 간단한 설명 다음에 제시된다.
실시예 1: 골 형성 및 골 흡수에 대한 분석
1. 골 형성
골 형성에 대해서는 BMP-2(골 형태형성 단백질) 유전자 리포터 분석을 통해 및 골 흡수에 대해서는 두개관 분석을 통해 91개의 추출물을 스크리닝하였다. 이러한 91개의 추출물은 30가지의 서로 다른 식물에 대응하였다.
물질 및 방법
ㆍ 스크리닝 분석용 추출물의 제조:
헥산을 사용하여 분쇄 식물 재료의 지방을 제거하고 나서, 10 내지 90%, 바람직하게는 50%의 서로 다른 수분 백분율을 갖는 알콜과 물의 혼합물로 추출하였다. 알콜은 메틸 또는 에틸 알콜일 수 있으며, 추출물 1a를 생성하였다.
이러한 제 1추출물의 잔사의 분취량에 대해, α및 β글루코시다제를 사용하여 효소적 가수분해를 수행하였다. 산성 조건으로 효소를 대체할 수 있었다. 온화한 조건(실온)에서 또는 다른 산 농도로 환류하여 작업을 완료할 수 있었다. 비혼화성 용매, 바람직하게는 에틸아세테이트로 가수분해된 수성 상을 추출하여 추출물 2a를 생성하였다.
추출물은 건조, 동결-건조되거나 액체 형태로 제공될 수 있다. 일부 경우, 폴리비닐폴리피롤리돈(PVPP) 처리를 통해 폴리페놀을 폐기하여, 스크리닝 분석에 따른 인위물을 방지할 수 있다.
추출물 제조 후, 각 추출물을 칭량하고, 20 mg/㎖의 최종 농도로 디메틸술폭시드(DMSO)에 재용해시키고 -20℃에서 분취량으로 저장하였다. 이를 스톡 용액으로 사용하고, 이어서 각 분석용 매질에 희석시켰다. 분석 시스템에서 투여량 범위를 시험하였다.
ㆍ 골 형성 분석
BMP-2 루시퍼라제 분석 - 루시퍼라제 유전자에 작동적으로 연결된 BMP-2 프로모터를 포함하는 2T3 세포를 사용하여 상기 추출물의 활성을 결정하였다. 세포 용해물 내의 루시퍼라제 활성의 증가는 BMP-2 프로모터 활성의 증가를 반영한다. 100 ㎍/㎖의 초기 희석도에서 1/2 희석액을 사용하여 0.2 ㎍/㎖로 감소시키면서 추출물을 분석하였다. 세포 추출물 내의 루시퍼라제 활성을 측정하여 BMP-2 프로모터 활성을 측정하였다.
13가지 식물이 BMP-2 발현의 자극에서 상당한 양성 결과를 나타냈다.
라틴명 | 영명 | 부분 | 농도(㎍/㎖) | 활성 추출물/n˚ |
창포 (Acorus calamus) | 창포 (sweet flag) | 뿌리줄기 | 5 | MeOH/물/731 |
사스카툰(Amelanchier ovalis) | 서비스 베리(service berry) | 열매 | 10 | MeOH/물/219 |
쑥(Artemisia vulgaris) | 쑥/다북쑥속의 식물(wormwood) | 기생부 | 10 | 에틸아세테이트/225 |
향부자(Cyperus rotundus) | 너트그래스(nutgrass) | 뿌리줄기 | 10 | 에틸아세테이트/205 |
서양민들레 (Taraxacum officinalis) | 일반 민들레(common dandelion) | 잎 | 50 | 에틸아세테이트/750 |
털조장나무(Lindera benzoin) | 털조장나무(spice bush) | 기생부 | 50 | 에틸아세테이트/740 |
복사나무(Prunus persica) | 복숭아 | 종자 | 25 | 에틸아세테이트/772 |
대두(Glycine max) | 대두 | 세포 배양물 | 50 | 에틸아세테이트 768 |
아이리스 팔리다(Iris pallida) | 스위트 아이리스(sweet iris) | 괴경 | 100 | MeOH/물/239 |
로즈마리 (Rosmarinus officinalis) | 로즈마리 | 잎 | 50 | MeOH/물/2004에틸아세테이트/2005 |
카르비 (Carvi) | 캐러웨이 | 종자 | 25 | 에틸아세테이트/2074 |
타임 (Thyme) | 타임 (thyme) | 잎 | 25 | 에틸아세테이트/2067 |
스피어민트(Mentha spicata) | 박하 | 잎 | 100 | 에틸아세테이트/2072 |
비티스 비니페라(Vitis Vinifera) | 포도 | 열매 | 100 | 에틸아세테이트/2069 |
BMP-2를 자극하는 동일한 식물 및 이의 소분획물 (subfraction)의 신규 제제의 예는 하기와 같다:
털조장나무,활성 추출물/n˚에틸아세테이트/740/2059; 활성 소분획물/n˚ 2060
서양민들레,활성 추출물/n˚에틸아세테이트/750/2034; 활성 소분획물/n˚ 2035
향부자,활성 추출물/n˚에틸아세테이트/205/2011; 활성 소분획물/n˚ 2012, 2013
아이리스 팔리다,활성 추출물/n˚MeOH/물/239; 활성 소분획물/n˚ 760/762/2021, 2022
극성이 변화하는 용매에 의한 용리에 의해 역상 실리카 겔 카트리지 상에서 분획화시켜 소분획물을 제조하였다. 순수한 콩 이소플라본 제니스테인 및 다이드제인(10-6M)은 BMP-2를 자극했으나 에스트라디올은 그렇지 않았다.
BMP-2 유도는 에스트로겐-유사 활성을 제한하지 않는 것으로 보이는데, 이는 피토에스트로겐에 의해 자극되지만 에스트로겐 그 자체에 의해서는 자극되지 않기 때문이다. 이는 피토에스트로겐(제니스테인 및 다이드제인 등)의 활성이 비에스트로겐 메카니즘에 의해 매개될 수 있음을 의미한다. BMP-2 프로모터 활성은 에스트라디올에 의해 자극되지 않으므로, 이 시험에서는 식물 화합물의 에스트로겐성이 활성일 필요가 없다.
식물 | 활성 추출물 번호 | 농도(㎍/㎖) |
대두 | 에틸아세테이트/2001 | 10, 50 |
로즈마리 | MeOH/물/2004 | 10, 50 |
로즈마리 | 에틸아세테이트/2005 | 10 |
향부자 | 소분획물/2012 | 10, 50 |
아이리스 팔리다 | 소분획물/2022 | 10 |
타임 | 에틸아세테이트/2067 | 10 |
카르비 | 에틸아세테이트/2074 | 10 |
두개관 기관 배양에서의 골 형성의 예
사용된 방법은 문헌(Science 286: 1946-1949 (1999))에 기재되어 있다. 4일 지난 후 시험관 내 신생 설치류 두개관 분석으로 추출물을 평가하였다. 추출물과 함께 총 4일 동안 골을 배양하였다. 조직학에 의해 골 형성을 평가하였다.
2. 골 흡수, 두개관 분석
IL-1(10-10M) 자극 골 흡수를 저해하는 상기 추출물의 능력을 신생 골 흡수 분석으로 평가하였다. 각 추출물을 10 ㎍/㎖에서 골 흡수를 저해하는 이의 활성에 대해 평가하였다.
실시예 1에서와 같이 제조된 추출물의 IL-1(10-10M) 자극 골 흡수를 저해하는 능력을 신생 골 흡수 분석으로 평가하였다. 각 추출물을 10 ㎍/㎖에서 골 흡수를 저해하는 이의 활성에 대해 평가하였다.
양성으로 확인된 식물 추출물은 표 2에 나열되어 있다:
라틴명 | 영명 | 부분 | 활성 추출물/n˚ |
사스카툰 | 서비스베리 | 열매 | 에틸아세테이트/734 |
오시멈 그래티시멈 | 바질 | 잎 | MeOH/H2O/737 |
오시멈 그래티시멈 | 바질 | 잎 | 에틸아세테이트/738 |
홍화 | 홍화 | 종자 | 에틸아세테이트/746 |
향부자 | 너트그래스 | 뿌리줄기 | 에틸아세테이트/205 |
대두 | 콩 | 세포 배양물 | 768 |
이들 식물들은 골 흡수 분석에서 활성이었다: 사스카툰, 오시멈 그래티시멈 및 홍화 및 대두. 향부자는 골 흡수를 저해하고 BMP-2를 유도하였다.
실시예 2: 인간의 조골세포에서의 내생 BMP-2 발현에 대한 식물 추출물의 효과
실시예 1에서 BMP-2 유도에 대해 양성으로 확인된 식물을 BMP-2의 내생적 발현을 유도하는 이의 능력에 대해 인간의 골막/골모전구세포(preosteoblast) 세포주인 hPOB-tert에서 더 시험하였다. 조골세포에서의 이러한 시험은 실시예 1에나타난 결과를 확인시켰다.
예를 들어, 털조장나무(추출물 740, 50 ㎍/㎖), 및 향부자(추출물 205, 10 ㎍/㎖)의 추출물을 사용하여 48시간 동안 hPOB-tert 세포를 처리하였더니 BMP-2 발현을 대조구의 3.8 및 2.8배 자극하였다(도 1 참조). 2.5배의 BMP-2의 유도를 나타내는 양성 대조구로서 로바스타틴(0.5 ㎍/㎖)을 사용하여 이 분석에 대한 확인을 수행하였다.
콘플루언스 시, 0.05 ㎍/㎖ 로바스타틴 또는 식물 추출물을 사용하여 세포를 배양하였다. TRIzol 시약 (Gibco)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 제 1 가닥 cDNA 합성 키트 (Boehringer)를 사용하여 10 ㎍ RNA를 역전사하였다. 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머 (5':TTGCGGCTGCTCAGCATGTT; 3':CATCTTGCATCTGTTCTCGGAA)를 사용하여 55℃의 어닐링 온도에서 35주기 동안 BMP-2 cDNA 서열을 증폭시켰다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 PCR 산물을 분리해내고 에티듐 브로마이드 염색에 의해 검출하였다. NIH 영상 소프트웨어 (NIH Image Software)를 사용하여 정량을 수행하고 하우스키핑 유전자로 액틴을 사용하여 결과를 표준화하였다.
결과는 도 1에 나타나 있다.
골 흡수
두개관 분석에서 양성으로 확인된 식물 추출물을 골 흡수에 대한 제 2분석으로, 즉, 소의 골 조각에서 배양된 토끼 골 혼합 세포를 사용한 막공 (pit) 분석으로 재시험하였다 (Tezuka K. 등, 1992,Biochem. Biophys. Res. Commun. 186(2):911-7 및 Lorget F. 등, 2000,Biochem. Biophys. Res. Commun. 268(3): 899-903). TRAP (타르타르산염 저항성 산 포스파타제)로 염색하여 흡수 막공을 시각화하였다. 양성 세포를 계수하였다.
두 가지 분석 시스템에서의 10 ㎍/㎖에서의 추출물의 활성에 대한 비교는 도 2에 나타나 있다.
실시예 3: 건조 애완동물 식품
사료 혼합물은 옥수수 약 58 중량%, 옥수수 글루텐 약 5.5 중량%, 닭고기 약 22 중량%, 건조 치커리 2.5 중량%, 향부자 괴경 약 10%로 이루어지고, 나머지는 염, 비타민 및 미네랄로 이루어진다.
식품 혼합물을 프리컨디셔너에 공급하고 가습하였다. 그리고 나서 가습 사료를 압출기-취사계에 공급하고 젤라틴화하였다. 압출기에서 벗어난 젤라틴화된 매트릭스를 다이를 통과시키고 압출하였다. 압출물을 개에게 먹이기 적합한 조각으로 절단하고, 약 110℃에서 약 20분 동안 건조시키고 냉각시켜 펠렛을 형성하였다.
이러한 건조 개 사료는 골 및 연골 건강에 긍정적인 영향을 미치고 이의 이동성을 증가시킨다.
실시예 4: 보조식품이 첨가된 습식 통조림 애완동물 식품
가금류의 도체 (poultry carcarss), 돼지 폐 및 소 간 (간 것) 73%, 밀가루 16%, 염료 2%, 비타민 및 무기 염으로부터 혼합물을 제조하였다. 이 혼합물을 12℃에서 유화하고 푸딩의 형태로 압출하고 나서, 90℃의 온도에서 조리하였다.30℃로 냉각시키고 덩어리로 절단하였다. 이 덩어리 45%를 물 98%, 염료 1%, 및 구아 검 1%로 만들어진 소스 55%와 혼합하였다. 양철 캔을 충전하고 125℃에서 40분 동안 멸균하였다.
공급 전에 애완동물-식품와 혼합될 보조식품으로서, 일상 식품에 첨가될 분말 향부자 기생부 25 g을 추가 포장(예를 들어, 봉지)으로 포함시킨다. 애완동물에 대한 해당량은 1일 당 약 25 g이고 이는 상기 캔과 함께(최상단부에) 보조식품으로 제공될 수 있다.
Claims (19)
- 활성 성분으로 골 형태형성 단백질 발현을 유도하는 능력을 갖는 식물화학물질을 포함하는 유효량의 하나 이상의 식물 또는 식물 추출물을 함유하는, 인간 및 애완동물에서의 골 장애의 예방, 경감 및/또는 치료 및 골 건강의 유지를 위한 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 식물 또는 식물 추출물이 또한 골 흡수를 저해하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물이 식물 공급원 (plant source) 의 임의의 부분, 잎, 괴경, 열매, 종자, 뿌리, 곡물, 배 또는 세포 배양물로부터 유래되는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 또는 식물 추출물이 생강 (Lindera), 쑥 (Artemisia), 창포 (Acorus), 홍화 (Carthamus), 카룸 (Carum), 천궁 (Cnidium), 채진목 (Amelanchier), 울금 (Curcuma) 민들레 (Taraxacum), 사초과 (Cyperus), 향나무 (Juniperus), 벚나무 (Prunus), 아이리스 (Iris), 치커리 (Cichorium), 도도나에아 (Dodonaea), 에피메디엄 (Epimedium), 에리오고넘 (Eriogonum), 소야 (Soya), 박하 (Mentha), 오시멈 (Ocimum), 티무스(thymus), 타나세텀 (Tanacetum), 질경이 (Plantago), 스피어민트 (Spearmint), 빅사 (Bixa), 비티스 (Vitis), 로즈마리 (Rosemarinus), 타나세텀, 러스 (Rhus) 및 아네텀 (Anethum)을 포함하는 군으로부터 선택되는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 또는 식물 추출물이 털조장나무 (Lindera benzoin)의 기생부 (aerial part), 쑥 (Artemisia vulgaris)의 기생부, 창포 (Acorus calamus)의 뿌리줄기, 홍화 (Carthamus tinctorius)의 종자 또는 꽃, 아멜란치어 오발리스 (Amelanchier ovalis)의 열매, 사스카툰 (Amelanchier alnifolia)의 열매, 치커리 (Cichorium intybus)의 뿌리, 울금(Curcuma longa)의 뿌리줄기, 에피메디엄 브레비코르넘 (Epimedium brevicornum)의 기생부, 에리오고넘 자이갠튬 (Eriogonum giganteum)의 기생부, 서양민들레 (Taraxacum officinalis)의 잎 또는 뿌리, 향부자 (Cyperus rotondus)의 뿌리줄기, 도도나에아 비스코사 (Dodoneae viscosa)의 잎, 아이리스 팔리다 (Iris pallida) 세포 배양물, 저먼아이리스 (Iris germanica), 팔리다 (pallida) 또는 슈다코러스 (pseudacorus)의 뿌리줄기, 두송나무 (Juniperus communis)의 열매, 복사나무 (Prunus persica)의 종자, 소야 세포 배양물, 스피어민트 (Mentha spicata)의 기생부, 오시멈 그래티시멈 (Ocimum gratissimum)의 기생부, 티무스종 (Thymus sp.)의 기생부, 루스 글라브라 (Rhus glabra), 회향풀 (aneth), 빅사 (Bixa)의 기생부, 비티스 비니페라(Vitis Vinifera)의 열매, 로즈마리 (Rosmarinus officinalis)의 기생부, 탠지 (Tanacetum vulgare), 캐러웨이 (Carum Carvi), 왕질경이 (Plantago major)의 기생부, 옥시덴드론 아르보륨 (Oxydendron arboreum)의 기생부로부터 선택되는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물화학물질이 락투신, 락투코피크린, 3-데옥시-락투신, 제라니올 또는 카르본인 조성물.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 영양학적으로 균형있는 식품 또는 애완동물 식품, 건강 보조식품, 치료제 또는 약제학적 조성물의 형태인 조성물.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 애완동물에서 골절 치유 동안 골 재생을 돕고, 성장기 동안 골 형성 및 골 무기물 밀도를 증가시키고 최대 골 질량을 최적화하거나 골 손실, 특히 나이와 관련된 골 손실을 감소시키는 것을 돕는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 애완동물에서 연골의 생성을 돕는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 애완동물에서 골관절염을 예방하는 것을 돕고, 개체의 활동성 또는 이동성을 보다 양호하게 하는조성물.
- 인간 또는 애완동물에서의 골 장애의 예방, 경감 및/또는 치료 또는 골 건강의 유지를 위한 식품 또는 애완동물 식품 조성물의 제조를 위한, 골 형태형성 단백질을 자극하고/하거나 골 흡수를 저해하는 능력을 갖는 식물화학물질을 함유하는 식물 또는 식물 추출물의 용도.
- 제 11 항에 있어서, 상기 조성물이 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 것인 용도.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 식물 또는 식물 추출물이 단독으로 또는 치커리, 차, 코코아와 같은 다른 식물과 함께, 또는 항산화제, 지방산, 프레바이오틱 섬유, 글루코사민, 콘드로이틴 술페이트와 같은 다른 생물활성 분자와 함께 사용되는 용도.
- 유효량의 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 골 장애의 치료, 경감 또는 예방 또는 골 건강의 유지 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 개체가 섭식 (feeding) 하도록 하는 단계를 포함하는, 인간 또는 애완동물에서 성장기 동안 골형성, 골 무기물 밀도를 증가시키고 최대 골 질량을 최적화하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 개체에 공급하는 단계를 포함하는, 애완동물 및 인간에서 골관절염을 치료, 경감 및/또는 예방하는 방법.
- 유효량의 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 골다공증을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 개체에 공급하는 단계를 포함하는, 골절 치유 동안 골 재생을 자극하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 개체에 공급하는 단계를 포함하는, 인간 또는 애완동물에서의 골 손실, 특히 나이와 관련된 골 손실을 감소시키는 방법.
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