PT1455601E - Composição para promoção do crescimento ósseo e manutenção da saúde óssea - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO PARA PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO ÓSSEO E MANUTENÇÃO DA SAÚDE ÓSSEA" A presente invenção refere-se a uma composição para manutenção da saúde óssea ou prevenção, alivio e/ou tratamento de distúrbios ósseos.
Antecedentes da Invenção
Os ossos saudáveis requerem uma remodelação óssea eficaz envolvendo um equilíbrio entre formação e ressorção ósseas. A maioria dos distúrbios ósseos é devido a ressorção óssea aumentada, tornando a sua inibição um objectivo terapêutico primário e, portanto, a maioria dos agentes farmacêuticos, desenvolvidos até à data, são anti-ressorção. Por exemplo, os estrogénios bloqueiam a produção de citocinas que promovem a génese e diferenciação de osteoclastos. Estão a ser desenvolvidos SERM (moduladores selectivos da resposta a estrogénios) que proporcionam vantagens para a saúde óssea, ao mesmo tempo que reduzem o risco de efeitos hormonais adversos sobre tecidos da mama ou do endométrio. Supõe-se que funcionam por um mecanismo semelhante ao estrogénio no osso. Os bisfosfonatos (tais como alendronato, risedronato, etc.) concentram o osso e são, até ao presente, os inibidores mais eficazes da ressorção óssea. Inibem uma via enzimática crítica, necessária para a actividade e sobrevivência dos osteoclastos. A calcitonina é uma hormona polipeptídica que inibe a ressorção 1 óssea por bloqueamento da actividade dos osteoclastos. Os novos alvos incluem bloqueamento dos membros da família de receptores/ligandos de TNF e as suas vias de sinalização, particularmente de RANK/RANKL, inibição de metaloproteinases específicas dos ossos, tal como a catepsina K, ou inibição de cinases específicas. 0 desenvolvimento de agentes terapêuticos que estimulam a formação óssea tem estado mais atrasado do que o dos de ressorção. São conhecidos alguns agentes químicos ou farmacêuticos para promoção do crescimento ósseo em humanos. Por exemplo, o documento WO 9619246 descreve um método para promoção do crescimento ósseo num doente humano por administração intermitente de hormona paratiróide, proteína relacionada com PTH ou um agonista durante, pelo menos, um mês. No documento WO 9619501, um factor derivado do pâncreas inibe a ressorção do osso e estimula as células ósseas a proliferar e aumenta a formação de osso.
Um desenvolvimento importante recente foi a demonstração do papel da proteína 2 morfogénica óssea (BMP-2) como um jogador chave na estimulação da formação óssea e que as estatinas (fármacos eficazes para abaixamento do colesterol através da inibição da síntese do colesterol) melhoram a formação óssea, em parte mediada por indução de BMP-2. Demonstrou-se que a administração de BMP-2 recombinante induz a formação de osso ou cartilagem. No documento US 6150328 é descrito um método para a indução da formação de osso e de cartilagem que compreende a administração de uma proteína morfogénica óssea purificada produzida por cultura de uma célula transformada com ADN que codifica BMP. Também o documento WO 9711095 descreve a utilização de composições de proteína morfogénica óssea para 2 tratamento de tumores neurais e o crescimento ósseo e a cicatrização de feridas. Além das BMP, factores de crescimento, tais como GF semelhante a insulina (IGF-1), factor de transformação do crescimento GF-β (TGF-β), factores de GF de fibroblastos (FGF) estão a ser investigados como terapêuticas locais na cicatrização de fracturas e defeitos ósseos. Contudo, a administração sistémica é problemática devido ao metabolismo no intestino e também devido a possíveis efeitos sobre outros tecidos. A terapia genética está a ser proposta como uma opção. A alternativa é ter como alvo a regulação da produção de osteoblastos, por reguladores dietéticos ou farmacêuticos da expressão dos seus genes ou proteínas.
Embora estes compostos químicos e farmacêuticos tenham sido comprovados para o tratamento de distúrbios ósseos, teria interesse proporcionar uma forma nutricional eficiente e segura para promover o crescimento ósseo e prevenir, aliviar ou tratar distúrbios ósseos/articulares em mamíferos. 0 documento US-B1-6274176 descreve uma composição compreendendo uma mistura de plantas para utilização como um agente anti-inflamatório para o alívio da artrite e da gota em mamíferos. 0 documento WO 01/02996 descreve uma composição compreendendo, pelo menos, uma planta específica para utilização no tratamento da osteoporose. O documento US 2001/012523 refere-se a composições nutricionais ou farmacêuticas contendo um extracto ou concentrado de uma planta do género anethum. As composições são úteis para o tratamento ou profilaxia de doenças ou patologias 3 que são caracterizadas por ressorção óssea aumentada, tal como a doença de Paget, doença óssea induzida por tumor ou, particularmente, osteoporose.
Sumário da Invenção
Assim, num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção, alivio e/ou tratamento de distúrbios ósseos ou manutenção da saúde óssea em mamíferos, que compreende, como um ingrediente activo, uma quantidade eficaz de, pelo menos, uma planta ou extracto de planta seleccionada pela sua capacidade para induzir a expressão da proteína morfogénica óssea, em que a planta ou extracto de planta é Rosmarinus.
Surpreendentemente, verificou-se agora que as plantas ou extractos de plantas Rosmarinus têm a capacidade de promover o crescimento ósseo através da regulação de factores de crescimento endógenos em tecido ósseo ou cartilaginoso. Têm a capacidade de induzir a expressão de proteína morfogénica óssea in vivo e em ambiente ósseo local, que tem um efeito positivo na formação e reparação óssea, na manutenção da saúde óssea ou prevenção, alívio e/ou tratamento de distúrbios ósseos. A composição de acordo com a invenção pode ser utilizada no fabrico de um produto nutricional, um suplemento, uma guloseima ou um medicamento destinado a humanos ou a animais de estimação. A administração a um indivíduo de uma composição alimentar de acordo com a presente invenção resulta numa regeneração óssea melhorada durante a cicatrização de fracturas. Ajuda a aumentar 4 a formaçao óssea e a densidade mineral óssea durante o crescimento e optimizar o valor máximo da massa óssea.
Ajuda a manter a massa óssea com a idade e reduz o risco de osteoporose.
Além disso, ajuda a construir cartilagem em mamíferos, a impedir osteoartrite em animais de estimação ou humanos, o que resulta numa melhor actividade ou mobilidade do indivíduo.
Descrição Pormenorizada da Invenção
Em relação ao primeiro objecto da presente invenção, a planta ou extracto de planta de Rosmarinus, de acordo com a invenção, contém compostos fitoquimicos que têm um potencial anabólico através da indução da expressão de proteína morfogénica óssea.
Numa forma de realização preferida, a planta ou extracto de planta é de qualquer parte da fonte da planta, e. g., folhas, túberas, frutos, sementes, raízes, grãos, embriões ou culturas de células. A planta ou o extracto de planta pode estar na forma de um extracto seco, liofilizado de folhas, raízes e/ou frutos dependente da fonte da planta, ou planta fresca, ou fracção enriquecida, obtida por um processo de extracção com solvente inorgânico ou orgânico conhecido na técnica.
Numa forma de realização mais preferida, podem ser as partes aéreas de Rosmarinus officinalis.
Os compostos fitoquimicos podem ser genisteína, daidzeína, 5 lactucina, lactucopicrina, 3-desoxi-lactucina, geraniol ou carvona. A planta ou extracto de planta, de acordo com a invenção, pode ser utilizada na preparação de uma composição alimentar. A referida composição pode estar na forma de um alimento ou alimento para animais de estimação nutricionalmente equilibrado, de um suplemento dietético, de uma guloseima ou de uma composição farmacêutica. A planta ou extracto de planta pode ser utilizada só ou em associação com outras plantas, tais como chicória, chá, cacau, ou com outras moléculas bioactivas, tais como anti-oxidantes, ácidos gordos, fibras prebióticas, glucosamina, sulfato de condroitina, por exemplo.
Numa forma de realização, é preparada uma composição alimentar para consumo humano. Esta composição pode ser uma fórmula completa nutricional, um produto lácteo, uma bebida refrigerada ou de longa duração, uma sopa, um suplemento dietético, um substituto de refeição e uma barra nutricional ou produto de confeitaria.
Além do extracto de planta de acordo com a invenção, a fórmula nutricional pode compreender uma fonte de proteína. As proteínas dietéticas são, de um modo preferido, utilizadas como uma fonte de proteína. As proteínas dietéticas podem ser qualquer proteína dietética adequada; por exemplo, proteínas animais (tais como proteínas do leite, proteínas de carne e proteínas de ovo); proteínas vegetais (tais como proteína de soja, proteína de trigo, proteína de arroz e proteína de ervilhas); misturas de aminoácidos livres; ou suas combinações. 6 São particularmente preferidas as proteínas do leite, tal como caseína, as proteínas do soro de leite e as proteínas de soja. A composição também pode conter uma fonte de hidratos de carbono e uma fonte de matéria gorda.
Se a fórmula nutricional inclui uma fonte de matéria gorda, a fonte de matéria gorda, de um modo preferido, proporciona cerca de 5% a cerca de 55% da energia da fórmula nutricional, por exemplo, cerca de 20% a cerca de 50% da energia . Os lípidos que constituem a fonte de matéria gorda podem ser qualquer matéria gorda ou mistura de matérias gordas adequadas. As matérias gordas vegetais são particularmente adequadas, por exemplo, óleo de soja, óleo de palma, óleo de coco, óleo de cártamo, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de canola, lecitinas e semelhantes. Se desejado também podem ser adicionadas gorduras animais, tais como gorduras de leite.
Pode adicionar-se uma fonte de hidratos de carbono à fórmula nutricional. De um modo preferido, proporciona cerca de 40% a cerca de 80% da energia da composição nutricional. Podem ser utilizados quaisquer hidratos de carbono adequados, por exemplo, sacarose, lactose, glucose, frutose, sólidos de xarope de milho e maltodextrinas, e as suas misturas. Também se pode adicionar fibra dietética se desejado. Se utilizada, de um modo preferido, compreende até cerca de 5% da energia da fórmula nutricional. A fibra dietética pode ser de qualquer origem adequada, incluindo, por exemplo, soja, ervilha, aveia, pectina, goma de guar, goma arábica e frutooligossacáridos. Podem ser incluídas na fórmula nutricional vitaminas e minerais adequados numa quantidade para satisfazer as directrizes apropriadas.
Podem ser incorporados na fórmula nutricional um ou mais 7 emulsionantes de qualidade alimentar se desejado, por exemplo, ésteres do ácido diacetil tartárico de mono- e di-glicéridos, lecitina e mono- e di-glicéridos. Analogamente, podem ser incluídos sais e estabilizadores adequados. As vitaminas e minerais também podem ser combinados com o extracto de planta. A composição nutricional é, de um modo preferido, administrável entericamente, por exemplo, na forma de um pó, comprimido, cápsula, concentrado líquido, produto sólido ou bebida pronta a beber. Se se deseja produzir uma fórmula nutricional em pó, a mistura homogeneizada é transferida para um aparelho de secagem adequado, tal como um secador por atomização ou liofilizador e convertida em pó.
Noutra forma de realização, uma composição nutricional compreende um cereal à base de leite conjuntamente com uma formulação prebiótica. De um modo preferido, o cereal à base de leite é um cereal infantil que actua como um transportador para a formulação prebiótica.
Noutra forma de realização, um produto alimentar corrente pode ser enriquecido com, pelo menos, uma planta ou extracto de planta de acordo com a presente invenção. Por exemplo, um leite fermentado, um iogurte, um queijo fresco, um leite coalhado, artigo de confeitaria, por exemplo, uma bebida doce ou adoçada, uma barra de confeitaria, flocos ou barras de cereais de pequeno-almoço, bebidas, leites em pó, produtos à base de soja, produtos não lácteos fermentados ou suplementos nutricionais para nutrição clínica. A quantidade de planta ou extracto de planta na composição pode variar de acordo com a fonte da planta e a sua utilização.
Numa forma de realização preferida, uma quantidade de dose diária eficaz é de, pelo menos, cerca de 1 mg e, de um modo mais preferido, de 1 mg a 200 mg da molécula activa por dia.
Numa forma de realização, pode ser preparada uma composição farmacêutica contendo, pelo menos, um extracto ou composto fitoquimico como descrito acima, numa quantidade suficiente para se obter o efeito desejado num indivíduo. Esta composição pode ser um comprimido, um líquido, cápsulas, cápsulas moles, pastas ou pastilhas, gomas, ou soluções ou emulsões bebíveis, um suplemento oral seco, um suplemento oral húmido. A composição farmacêutica vai ainda conter veículos e excipientes que são adequados para administração da respectiva molécula activa de natureza diferente ao tecido alvo. O tipo de veículo/excipiente e a sua quantidade vão depender da natureza da substância e do modo de administração contemplado. Entender-se-á que um especialista na matéria, com base no seu conhecimento, vai seleccionar os componentes e a forma galénica apropriados. A planta ou extracto de planta de acordo com a invenção pode ser utilizada na preparação de uma composição de alimento para animais de estimação. A referida composição pode ser administrada ao animal de estimação como um suplemento da sua dieta normal ou como um componente de um alimento para animais de estimação nutricionalmente completo e, de um modo mais preferido, num alimento para animais de estimação hipocalórico. Também pode ser uma composição farmacêutica. A planta ou extracto de planta pode ser utilizada só ou em associação com outras plantas, tais como chicória, chá, cacau, ou com outras moléculas bioactivas, tais como anti-oxidantes, ácidos gordos, fibras prebióticas, glucosamina, sulfato de 9 condroitina por exemplo.
De um modo preferido, a composição de alimento para animais de estimação contém cerca de 0,01 a 0,5 g de plantas secas por grama de alimento seco para animais de estimação para um cão com 15 kg; e 0,001 a 0,1 g de plantas secas por grama de alimento húmido para animais de estimação para um cão com 15 kg. A composição de alimento para animais de estimação nutricionalmente completa, de acordo com a invenção, pode estar em forma seca, pulverizada, de guloseima ou de um alimento para animais de estimação húmido, refrigerado ou de longa duração. Pode ser proporcionada como um produto refrigerado ou de longa duração. Estes alimentos para animais de estimação podem ser produzidos de formas conhecidas na técnica. O alimento para animais de estimação, opcionalmente, também pode conter um prebiótico, um microrganismo probiótico ou outro agente activo, por exemplo, um ácido gordo de cadeia longa. A quantidade de prebiótico no alimento para animais de estimação é, de um modo preferido, inferior a 10% em peso. Por exemplo, o prebiótico pode constituir cerca de 0,1% até cerca de 5% em peso do alimento para animais de estimação. Para alimentos para animais de estimação que utilizam chicória como a fonte do prebiótico, a chicória pode ser incluída para constituir cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso da mistura da ração; de um modo mais preferido, cerca de 1% a cerca de 5% em peso.
Se for utilizado um microrganismo probiótico, o alimento para animais de estimação, de um modo preferido, contém cerca de 4 10 . , . 10 a cerca de 10 células do organismo probiotico por grama do 10 alimento para animais de estimaçao; de um modo mais preferido, 6 8 , , , cerca de 10 a cerca de 10 células do microrganismo probiotico por grama. O alimento para animais de estimação pode conter cerca de 0,5% a cerca de 20% em peso da mistura do microrganismo probiotico, de um modo preferido, cerca de 1% a cerca de 6% em peso, por exemplo, cerca de 3% a cerca de 6% em peso.
Se necessário, o alimento para animais de estimação é suplementado com minerais e vitaminas de modo a que seja nutricionalmente completo. Além disso, vários outros ingredientes, por exemplo, açúcar, sal, especiarias, condimentos, agentes aromatizantes e semelhantes também podem ser incorporados no alimento para animais de estimação consoante desejado.
Noutra forma de realização, podem ser preparados adjuvantes dietéticos para melhorar a qualidade do alimento para animais de estimação. Como adjuvantes dietéticos, podem ser encapsulados ou proporcionados em forma de pó e embalados em conjunto com ou separadamente de uma refeição principal, seja ela húmida ou seca. A título de exemplo, um pó contendo extractos de acordo com a invenção pode ser embalado em saquetas numa forma de pó ou num gel ou lipido ou outro transportador adequado. Estas unidades embaladas separadamente podem ser proporcionadas conjuntamente com uma refeição principal ou em embalagens multi-unidades para utilização com uma refeição principal ou guloseima, de acordo com as instruções para o utilizador. A quantidade de alimento para animais de estimação a ser consumida pelo animal de estimação para se obter um efeito vantajoso vai depender do tamanho do animal de estimação, do 11 tipo de animal de estimação e da idade do animal de estimação. Contudo, uma quantidade do alimento para animais de estimação para proporcionar uma quantidade diária de cerca de 0,5 a 5 g de plantas secas por kg de peso corporal, seria, normalmente, adequada para cães e gatos. A administração a um humano ou animal do alimento ou da composição de alimento para animais de estimação, como descrito acima, resulta numa regeneração óssea melhorada durante a cicatrização de fracturas. Ajuda a estimular a formação óssea e a densidade mineral óssea durante o crescimento e a optimizar o valor máximo da massa óssea. Em particular, pode proporcionar um crescimento ósseo óptimo durante a infância.
Reduz o risco de osteoporose e melhora a recuperação após fractura. Além disso, ajuda a construir cartilagem em mamíferos, a impedir osteoartrite em animais de estimação e humanos, o que resulta numa melhor actividade ou mobilidade do indivíduo.
Os exemplos seguintes são apresentados apenas a título de ilustração e não devem, de modo algum, ser considerados como limitativos da matéria do presente pedido. Todas as percentagens são apresentadas em peso salvo indicação em contrário. Os exemplos são antecedidos por uma breve descrição da figura.
Figura 1: Determinação da expressão de ARNm de BMP-2 endógena em células hPOB-tert por RT-PCR seguida por tratamento com extractos de Lindera benzoin (E.P. 740, 50 pg/mL) ou Cyperus Rotundus (E.P. 205, 10 pg/mL) durante 48 h e mostrando que BMP-2 foi estimulada 3,8 e 2,8 vezes em comparação com o controlo, respectivamente. A validação deste ensaio foi realizada com lovastatina (0,5 pg/mL) como um controlo positivo mostrando a 12 indução de BMP-2 de 2,5 vezes.
Figura 2: Comparação dos valores da inibição determinados para o ensaio das calotas cranianas (A) e o ensaio de formação de lacunas (B) para os extractos de Ocimum gratissimum (738), Amelanchier alnifolia (734), Glycine max (768), Cyperus rotundus (205), Carthamus tinctorius (746).
Exemplos
Os exemplos seguintes ilustram a invenção reivindicada, em que a planta ou extracto de planta é Rosmarinus. Outras plantas e extractos de plantas estão exemplificados para comparação.
Exemplo 1: Ensaios sobre formação óssea e ressorção óssea 1. formação óssea
Foram rastreados 91 extractos quanto à formação óssea através do ensaio do gene repórter de BMP-2 (proteína morfogénica óssea) e quanto à ressorção óssea através do ensaio das calotas cranianas. Estes 91 extractos correspondem a 30 plantas diferentes. 13
Materiais e métodos • Preparação de extractos para ensaios de rastreio: 0 material vegetal triturado é desengordurado com hexano e, depois, extraído com uma mistura de álcool e água, com diferentes percentagens de água desde 10 a 90%, de um modo preferido, com 50%. Os álcoois podem ser álcoois metílico ou etílico, dando o extracto la.
Numa alíquota do resíduo deste primeiro extracto faz-se uma hidrólise enzimática com α e β glucosidases. As enzimas podem ser substituídas por condições ácidas. A operação pode ser feita em condições suaves (temperatura ambiente) ou através de refluxo com diferentes concentrações de ácido. A fase hidrolisada aquosa é extraída com um solvente não miscível, de um modo preferido, acetato de etilo, para dar o extracto 2a. O extracto pode ser seco, liofilizado ou fornecido como uma forma líquida. Em alguns casos, os polifenóis podem ser eliminados através de um tratamento com polivinil-polipirrolidona (PVPP), evitando artefactos com os ensaios de rastreio.
Após a preparação do extracto, cada extracto foi pesado, redissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) até uma concentração final de 20 mg/mL e armazenado em alíquotas a -20 °C. Este foi utilizado como uma solução mãe e foi, subsequentemente, diluído em meios para cada ensaio. Foi testada uma gama de doses nos sistemas de ensaio. 14 • Ensaio de formação óssea
Ensaio de BMP-2 com luciferase - A actividade dos extractos foi determinada utilizando células 2T3 contendo o promotor BMP-2 ligado operativamente ao gene de luciferase. Um aumento da actividade de luciferase em lisados de células reflecte um aumento da actividade promotora de BMP-2. Os extractos foram testados a uma diluição inicial de 100 pg/mL com diluições 1/2 até 0,2 pg/mL. A actividade promotora de BMP-2 foi determinada medindo a actividade de luciferase em extractos celulares. 13 plantas deram um resultado positivo significativo na estimulação da expressão de BMP-2 (Tabela 1): (Tabela 1)
Nome latino Nome vulgar parte Cone. pg/mL Extracto activo/n2 Acorus calamus cana-de-cheiro rizoma 5 MeOH/água/731 Amelanchier ovalis nespereira-das- rochas fruto 10 MeOH/água/219 Artemísia erva-de-fogo; partes 10 Acetato de vulgaris erva-de-São-João aéreas etilo/225 Cyperus rotundus juncinha rizoma 10 Acetato de etilo/205 Taraxacum officinalis dente-de-leão folhas 50 Acetato de etilo/750 Lindera benzoin benjoim partes aéreas 50 Acetato de etilo/740 15 (continuação)
Nome latino Nome vulgar parte Cone. pg/xnL Extracto activo/na Prunus pérsica pêssego sementes 25 Acetato de etilo/772 Glycine max soja cultura de células 50 Acetato de etilo/768 íris pallida lírio túberas 100 MeOH/água/239 Rosmarinus officinalis alecrim folhas 50 MeOH/água/2004 Acetato de etilo/2005 Carvi cominho-dos- prados sementes 25 Acetato de etilo/2074 Thyme tomilho folhas 25 Acetato de etilo/2067 Mentha spicata hortelã folhas 100 Acetato de etilo/2072 Vitis vinifera uva frutos 100 Acetato de etilo/2069
Tabela 1
Exemplos de novas preparações das mesmas plantas e das suas subfracções que estimulam BMP-2 são:
Lindera benzoin, extracto_activo/n0 acetato de etilo/740/2059; Subfracção activa/n0 2060
Taraxacum officinalis, extracto activo/n0 acetato de etilo/750/2034; Subfracção activa/n0 2035 16
Cyperus rotundus, extracto activo/n° acetato de etilo/205/2011; Subfracção activa/n° 2012, 2013 íris pallida, extracto activo/n0 MeOH/água/239; Subfracção activa/n° 760/762/2021, 2022
As subfracções foram preparadas por fraccionamento num cartucho de gel de sílica em fase inversa com eluição por solventes de polaridade variável. As isoflavonas de soja puras genisteína e didzeína (10 6 M) estimularam a BMP-2 mas o estradiol não. A indução de BMP-2 parece não estar restringida a uma actividade semelhante à estrogénica, uma vez que é estimulada por fitoestrogénio, mas não pelo próprio estrogénio. Significa que a actividade de fitoestrogénio (tal como genisteína e daidzeína) pode ser mediada por um mecanismo não estrogénico. A actividade promotora de BMP-2 não é estimulada pelo estradiol, pelo que a estrogenicidade dos compostos da planta não é necessária para que seja activa neste ensaio.
Planta Extracto activo/n0 concentração (pg/mL) Glycine max Acetato de etilo/2001 10, 50 Rosmarinus officinalis MeOH/água/2004 10, 50 Rosmarinus officinalis Acetato de etilo/2005 10 Cyperus rotundus subfracção/2012 10, 50 íris pallida subfracção/2022 10 Thyme Acetato de etilo/2067 10 Carvi Acetato de etilo/2074 10 17
Exemplo de formação óssea em cultura de orgaos de calotas cranianas 0 método utilizado está descrito em Science 286: 1946-1949 (1999). Os extractos foram avaliados num ensaio in vitro de calotas cranianas murinas neonatais de 4 dias. Os ossos foram incubados com os extractos durante a totalidade dos 4 dias. A formação óssea foi avaliada por histologia. 2. Ressorção óssea, ensaio das calotas cranianas A aptidão dos extractos para inibir a ressorção óssea estimulada por IL-1 (10 10 M) foi avaliada num ensaio de ressorção óssea neonatal. Cada extracto foi avaliado quanto à sua capacidade para inibir a ressorção óssea a 10 pg/mL. A aptidão dos extractos preparados como no exemplo 1 para inibir a ressorção óssea estimulada por IL-1 (10 10 M) foi avaliada no ensaio de ressorção óssea neonatal. Cada extracto foi avaliado quanto à sua capacidade para inibir a ressorção óssea a 10 pg/mL.
Os extractos das plantas que deram resultado positivo estão listados na Tabela 2:
Nome Nome vulgar parte Extracto latino activo/ns Amelanchier alnifolia nespereira-das- fruto Acetato de rochas etilo/734 Ocimum gratissimnum alfavaca-cravo folhas Me0H/H20/737 18
Nome latino Nome vulgar parte Extracto activo/na Ocimum gratissimmum alfavaca-cravo folhas Acetato de etilo/738 Carthamus tinctorius cártamo sementes Acetato de etilo/746 Cyperus rotundus juncinha rizoma Acetato de etilo/205 Glycine max soja culturas de células 768
Tabela 2 .
Estas plantas foram activas no ensaio de ressorção óssea: Amelanchier alnifolia, Ocimum gratissimum e Carthamus tinctorius e Glycine max. 0 Cyperus rotundus inibiu a ressorção óssea e induziu BMP-2.
Exemplo 2: Efeito de extractos de plantas na expressão de BMP-2 endógena em células osteoblásticas humanas
As plantas que se verificou serem positivas para a indução de BMP-2 no exemplo 1 foram adicionalmente testadas numa linha celular periosteal/preosteoblástica humana, hPOB-tert, quanto à sua capacidade para induzir a expressão endógena de BMP-2. Este ensaio em células osteoblásticas confirmou os resultados apresentados no exemplo 1.
Por exemplo, o tratamento de células hPOB-tert com extractos de Lindera benzoin (extracto 740, 50 yg/mL) e de Cyperus rotundus (extracto 205, 10 yg/mL), durante 48 h, estimulou a expressão de BMP-2 3,8 e 2,8 vezes em relação ao 19 controlo (ver Figura 1). A validação deste ensaio foi realizada com lovastatina (0,5 pg/mL) como um controlo positivo mostrando indução de BMP-2 de 2,5 vezes.
Na confluência, as células foram incubadas com 0,05 pg/mL de lovastatina ou com os extractos de plantas. O ARN total foi extraído com Reagente TRIzol (Gibco). 10 pg de ARN foram transcritos de forma inversa utilizando o Kit de Síntese da Ia Cadeia de ADNc (Boehringer) . As sequências de ADNc de BMP-2 foram amplificadas durante 35 ciclos a uma temperatura de emparelhamento de 55 °C utilizando iniciadores oligonucleotídicos específicos (5':TTGCGGCTGCTCAGCATGTT; 3':CATCTTGCATCTGTTCTCGGAA). Os produtos de PCR foram separados por electroforese em gel de agarose e detectados coloração com brometo de etídio. A quantificação foi realizada utilizando o Software NIH Image e normalizando os resultados com Actina como o gene doméstico.
Os resultados estão apresentados na Figura 1.
Ressorção óssea
Os extractos de plantas que se verificou serem positivos no ensaio das calotas cranianas foram ensaiados de novo num segundo ensaio de ressorção óssea, nomeadamente no ensaio de formação de lacunas, utilizando uma mistura de células de osso de coelho cultivadas em secções de osso de bovino (Tezuka K. et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 186(2):911-7 e Lorget F. et al., 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 268(3):899-903). As lacunas de ressorção foram visualizadas por coloração para TRAP (fosfatase ácida resistente a tartarato). Procedeu-se à contagem 20 das células positivas.
Uma comparação da actividade dos extractos a 10 pg/mL nos dois sistemas de ensaio está apresentada na Figura 2.
Exemplo 3: Alimento seco para animais de estimação (nao de acordo com a invenção)
Prepara-se uma mistura de alimento constituída por até cerca de 58% em peso de milho, cerca de 5,5% em peso de glúten de milho, cerca de 22% em peso de farinha de carne de frango, 2,5% de chicória seca, cerca de 10% de túberas de Cyperus rotundus, sendo o resto constituído por sais, vitaminas e minerais. A mistura de alimentos é alimentada num precondicionador e humedecida. A mistura de alimentos humedecida é, então, alimentada numa extrusora-cozedora e gelatinizada. A matriz gelatinizada que sai da extrusora é forçada através de uma matriz e extrudida. O extrudido é cortado em pedaços adequados para alimentar cães, seco a cerca de 110 °C durante cerca de 20 minutos e arrefecido para formar pastilhas.
Este alimento seco para cães tem um efeito positivo na saúde óssea e da cartilagem e aumenta a sua mobilidade. 21
Exemplo 4: Comida enlatada para animais de estimação com suplemento (não de acordo com a invenção)
Prepara-se uma mistura a partir de 73% de carcaças de aves de capoeira, pulmões de porcos e figados de vaca (moídos), 16% de farinha de trigo, 2% de corantes, vitaminas e sais inorgânicos. Esta mistura é emulsionada a 12 °C e extrudida na forma de um pudim, que é depois cozinhado a uma temperatura de 90 °C. É arrefecido a 30 °C e cortado em pedaços. 45% destes pedaços são misturados com 55% de um molho preparado a partir de 98% de água, 1% de corante e 1 % de goma de guar. Latas de folha de estanho são cheias e esterilizada a 125 °C durante 40 min.
Como um suplemento a ser misturado com o alimento para animais de estimação antes de ser servido, uma embalagem adicional (e. g., saqueta) contém 25 g de partes aéreas de Cyperus Rotundus pulverizadas a ser adicionadas ao alimento diário. A quantidade correspondente para o animal de estimação é cerca de 25 g/dia e esta pode ser fornecida como um suplemento com a lata (e. g., na parte de cima).
Lisboa, 16 Setembro de 2010 22
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES 1. Composição contendo uma planta ou extracto de planta contendo compostos fitoquímicos que têm a capacidade de estimular uma proteína morfogénica óssea, em que a planta ou extracto de planta é de Rosmarinus, para a prevenção, alívio e/ou tratamento de distúrbios ósseos e manutenção da saúde óssea em humanos ou em animais de estimação.
- 2. Utilização de uma planta ou extracto de planta contendo compostos fitoquímicos que têm a capacidade de estimular uma proteína morfogénica óssea, em que a planta ou extracto de planta é de Rosmarinus, para o fabrico de uma composição para utilização na prevenção, alívio e/ou tratamento de distúrbios ósseos e manutenção da saúde óssea em humanos ou animais de estimação.
- 3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a planta provém de qualquer parte da fonte da planta, folhas, túberas, frutos, sementes, raízes, grãos, embriões ou culturas de células.
- 4. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a planta ou extracto de planta são partes aéreas de Rosmarinus officinalis.
- 5. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que os compostos fitoquímicos são lactucina, lactupicrina, 3-desoxi-lactucina, geraniol ou carvona. 1
- 6. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a planta ou extracto de planta é utilizado isolado ou em associação com outras plantas, tais como chicória, chá, cacau, ou com outras moléculas bioactivas, tais como anti-oxidantes, ácidos gordos, fibras prebióticas, glucosamina e sulfato de condroitina.
- 7. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a composição é uma composição alimentar ou uma composição de alimento para animais de estimação.
- 8. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, em que a composição está na forma de um alimento ou alimento para animais de estimação nutricionalmente equilibrado, de um suplemento dietético ou de uma guloseima.
- 9. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a composição é uma composição farmacêutica.
- 10. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que a composição ajuda a regeneração óssea durante a cicatrização de fracturas, ajuda a aumentar a formação óssea e a densidade mineral óssea durante o crescimento e optimiza o valor máximo da massa óssea.
- 11. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que a composição ajuda a constituir cartilagem em humanos ou animais de estimação. 2
- 12. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que a composição ajuda a prevenir a osteoartrite em humanos ou animais de estimação, o que resulta numa melhor actividade ou mobilidade do indivíduo.
- 13. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que a composição é para o tratamento, alívio e/ou profilaxia de osteoartrite em animais de estimação e humanos.
- 14. Composição ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que a composição é para tratamento ou prevenção de osteoporose. Lisboa, 16 de Setembro de 2010 3
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