KR101318160B1

KR101318160B1 - 골형성을 촉진하는 효능을 가지는 ｄｓｘ 추출물을 유효성분으로 하는 약학 조성물

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Publication number: KR101318160B1
Application number: KR1020110138099A
Authority: KR
Inventors: 황귀서; 김복득; 박정일; 박만기; 이용재; 이진균
Original assignee: 주식회사 진생사이언스; 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2013-10-16
Also published as: KR20130070870A

Abstract

본 발명은 DSX의 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 DSX 추출물은 골세포의 분열능, 알칼리 포스파타아제 (Alkaline phosphatase) 활성, 콜라겐 합성 측정을 통해 골형성 증가 활성이 탁월함을 확인함으로써, 골다공증의 예방 및 치료용 약학조성물에 이용될 수 있다.

Description

골형성을 촉진하는 효능을 가지는 ＤＳＸ 추출물을 유효성분으로 하는 약학 조성물 {Pharmaceutical composition comprising extract of DSX showing an inhibitory effect of bone formation}

본 발명은 DSX 추출물은 당귀, 어성초, 시호, 백작약, 백출, 백복령, 목단피, 감초, 박하, 치자 및 생강의 새로운 복합생약추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] 동의 신계학(下), 두호경, 성보사, pp1239, 1241, 1243, 1248, 2003.

[문헌 2] 대한병리학회 : 병리학 PATHOLOGY, 고문사, pp1001~1008, 2000.

[문헌 3] Glucocorticoid-induced osteoporosis., Trends Endocrinol . Metab., Manelli, F. and Giustina, A., 11, pp79~85, 2000.

[문헌 4] Canalis E., Mechanisms of glucocorticoid Action in Bone: Implications to glucocorticoid- induced Osteoporosis. J. Clin . Endocri . Met., 81, pp3441-3447, 1996.

[문헌 5] Perspectives on glucocorticoid - induced osteoporosis ., Bone , Canalis, E. et al., 34, pp593-598, 2004.

[문헌 6] Zhang YH, et al., Studies on chemical constituents in spikes of Schizonepeta tenuifolia . Zhongguo Zhong Yao Za Zhi ., 31(15), pp1247-57, 2006 Aug.

[문헌 7] Tohda C, et al., Inhibitory effects of methanol extracts of herbal medicines on substance P- induced itch - scratch response . Biol Pharm Bull., 23(5), pp599-601, 2000 May.

[문헌 8] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p407-408 참조

[문헌 9] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p812-813 참조

[문헌 10] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p412-414 참조

[문헌 11] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p524-525 참조

[문헌 12] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p1025-1026 참조

[문헌 13] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p40-42 참조

[문헌 14] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p526-527 참조

[문헌 15] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p685-687 참조

[문헌 16] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p851-852 참조

[문헌 17] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p925-926 참조

[문헌 18] 정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p260-262 참조

골은 골 형성 세포인 조골세포(osteoblast)와 골 흡수 세포인 파골세포(osteoclast) 및 골세포(osteocyte)에 의해 끊임없이 형성되고 흡수되는 동적인 조직(dynamic tissue)이다. 골다공증은 파골 세포의 기능 및 작용 시간 증가, 또는 조골 세포의 기능 및 작용 시간 감소와 같이 골 형성이 골 흡수보다 상대적으로 저하되어 나타난다 (동의 신계학(下), 두호경, 성보사, pp1239, 1241, 1243, 1248, 2003).

골다공증은 발병원인에 따라 에스트로겐 결핍으로 인한 I형 골다공증, 노인성인 II형 골다공증, 약물 및 기타 질병으로 인한 속발성 골다공증으로 나눌 수 있다. 여성 폐경기 이후에 나타나는 I형 골다공증에서는 에스트로겐 결핍으로 파골세포에 대한 부갑상선 호르몬(PTH)의 작용이 증가되어 골 기질물질의 파괴와 칼슘 흡수가 증가된다. 이로 인해 높아진 혈중 칼슘은 피드백(feedback) 억제를 통해 PTH 유리가 억제하고, 동시에 Vit D 활성형인 1,25(OH)D 감소와 장내 칼슘 흡수 감소를 가져온다. 한편, 노인성 골다공증인 II 형 골다공증의 원인으로는 신장에서의 Iα-수산화효소 활성 감소와 Vit D의 활성화 감소 및 그에 따른 장내 칼슘 흡수의 저하, PTH 증가가 그 원인으로 알려져 있다 (대한병리학회 : 병리학 PATHOLOGY, 고문사, pp1001~1008, 2000).

골다공증의 주요한 원인 중 하나인 속발성인 경우, 주로 부신피질호르몬 투여로 나타나는데 (자가면역질환, 호흡기계 질환, 소화기계 질환, 장기이식, 종양 환자 등 부신피질호르몬이 쓰이는 질병에서 골다공증이 지속적으로 증가된 보고가 있다 (Glucocorticoid-induced osteoporosis., Trends Endocrinol . Metab., Manelli, F. and Giustina, A., 11, pp79~85, 2000). 부신피질호르몬은 조골세포(osteoblast)에 작용하여 세포 증식을 억제시키고 조골세포 분화를 감소시킨다. 또한, 부신피질호르몬은 골세포 증식능을 증가시키는 성장 인자인 IGF-I(insulin like growth factor I), IGF-II(insulin like growth factor II), PDGF(platelet derived growth factor), IGFBP-5 등을 억제시키는 것으로 보고되었다 (Canalis E., Mechanisms of glucocorticoid Action in Bone: Implications to glucocorticoid- induced Osteoporosis. J. Clin . Endocri . Met., 81, pp3441-3447, 1996). 이 결과, 비교원질 단백질로 칼슘과 결합하는 오스테오칼신(osteocalcin) 생합성과 교원질인 콜라겐 합성 억제와 골 형성이 저하된다. 이와는 별도로, 부신피질호르몬은 파골세포(osteoclast) 에 작용하여 세포분화를 촉진하고, 교원질 분해효소(collagenase)를 활성화시켜 골 재흡수(bone resoprtion)를 증가시킨다. 또한, 부신피질호르몬은 Vit D 작용을 억제하고 PTH 분비를 촉진하여, 장관 내 칼슘 흡수 억제, 신 세뇨관 칼슘 재흡수 억제, 뼈에 칼슘 침착을 억제하여 골다공증을 유발할 수 있다(Perspectives on glucocorticoid - induced osteoporosis ., Bone , Canalis, E. et al., 34, pp593-598, 2004).

당귀는 한국에서 재배되는, 미나리과 (Umbelliferae)에 속하는 왜당귀 (Angelica acutiloba) 또는 당귀(Angelica sinensis)의 뿌리를 지칭하며, 그 성분으로서는 프탈릭 산(phtalic acid), 리구스틸리드(ligustilide), 부틸리덴 프탈리드(butylidene phthalide), 크니딜리드 (cnidilide), 세스퀴테르펜(sesqtiterpene) 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 자궁수축작용, 항균효과 등의 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p407-408 참조).

어성초는 제주도 및 울릉도 등에 분포하는, 삼백초과 (Saururaceae)에 속하는 약모밀(Houttuynia cordata) 뿌리를 포함하는 전초를 지칭하며, 그 성분으로서는 데카노일 아세트알데히드 (decanoyl acetaldehyde), 메틸-n-노닐(nonyl)-케톤(ketone), 라날룰(linalool), 카리오필렌(caryophyllene), 미르센(myrcene), 퀘르시트린(quercitrin), 퀘르세틴(quercetin) 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 항균작용, 항바이러스 작용, 이뇨작용 등의 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p812-813 참조).

시호는 전국에 분포하는 미나리과 (Umbelliferae)에 속하는 시호 (Bupleurum falcatum) 및 이의 동속식물의 뿌리를 지칭하며, 그 성분으로서는 부플레우루몰(bupleurumol), 올레산 (oleic acid), 리놀렌산(linoleic acid), 팔미틴 산(palmitic acid), 스테아르 산(stearic acid), 사이코사포닌(saikosaponin) 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 해열작용, 진경 및 진통작용, 항염작용 등의 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p412-414 참조).

백작약은 전국에 분포하는 작약과 (Paeoniaceae)에 속하는 백작약 (Paeonia japonica) 및 이의 동속식물의 뿌리를 지칭하며, 그 성분으로서는 파에오니플로린(paeoniflorin), 정유, 지방유, 수지, 탄닌(tannin), 안식향산 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 진경작용, 혈압강하작용, 진경 및 진통작용, 항균작용 등의 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p524-525 참조).

백출은 전국에 분포하는 국화과(Compositae)에 속하는 큰꽃삽주(Atractylodes macrocephala) 및 동속식품의 뿌리를 지칭하며, 그 성분으로서는 아트락틸론(atractylone), 아트락틸롤(Atractylol), 비타민 A 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 설사, 부종 황달 등에 치료 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p1025-1026 참조).

백복령은 전국에 분포하는 구멍쟁이버섯과(Polyporaceae)에 속하는 복령(Poria cocos)의 균핵 내부의 백색부분을 얇은 조각이나 작은 각 모양으로 자른 것을 백복령이라 지칭하며, 그 균핵 성분으로서는 파키만(pachyman), 파키민산 (pachymic acid), 튜물로식산(tumulosic acid), 키틴질, 단백질, 스테롤 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 이뇨작용, 항균작용 등의 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p40-42 참조).

목단피는 전국에 분포하는 작약과(Paeoniaceae)에 속하는 모란(Paeonia suffruticosa)의 근피를 지칭하며, 그 성분으로서는 파에오놀(paeonol), 파에오노시드(paeonoside), 파에오놀리드(paeonolide), 파에오니플로린(paeoniflorin) 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 진통작용, 혈압강하작용, 항균작용 등에 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p526-527 참조).

감초는 중국, 몽고 등지에서 분포 및 재배되는 콩과(Leguminosae)에 속하는 감초(Glycyrrhiza uralensis)의 뿌리 및 근경을 지칭하며, 그 성분으로서는 글리시리진(gylcyrrhizin), 리퀴리티게닌(liquiritigenin), 리퀴리틴(liquiritin), 네오리퀴리틴(neoliquirititin) 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 해독작용, 항염, 항알레르기작용, 간보호 작용 등에 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p685-687 참조).

박하는 전국각지에 분포하는 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 박하(Mentha arvensis L)의 전초 및 잎을 지칭하며, 그 성분으로서는 멘톨(menthol), 멘톤(menthone) 캄펜(camphene), 리모넨(limonene), 피넨(pinene) 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 두통, 신경통 치료, 항경련 작용 등에 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p851-852 참조).

치자는 경기도 이남에서 재배되는 꼭두서니과(Rubiaceae)에 속하는 치자나무(Gardenia jasminoides) 및 이의 근속식물의 과실을 지칭하며, 그 성분으로서는 가르데닌(gardenin), 펙틴(pectin), 탄닌(tanin), 가르데노시드(gardenoside), 게니포시드(geniposide) 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 진경작용, 혈압강하작용, 이담작용, 지혈작용 등에 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p925-926 참조).

생강은 한국 남부지역에서 재배되는 생강과(Zingiberaceae)에 속하는 생강(Zingiber officinale)의 신선한 근경을 지칭하며, 그 성분으로서는 징기베롤(zingiberol), 징기베렌(zingiberene), 펠란드렌(phellandrene), 캄펜(camphene) 등의 성분들을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 소화촉진작용, 식욕증진작용, 항균작용, 항원충작용 등에 효능이 알려져 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998, p260-262 참조).

그러나 상기 문헌 어디에도 당귀, 어성초, 시호, 백작약, 백출, 백복령, 목단피, 감초, 박하, 치자 및 생강로 구성된 복합생약 혼합물(본원에서, DSX이라 함) 추출물의 골다공증에 대한 효과에 대한 어떠한 개시 또는 교시된 바가 없다.

본 발명자들은 골다공증 예방 및 치료 방법을 개발하기 위하여, 부신피질호르몬에 의해 감소되는 조골세포의 기능을 활성화시켜 골 형성을 증가시키는 약물을 찾고자 하였다. 이를 위하여 랫드의 두개골로부터 분리 배양한 골세포에 각각 DSX 추출물을 처리한 후, 조골세포의 분열능과 골형성을 나타내는 생화학적 지표에 미치는 영향을 측정하였고, 골세포에서의 분열능 증가, 알칼리 포스파타아제 활성 및 콜라겐 합성량 증가 효과를 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당귀, 어성초, 시호, 백작약, 백출, 백복령, 목단피, 감초, 박하, 치자 및 생강으로 구성된 복합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 복합생약은 당귀, 어성초, 시호, 백작약, 백출, 백복령, 목단피, 감초, 박하, 치자 및 생강이 배합(w/w)비가 1∼10;1∼10:1∼10:1∼10:1∼10:1∼10:1∼10:1∼10:1∼10: 1∼10:1∼10, 바람직하게는, 1∼5;1∼5:1∼5:1∼5:1∼5:1∼5:1∼5:1∼5:1∼5: 1∼5:1∼5, 보다 바람직하게는, 1∼2;1∼2:1∼2:1∼2:1∼2:1∼2:1∼2:1∼2:1∼2: 1∼2:1∼2의 배합비로 배합됨을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 의미한다.

이하, 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 DSX의 추출물은, 건조된 DSX을 세절하여 무게(㎏)의 약 1배 내지 20배, 바람직하게는 약 5배 내지 15배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물로, 20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 추출온도에서 약 0.5 내지 20시간, 바람직하게는 약 1 내지 10시간 동안 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출방법을 이용하여, 바람직하게는 환류 추출한 후, 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 수득할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 수득한 DSX 추출물은 랫드의 두개골로부터 분리 및 배양한 골세포에서 분열능 증가, 알칼리 포스파타아제 활성 및 콜라겐 합성량 증가 효과를 나타냄으로써, 발육 성장 촉진 작용 또는 골다공증의 예방 및 치료 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 DSX 추출물을 유효성분으로 함유하는 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 DSX 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 DSX 추출물은 랫드의 두개골로부터 분리 및 배양한 골세포에서의 분열능 증가, 알칼리 포스파타아제 활성 및 콜라겐 합성량 증가 효과를 나타냄으로써, 골다공증의 예방 및 치료용 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 DSX 추출물 처리 시, 조골세포 분열능을 측정하여 나타낸 도이고,
도 2는 본 발명의 DSX 추출물 처리 시, 조골세포에서 알칼리 포스파타아제 활성을 측정하여 나타낸 도이며,
도 3은 본 발명의 DSX 추출물 처리시, 조골세포의 콜라겐 합성량을 측정하여 나타낸 도이며,
도 4는 본 발명의 DSX 추출물 처리 시, 골세포의 세포 생존율을 측정하여 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. DSX 추출물의 제조

건조시킨 당귀, 어성초, 시호, 백작약, 백출, 백복령, 목단피, 감초, 박하, 치자 및 생강을 동량으로 배합한(w/w) 복합생약에 증류수를 중량의 10배를 가한 후 4시간 가온 추출하였으며, 추출물을 농축한 다음 냉동건조 후에 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

실험시 검액(부탄올 추출분획 분말)을 배지에 녹인 후 크기 (pore size) 0.45μm의 여과지에 통과시킨 후 실험예의 시료로 사용하였다 (이하, "DSX"라 함).

참조예 1. 실험동물의 준비

실험동물은 임신한 암컷 S.D. 랫드를 대한 바이오링크에서 구입하여 실험실에 적응시킨 후 사용하였다. 실험기간동안 고형사료와 물을 충분히 공급하여 자유롭게 섭취하도록 하였다.

참조예 2. 태아 두개골 세포 배양 (Fetal calvarial cell culture(FCS))

임신 21일 된 쥐의 자궁을 절개하여 태아를 꺼낸후, 후두부를 절개하고 두개골을 적출하였다. 두개골에 붙어있는 결체조직을 제거하고, HBSS로 세척했다. 두개골을 1.5ml의 콜라게나아제, 트립신, 0.5mM EDTA 용액에 넣어 37^oC에서 반응시켰다. 상등액을 취하여 500rpm에서 원심분리하여 침전된 골세포를 얻었다. PBS에 재현탁하여 1500rpm에서 원심분리하여 세척한 후, 이를 DMEM 배지에 넣어 현탁한 후 37^oC, 5% CO₂에서 배양하였다. 상등액을 제거하고 남은 두개골에 다시 1.5ml의 효소를 넣고, 상기 반응을 수회 반복하였다. 세포의 배지는 3일에 한 번씩 교환하였다. 배양한 세포는 2주후 트립신 처리하여 세포수를 측정한 후 실험에 사용하였다.

참조예 3. 약물 처리

상기 참조예 2에서 수득한 DSX 추출물 시료를 정상군(NC), 정상군에 1μg/ml의 DSX를 첨가한 군(DSX1), 정상군에 10μg/ml의 DSX를 첨가한 군(DSX10)으로 나누어 투여하였고, 이를 실험예에서 사용하였다.

참조예 4. 통계처리

모든 실험 결과는 ANOVA (one way analysis of variance)를 이용하여 통계 처리하였고, 유의성이 인정될 경우 스튜던트-뉴만-케울스 검정법(Student-Newman-Keuls Test)를 사용하여 p < 0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.

실험예 1. 골세포의 분열능 측정

상기 실시예에서 얻은 DSX의 골세포 분열능 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

상기 참조예 2에서 수득한 태아 두개골 세포(FCS)의 경우 1.0-3.010⁵/웰로 나누었으며, 배양한 세포의 수를 세기 위하여 세포의 배지를 제거하고, HBSS로 세포를 세척하였다. 이후 콜라게나아제, 트립신, 0.5mM EDTA를 가하여 세포를 배양판으로부터 분리하였다. 세포를 Isoton-2 용액을 이용하여 20배 희석한 후 세포계수기(sysmax F-820)로 세포의 수를 측정하였고, 결과를 하기 도 1에 나타내었다 (하기 도 1 참조).

실험결과, 하기 도 1에서 나타나는 바와 같이, 랫드 태자의 두개골로부터 분리한 골세포를 7일간 배양한 결과, 정상 세포에 비해 DSX를 1μg/ml 및 10μg/ml의 농도로 처리한 경우에 정상에 비해 유의한 증가를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 알칼리 포스파타아제( Alkaline phosphatase ) 활성 측정

상기 실시예에서 얻은 DSX의 알칼리 포스파타아제 활성을 측정하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

세포를 배양한 배양판을 냉각한 PBS로 세척한 후 세포를 스크레이퍼(scraper)로 긁어 내어 류펩틴(Leupeptin)이 함유된 냉각된 PBS에 현탁하였다. 이 현탁액을 냉각상태에서 초음파 분쇄기로 분해한 후 3000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리후 상등액을 취하여 0.56M 2-아미노-메틸 1-프로판올(2-amino-2-methy l-propanol), 1mM 염화마그네슘(MgCl₂ ₎, 10mM p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)를 함유한 반응액과 37^oC에서 10분간 반응시켰다. 0.2N 수산화나트륨(NaOH) 1ml를 가하여 반응을 중단시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였고, 실험결과를 하기 도 2에 나타내었다 (하기 도 2 참조).

실험결과, 하기 도 2에서 나타나는 바와 같이, 랫드 태자의 두개골로부터 분리한 골세포를 10일간 배양한 결과, 정상 세포에서의 ALP 활성에 비해 DSX를 1μg/ml, 10μg/ml의 DSX를 처리한 경우에 정상에 비해 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 콜라겐 합성량 측정

상기 실시예에서 얻은 DSX의 콜라겐 합성량을 측정하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

세포를 배양한 배양판을 PBS로 세척한 후 스크레이퍼(scraper)를 이용해 세포를 긁어내었다. 이를 5mM dithiothreitol이 함유된 50mM 트리스 완충용액에 현탁시킨 후 초음파 분쇄기로 분해시켰다. 이후, 100,000xg에서 30분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 펠렛에 6N HCl을 가하여 24시간동안 100^oC에서 가수분해 하였다. 이를 조심스럽게 6N 수산화나트륨(NaOH)으로 중화시킨 후, 물을 이용하여 적정한 농도로 희석하였다. 히드록시프롤린(Hydroxy-proline)은 아미노산 분석기(amino acid analyzer)를 이용하여 정량하였다.

실험결과, 하기 도 3에서 나타나는 바와 같이, 랫드 태자의 두개골로부터 분리한 골세포를 10일간 배양한 결과, 정상 세포에서의 콜라겐 생합성량에 비해 DSX를 1μg/ml, 10μg/ml의 농도로 처리한 경우에는 유의적으로 증가 시킴을 확인할 수 있었다 (하기 도 3 참조).

실험예 4. 세포 생존율 측정

상기 실시예에서 얻은 DSX의 세포 생존율을 측정하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

측정 결과, 하기 도 4에서 나타나는 바와 같이, 랫드 태자의 두개골로부터 분리한 골세포를 10일간 배양한 결과, 정상 세포에서의 생존율과 1μg/ml의 DSX를 처리한 군과 10μg/ml의 DSX를 처리한 경우에는 통계적으로 유의성있게 변화를 나타내지 않았다. (하기 도 4 참조).

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예의 DSX 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예의 DSX 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예의 DSX 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예의 DSX 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄ _,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예의 DSX 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims

당귀, 어성초, 시호, 백작약, 백출, 백복령, 목단피, 감초, 박하, 치자 및 생강으로 구성된 복합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 발육 성장 촉진용 또는 골다공증의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 복합생약은 당귀, 어성초, 시호, 백작약, 백출, 백복령, 목단피, 감초, 박하, 치자 및 생강이 배합(w/w)비가 1∼10;1∼10:1∼10:1∼10:1∼10:1∼10:1∼10:1∼10:1∼10: 1∼10:1∼10의 배합비로 배합됨을 특징으로 한 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 약학조성물.
제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 복합생약 추출물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함됨을 특징으로 하는 약학조성물.