KR101099021B1 - 유럽종 포도의 씨 추출물을 함유하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골관절염(osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
유럽종 포도의 씨 추출물, 골관절염

Description

유럽종 포도의 씨 추출물을 함유하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating osteoarthritis comprising Vitis vinifera pip extract}
본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 골관절염(osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
골관절염(osteoarthritis)은 퇴행성 관절염으로 칭해지기도 하는 관절염의 일종으로서, 윤활 관절에서 연골과 주위골에 퇴행성 변화가 나타나서 생기는 관절 염을 말한다. 즉, 골관절염은 관절 연골의 점차적인 소실과 더불어 연골 하방에 위치한 뼈의 비대, 관절 가장자리 부위의 골 생성, 및 비특이적인 활막 염증을 특징으로 하는 질환이다. 골관절염은 노화나 과도한 물리적 압박(예를 들어, 비만, 외상 등)에 의해서 연골이 손상되어 발생하는 질환이다. 따라서, 골관절염은 체중을 많이 받는 관절, 즉, 무릎(슬)관절, 엉덩이 (고)관절 등에 심한 통증과 운동 장애를 나타내며, 장기간 방치할 경우에는 관절의 변형까지 초래하게 된다.
골관절염은 연골내 수분 함량이 증가되어 부종을 일으키는 연골 변화 단계(1 단계), 연골이 파괴되면서 연골 표면이 갈라지고 찢어지면서 손상되어 뼈가 드러나 고 관절강이 좁아지는 원섬유화(fibrillation) 단계(2 단계), 연골세포가 연골을 회복하기 위해 연골 생성을 시작하지만 연골 생성보다 연골 파괴가 더 빠르게 일어나기 때문에 전반적으로이 줄어들게 되는 단계(3 단계), 뼈가 변형되어 관절 기형 및 기능장애를 초래하는 뼈 변화 단계(4 단계), 및 연조직(soft tissue)이 두꺼워지는 관절 연조직 변화 단계(5 단계)로 진행되게 된다.
골관절염과 다른 분류에 속하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)은 활막 세포의 염증과 증식을 특징으로 하는, 만성 자가면역 질환(autoimmune diseases)으로서, 골관절염과 달리 관절 주위 뼈의 골다공증 및 골미란 등이 발생한다. 류마티스 관절염은 활막(synovial membrane)의 염증이 관절막(joint capsule)과 인대(ligament), 건(tendon)으로 퍼지는 단계(1 단계), 관절연골(joint cartilage)의 점차적인 파괴로 관절 간격이 좁아지고 관절막과 인대의 장력이 소실되는 단계(2 단계), 염증이 뼈로 침범하여 뼈의 부분적 침식이 발생하는 단계(3 단계), 및 관절기능이 소실되는 단계(4 단계)로 진행되게 된다. 따라서, 골관절염과 류미티스 관절염은 그 발명 원인 및 진행단계가 전혀 상이하며, 이에 대한 치료 방법도 상이하다.
한편, 포도속(Vitis) 식물은 갈매나무목(Rhamnales), 포도과(Vitaceae)에 속하는 덩굴성 식물로 적도부근 및 위도 50°이상 지역을 제외한 지구상 전역에서 자생 혹은 재배되고 있다. 포도과에는 11속 700 여종이 알려져 있으며, 유럽종 포도(Vitis vinifera), 미국종 포도(Vitis labrusca), 강변 포도(Vitis riparia), 사막 포도(Vitis rupestris), 겨울 포도(Vitis berladieri), 머루(Vitis coignetiae), 왕머루(Vitis amurensis) 등이 주로 과실을 이용하기 위하여 재배되고 있다. 이 중, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨로부터 얻어지는 추출물은 (-)에피카테킨, 프로안토시아니딘 B1 및 B2, (+)카테킨, 및 이들의 중합 유도체들의 혼합물들을 포함하며, 이들은 프로시아니돌 또는 플라보놀 올리고머로서 알려져 있다 (GB-A-1541469 및 FR-A-2092743).
상기 추출물은 주로 결합조직, 혈관, 림프, 관절 등의 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan)에 선택적으로 작용하여 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 등의 결합능에 관련하는 섬유들의 합성을 촉진하고 분해를 억제하여, 증가된 모세혈관 투과성을 억제하고 정맥의 신축성을 빠르게 회복시켜 주는 것으로 보고되고 있다.[Arteres et veines Vol.5(5), 397∼401(1986); Sem-dex Hopitaux 48/47, 2009∼2013(1981)] 또한, 포도씨 추출물은 당뇨병 환자의 모세혈관 취약증, 고혈압에 관련된 망막증, 망막분리후의 잔여 망막부종에 대한 치료효과를 갖는 것이 보고된 바 있으며[Gazette Mde France Vol.88, No.14, 2035∼2038(1981)], 망막의 여러 구조를 보호함으로써 시각색소의 재생속도를 빠르게 하며, 임상시험에서 섬광에 노출된 후에 망막을 회복시키는데도 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다[Bull. Soc. Opth. France Vol 88(2), 173-4, 177-9(1988)].
본 발명자들은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 추출물의 개선된 제조방법을 개발한 바 있으며, 또한, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 우수한 류마티스 관절염에 대한 우수한 예방 및 치료효과를 갖는다는 것을 보고한 바 있다(대한민국 특허공개 제10-2009-0024647호).
본 발명자들은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 추출물에 대하여 다양한 약리활성을 검색하던 중, 놀랍게도 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 골관절염에 대한 우수한 치료 및 증상완화 효과를 갖는다는 것을 발견하였다. 이는 유럽종 포도(Vitis vinifera)로부터 얻어진 추출물이 골관절염에 관련된다는 보고가 없다는 것을 감안할 때, 매우 놀라운 것이다.
따라서, 본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 유효성분으로 함유하는 골관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골관절염(osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. 특히, 상기 골관절염은 노화, 비만, 또는 외상에 의하여 발생한 골관절염일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 80 ∼ 130 의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는 것이 바람직하다.
또한, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 (a) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2인 아세톤과 물의 혼합용매로 실온에서 추출하고, 여과하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법으로 얻어질 수 있다.
또한, 선택적으로, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 (A) (i) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과하는 단계; (ii) 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과하는 단계; (iii) 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; (iv) 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조하여 제1 추출물을 얻는 단계; (B) (p) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과하는 단계; (q) 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과하는 단계; (r) 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조하여 제2 추출물을 얻는 단계; 및 (C) 상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는 제조방법으로 얻어질 수 있다.
본 발명에 의해 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 우수한 골관절염(osteoarthritis)의 예방 및 치료활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 특히, 특정한 프로시아니돌릭 값, (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량, 및 95 ∼ 105 %의 프로안 토시아디딘 함량을 갖는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 우수한 골관절염 예방 및 치료활성을 갖는다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 상기 추출물은 본 발명자들이 개발한 제조방법에 의해 바람직하게 얻을 수 있다.
본 발명은 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골관절염(osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 특히, 상기 골관절염은 노화, 비만, 또는 외상에 의하여 발생한 골관절염일 수 있다.
유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 연골의 파괴를 효과적으로 억제함으로써 우수한 골관절염의 예방 및 치료효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 골관절염 유도물질로 알려져 있는 모노소듐 요오드아세테이트(Monosodium Iodoacetate, MIA)를 랫트에 투여하여 골관절염을 유발시킨 동물모델에서, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여하였을 때, 비투여군에 비하여 강한 자극에 대해서는 오랫동안 견디었으며(도 1a 및 도 1b 참조), weight bearing 도 콘트롤군과 비슷한 수준을 유지하였고(도 2 참조), 연골의 파괴도 거의 관찰되지 않았을 뿐만 아니라 뼈의 과형성도 관찰되지 않았다(도 3 내지 도 5 참조). 이러한 시험결과는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 연골의 파괴를 억제함으로써 골관절염에 대한 우수한 예방 및 치료 활성을 가지는 것을 시사한다.
상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 80 ∼ 130의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함 량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는 것이 특히 바람직하다.
본 명세서에서 상기 "프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, 이하 'PCV'라 칭함)"은 다음 방법 및 식에 의해서 계산된 값을 의미한다.
① 표준액의 조제
유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 표준품 100 mg을 정밀히 달아 이소프로판올을 가해 50 ml로 한다. 이 액 10 ml를 취하여 3M 염산 10 ml를 가하고 이소프로판올을 가해 50 ml로 한 액을 표준액으로 한다.
② 검액 조제
샘플 100mg을 정밀히 달아, 표준액과 동일하게 조작하여 검액으로 한다.
③ 조작
검액 및 표준액 10 mlTlr각각 5개의 시험관에 넣고 마개를 한 다음, 100℃ 수욕중에서 45분간 가열한다. 가열 후 시험관을 냉수에 넣어 냉각시키고, 각 시험관의 액 2 ml를 취한 후 이소프로판올 20 ml를 가한다. 반응시킨 검액, 표준액을 가지고 이소프로판올을 대조액으로 하여 550 nm에서 흡광도를 측정하고 각 5개의 평균 흡광도를 구한다.
④ 계산식
PCV = 105 X [A(t) X Mt X (100-Et)] / [A(s) X M X (100-E)]
A(t): 반응시킨 검액의 평균 흡광도
A(s): 반응시킨 표준액의 평균 흡광동
Mt: 표준품 취한 량(mg)
M: 검체 취한 량(mg)
Et: 표준품의 수분 함량(%)
E: 검체의 수분함량(%)
상기 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량은 다음과 같이 정량된 값을 의미한다.
① 표준액의 조제
(+)카테킨 표준품, (-)에피카테킨 표준품 각각 50 mg을 정밀하게 달아 아세토니트릴·묽은 인산 혼합액(5:95)에 녹여 100ml로 한 액을 표준액으로 한다.
② 검액 조제
샘플 50mg을 정밀하게 달아, 아세토니트릴·묽은 인산 혼합액(5:95)에 녹여 10ml로 한 액을 검액으로 한다.
③ 분석조건
- 컬럼: 옥타데실실릴화한 실리카겔을 충진한 컬럼 (0.46 X 25 cm, 5 um)
- 이동상
시간(분) 이동상A 이동상 B
0 95 5
50 85 15
60 20 80
70 95 5
이동상 A: 묽은 인산 (묽은 인산: 0.3%, V/V 수용액)
이동상 B: 아세토니트릴
- 유속: 0.7 ml/분
- 검출기: 자외부흡광도측정 (측정파장: 278 nm)
- 주입량: 10 ul
④ 계산식
에피카테킨으로서 카테킨의 함량(%)
= [A1 X Me X 100 X 100] / [Ae X M1 X (100-E) X 10]
에피카테킨의 함량(%)
= [A2 X Me X 100 X 100] / [Ae X M1 X (100-E) X 10]
A1: 검액 중 카테킨의 피크면적
A2: 검액 중 에피카테킨의 피크면적
Ae: 표준액 중 에피카테킨의 피크면적
Me: 표준액 중 에피카테킨의 양(mg)
M1: 검액 중 추출물의 양(mg)
E: 추출물중 수분(%)
또한, 상기 "프로안토시아디딘 함량"이라 함은 다음 방법 및 식에 의해서 계산된 값을 의미한다.
① 내부표준액의 조제
2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol, BHT) 30.0 mg을 정밀하게 달아 100 ml 용량플라스크에 넣고 이동상으로 표선을 맞추어 내부표준액으로 한다.
② 검액 1의 조제
샘플 10 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액 용액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 검액으로 한다.
③ 검액 2의 조제
샘플 10 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액 용액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 검액으로 한다.
④ 표준액의 검량선 조제
- 표준액 1: 프로안토시아니딘 표준품 8 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 표준액 1로 한다.
- 표준액 2: 프로안토시니딘 표준품 10 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 표준액 2로 한다.
- 표준액 3: 프로안토시아니딘 표준품 12 mg을 정밀하게 달아 10 ml 용량플라스크에 넣고 5 ml 내부표준액에 녹인 후, 내부표준액으로 표선을 맞추어 표준액 3으로 한다.
⑤ 조작조건
- 컬럼: PL Gel Column (7.6 X 300 mm, 5 um) 또는 그와 유사한 컬럼
- 검출기: 자외부흡광광도계 (측정파장: 280 nm)
- 이동상: 테트라히드로퓨란과 리튬 브로마이드 수용액의 혼합용매(95:5)
* 리튬 브로마이드 수용액: 리튬 브로마이드 1.04g을 정밀하게 취하여 1000 ml 용량플라스크에 넣고 물로 표선을 맞춘다.
- 유속: 1.0 ml/min
- 주입량: 10 uL
- 측정시간: 15분
⑥ 조작방법
표준액 1, 2, 3 및 검액 1, 2를 아래의 액체크로마토그래피법으로 각각 2회씩 분석한다. 단 표준액의 농도와 그에 상응하는 주피크 대 IS피크 면적비(Aproanthocyanidin/ABHT)로 표준액의 검량선을 작성하고 아래의 식에 따라 계산한다.
⑦ 계산식
- Ti% = {[(Aproanthocyanidin/ABHT)test - a] / b} x (1 / Ctest) x 100
Aproanthocyanidin = 검액에서 프로안토시아니딘의 피크면적
ABHT = 검액에서 BHT의 피크면적
a = 표준액 검량선의 Y 절편값
b = 표준액 검량선의 기울기값
Ctest = 검액의 농도(mg/ml)
- 프로안토시아니딘 함량(%) = Ti% x [(100-KFstd)/(100-KFtest)]
KFstd = 표준품 수분보정
KFtest = 검체 수분보정
또한, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 다음과 같이 개선된 제조방법(즉, 대한민국 특허공개 제10-2009-0024647호)에 의해 제조된 것을 바람직하게 사용할 수 있다.
즉, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 (a) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2인 아세톤과 물의 혼합용매로 실온에서 추출하고, 여과하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 얻어질 수 있다.
분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨는 유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 얻어진 껍질, 씨, 가지를 물에 세척하고 오븐 등을 사용하여 건조시킨 후, 씨를 분리하고, 이를 통상의 방법으로 분쇄함으로써 얻을 수 있다.
상기 제조방법은 종래의 추출방법(예를 들어, GB-A-1541469)에 비하여 아세톤 함량이 낮은 물-아세톤 혼합용매를 1차 추출용매로 사용하고, 별도의 가온 없이 실온(약 25 ℃)에서 1차 추출공정을 수행한다. 상기 제조방법에서 사용하는 물-아세톤 혼합용매로는 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2, 바람직하게는 약 1 : 1.5인 혼합용매를 사용할 수 있다. 상기 1차 추출은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 단계(a)의 상기 여과는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 다음 단계의 수행을 위하여 여액을 회수한다.
단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계[단계(b)]에 있어서, 상기 증류에 의하여 상대적으로 비등점이 낮은 아세톤이 제거되게 되며, 아세톤에 용해되어 있는 불순물들이 침전되게 된다. 상기 증류는 통상의 증류 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 감압 조건에서 증류하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 약 50 ℃ 이하의 감압 조건에서 수행되는 것이 바람직하다. 증류 과정을 거쳐 얻어진 추출액은 별도의 유기용매 추출과정 없이, 곧바로 염화나트륨 포화 및 여과 과정이 수행된다. 상기 추출액(즉, 아세톤이 증류된 추출액)을 염화나트륨으로 포화시키면, 탄닌 성분 등의 불순물이 침전되게 되며, 이는 여과 과정을 통하여 제거되게 된다. 상기 염화나트륨 포화 및 여과에 의한 불순물 침전은 염화나트륨을 포화시킨 다음, 2 내지 3 시간 동안 방치한 후, 여과하는 것이 바람직하다. 상기 여과는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 다음 단계의 수행을 위하여 여액을 회수한다.
단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계[단계(c)]에 있어서, 상기 에틸 아세테이트를 이용한 추출(2차 추출)은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 농축은 단계(b)에서 얻어진 추출액(즉, 여액) 총 부피에 대하 여 0.4 내지 0.7 배로 농축되도록 수행되는 것이 바람직하다.
단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계[단계(d)]에 있어서, 상기 클로로포름을 가할 경우, 클로로포름에 용해되지 않는 올리고머를 포함한 유효성분들이 침전되게 되며, 생성된 침전물은 간단히 여과함으로써 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 간단히 분리해낼 수 있다. 여과하여 얻어진 침전물은 통상의 방법에 따라 건조함으로써, 건조 분말 형태로 얻을 수 있으며, 상기 건조는 감압 조건, 예를 들어 50 ℃ 이하의 감압 조건에서 건조함으로써 수행될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로 함유되는 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 (A) (i) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과하는 단계; (ii) 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과하는 단계; (iii) 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; (iv) 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조하여 제1 추출물을 얻는 단계; (B) (p) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과하는 단계; (q) 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과하는 단계; (r) 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조하여 제2 추출물을 얻는 단계; 및 (C) 상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조방법에 의해 얻어질 수 있다.
상기 제조방법은 제1 추출물 및 제2 추출물을 별도로 제조하고, 이들을 혼합 하여 추출물을 얻음으로써 수행된다. 따라서, 상기 제조방법은 전체적으로 아세톤의 사용량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 염화나트륨 포화공정 및 클로로포름 추출공정을 결여하므로, 추출이 간단하고 유기용매 사용으로 인한 환경오염의 문제도 최소화할 수 있다. 또한, 얻어지는 추출물의 수율을 약 10배 정도로 크게 높일 수 있다.
제1 추출물 제조에 있어서, 단계(i)는 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1, 더욱 바람직하게는 4 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과함으로써 수행된다. 상기 1차 추출은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 단계(i)의 상기 여과는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 다음 단계의 수행을 위하여 여액을 회수한다.
제1 추출물 제조에 있어서, 단계(ii)는 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과함으로써 수행된다. 상기 농축에 의하여 상대적으로 비등점이 낮은 아세톤이 제거되게 되며, 아세톤에 용해되어 있는 불순물들이 침전되게 된다. 상기 농축은 통상의 감압 농축(또는 감압 증류)에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 감압 조건에서 증류하여 수행될 수 있다. 농축 과정을 거친 후 여과에 의해 침전물을 제거하고 여액을 회수한다.
제1 추출물 제조에 있어서, 단계(iii)은 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출함으로써 수행된다. 상기 에틸 아세테이트를 이용한 추출(2차 추출)은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3 회 반복 수 행하는 것이 바람직하다. 또한, 단계(iii)은 상기 에틸 아세테이트를 이용한 추출공정 수행 후, 무수 황산나트륨 등을 이용한 탈수 공정을 추가로 포함할 수 있다.
제1 추출물 제조에 있어서, 단계(iv)는 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조함으로써 수행된다. 상기 건조는 통상의 방법, 예를 들어 50 ℃ 이하의 감압 조건에서의 건조에 의해 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 농축하여 에틸 아세테이트를 제거하고, 얻어진 농축물을 물에 용해시킨 후, 분무건조함으로써 수행될 수 있다.
제2 추출물 제조에 있어서, 단계(p)는 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과함으로써 수행할 수 있고; 단계(q)는 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과함으로써 수행할 수 있다. 단계(q)의 상기 추출은 단회 또는 반복적으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3 회 반복 수행하는 것이 바람직하다.
또한, 제2 추출물 제조에 있어서, 단계(r)은 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조함으로써 수행할 수 있다. 단계(r)의 상기 건조는 단계(q)에서 얻어진 여액을 분무건조함으로써 수행되거나; 단계(q)에서 얻어진 여액을 농축한 후, 얻어진 농축액을 분무건조함으로써 수행되는 것이 바람직하다. 상기 농축은 단계(q)에서 얻어진 여액 총 부피에 대하여 0.4 내지 0.7 배로 농축될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같이 얻어진 제1 추출물 및 제2 추출물의 혼합은 단순히 추출물들을 혼합함으로써 수행될 수 있으며, 상기 제1 추출물 및 상기 제2 추출물의 혼합비는 1 : 0.5∼1.5 의 중량비일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있으며, 바람직하게는 정제 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝 솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학조성물에 함유되는 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물은 1일 1 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 5 내지 50 mg/kg의 용량, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 10 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 골관절염 예방 또는 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 병용하여 투여할 경우 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 단독 투여 또는 병용 투여 시 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조
유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 껍질, 씨, 가지를 모아 물에 세척하고 회전 오븐에서 건조시킨 후, 씨를 분리하였다. 얻어진 씨 1 kg을 분쇄한 다음, 정제수 300 ml 및 아세톤 200 ml로 이루어진 아세톤 수용액 500 ml를 가하여, 실온에서 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액을 모두 합하여 여과하였다. 얻어진 여액을 50 ℃ 이하의 감압하에서 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시킨 후, 약 3 시간 동안 실온에서 방치한 다음 여과하였다. 얻어진 여액을 에틸 아세테이트 250 ml을 사용하여 3회 추출한 다음, 무수 황산나트륨으로 탈수하였다. 얻어진 추출액을 부피가 약 125 ml로 줄어들 때까지 감압 농축시켰다. 얻어진 농축액에 클로로포름 약 600 ml를 가하여 침전물을 생성시킨 후, 여과하였다. 여과하여 얻어진 침전물을 50 ℃ 이하의 진공 오븐에서 건조하여 약 3.5 g의 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 갈색 분말 상으로 얻었다. 얻어진 추출물을 희산성 용액에서 가열하여 가수분해한 다음, 프로시아니돌릭 올리고머의 함량을 정량하여 PCV (Procyanidolic value)를 측정한 결과, 약 105의 높은 값을 나타내었다. 또한, 상기한 바와 같이 프로안토시아디딘 함량을 측정한 결과 103 % 이었다. 따라서 상기 추출물은 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 모노머가 2개 이상 중합된 올리고머류를 다량으로 함유한다.
실시예 2. 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물의 제조
유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 껍질, 씨, 가지를 모아 물에 세척 하고 회전 오븐에서 건조시킨 후, 씨를 분리하였다. 얻어진 씨 1 kg을 분쇄한 다음, 아세톤 수용액 (아세톤/물 = 8/2, v/v) 500 ml를 가하여 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액을 모두 합하여 여과하였다. 얻어진 여액을 감압농축하여 아세톤을 제거한 후, 여과하였다. 얻어진 여액을 에틸 아세테이트 250 ml을 사용하여 3회 추출한 다음, 무수 황산나트륨으로 탈수하였다. 얻어진 추출액을 감압농축하여 에틸 아세테이트를 제거하고, 얻어진 농축물을 물 500 ml에 용해시킨 후, 분무건조하여 분말상의 추출물(제1 추출물) 약 20 g을 얻었다.
유럽종 포도(Vitis vinifera)를 압착하여 껍질, 씨, 가지를 모아 물에 세척하고 회전 오븐에서 건조시킨 후, 씨를 분리하였다. 얻어진 씨 1 kg을 분쇄한 다음, 정제수 500 ml를 가하여 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하고, 얻어진 추출액을 모두 합하여 여과하였다. 얻어진 여액을 에탄올 250 ml을 사용하여 3회 추출한 다음, 여과하였다. 얻어진 여액을 감압농축한 후, 얻어진 농축액을 분무건조하여 분말상의 추출물(제2 추출물) 약 15 g을 얻었다.
상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하여 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 약 35 g을 얻었다. 얻어진 추출물을 희산성 용액에서 가열하여 가수분해한 다음, 프로시아니돌릭 올리고머의 함량을 정량하여 PCV (Procyanidolic value)를 측정한 결과, 약 98 의 높은 값을 나타내었다. 또한, 상기한 바와 같이 프로안토시아디딘 함량을 측정한 결과 98.5 % 이었다. 따라서 상기 추출물은 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 모노머가 2개 이상 중합된 올리고머류를 다량으로 함유한다.
시험예.
1. 시험방법
(1) 골관절염 유도 및 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 투여
5주령의 웅성 위스터(Wistar)계 랫트의 오른쪽 무릎에 4mg/75ul의 용량으로 모노소듐 요오드아세테이트(Monosodium Iodoacetate, MIA)를 투여하여 골관절염을 유도하였다. MIA는 생리식염수에 용해시켜 투여하였다.
골관절염이 유도된 랫트를 각각 6마리씩 2군으로 나누고, 첫번째 군은 아무런 처리를 하지 않은 군(MIA군)으로 하고, 두번째 군(MIA-GSPE군)은 실시예 2에서 제조한 포도씨 추출물을 300 mg/kg의 용량으로 생리식염수에 용해시켜 하루에 한번 매일 4 주 동안 경구투여하였다. 아무런 처리를 하지 않은 군 즉, MIA 및 포도씨 추출물이 투여되지 않은 군을 정상 대조군(normal control)으로 하였다.
(2) 행동력 측정 및 조직학적 분석
행동력 측정은 Dynamic Plantar Aesthesiometer를 이용하여 랫트의 뒷발에 자극을 주고 그에 대한 반응을 관찰하였다. 즉, Dynamic Plantar Aesthesiometer 에 장착되어 있는 0.5mm의 직경의 침(필라멘트)을 20초 동안 50g의 힘으로 랫트의 발바닥에 직각방향으로 자극을 주어 랫트가 해당되는 무게의 힘을 느끼고 발을 치울때의 초와 무게값을 얻어 paw withdrawal latency 와 threshold를 측정하였다. 또한, 랫트의 왼발과 오른발에 실리는 힘을 비교, 측정하기 위하여 Incapacitance tester를 이용하였다. 랫트를 플라스틱 챔버에 넣고 Incapacitance tester의 분리된 판 위에 랫트의 왼발과 오른발을 각 판위에 올려 놓고 3초 동안 각 발에 실리는 힘의 평균값을 얻었다. 이렇게 얻은 Weight bearing (%)은 오른발 (MIA를 주입한 발) / 왼발 (MIA를 주입하지 않은발) X 100%의 식에 대입하여 결과를 얻었다.
MIA 유도 후 13일째 랫트의 관절을 채취하여 분리한 뒤, india ink로 염색하여 해부현미경으로 관찰하였다. 관절의 세부적인 형태를 관찰하기 위해 H&E 염색을 하였고, 연골의 파괴정도를 알 수 있는 염색법인 사프라닌 O (Safranin O) 와 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 통해 프로테오글리칸(proteoglycan)의 함량을 degradation 에 따라 연골의 형태를 관찰하였다.
2. 시험결과
(1) 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 골관절염 유발 동물의 행동력에 미치는 영향 평가
MIA를 주입한 뒤 4일 정도가 지났을 때 골관절염이 유도되었으며, Dynamic Planear Aesthesiometer를 이용하여 랫의 뒷발에 자극을 주고 그에 대한 반응을 살펴본 결과, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여한 군은 투여하지 않은 군에 비하여 paw withdrawal latency 및 threshold가 유의성 있게 높았다 (도 1). 이러한 결과는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여 한 군은 투여하지 않은 군에 비하여 강한 자극에 대해서도 오래 견디는 것을 나타낸다. 또한 각 군의 랫의 weight bearing을 측정한 결과, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여한 군에서의 weight bearing이 비투여 군에 비해 유의성 있게 높았다. 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 투여하지 않은 군에서는 왼쪽 발에 무게를 많이 두고 있었다 (도 2).
(2) 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향 평가
골관절염이 유도된지 13일째에 랫트의 관절을 채취하여 분리한 뒤, india ink로 염색하여 해부현미경으로 관찰한 결과, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여하지 않은 군에서는 연골부분에 파괴가 일어났다 (도 3의 가운데 사진의 화살표). 그러나 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여한 군에서는 연골의 파괴가 거의 일어나지 않았다 (도 3). 이러한 결과는 MIA 투여에 의해 골관절염을 유도하고 30일이 지나서도 계속 유지되었다.
또한, 톨루이딘 블루(toluidine blue), 사프라닌 O (safranin O), H&E 염색을 통한 조직학적 분석 결과, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여 하지 않은 군에서는 연골의 파괴가 더 심하게 일어나 그 부위가 확인되지 않을 뿐 아니라 뼈가 과형성되어 기형적인 모습을 띠고 있음에 반해, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 경구투여 한 군에서는 여전히 연골이 분해되지 않고 유지 되어 있었다 (도 4). 또한, Histology grade를 하기 표 1에 따라 점수화하여 측정한 결과는 도 5와 같으며, 도 5의 결과로부터 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 투여군에서는 연골의 파괴가 거의 없음을 알 수 있다.
증상 Histology grade
정상
(Normal)		 1
사프라닌 O 염색의 약간의 표면적 수축
(Slight superficial reduction of safranin O staining)		 2
사프라닌 O 염색의 수축 및 약간의 표면 불규칙성
(Reduction of safranin O staining and slight surface irregularity)		 3
심각한 표면 불규칙성 및/또는 틈
(Severe surface irregularity and/or clefts)		 4
완전환 비-경화된 연골 두께 감소
(Full non-calcified cartilage thickness loss)		 5
경화된 연골 감소
(calcified cartilage loss)		 6
따라서, 상기한 시험결과는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 연골의 파괴를 억제함으로써 골관절염에 대한 우수한 예방 및 치료 활성을 가지는 것을 시사한다.
도 1은 Dynamic Planear Aesthesiometer를 이용하여, 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 골관절염 유발 동물의 행동력에 미치는 영향을 평가한 결과로서, 도 1a 및 도 1b는 각각 paw withdrawal latency (PWL) 및 paw withdrawal threshold (PWT)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 Incapacitance tester를 이용하여 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물을 투여 또는 비투여하였을 때, 양쪽 발에 실리는 무게를 비교하여 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 india ink 염색법으로 연골의 파괴정도를 측정한 결과이다.
도 4는 톨루이딘 블루(toluidine blue), 사프라닌 O(safranin O), H&E 염색법을 이용하여 조직학적으로 연골 및 뼈의 파괴정도를 분석한 결과이다.
도 5는 조직학적 분석 결과로부터 Histology grade 를 계산하여 나타낸 결과이다.

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 80 ∼ 130의 프로시아니돌릭 값(Procyanidolic value, PCV); 30 % 이하의 (+)카테킨 및 (-)에피카테킨의 함량; 및 95 ∼ 105 %의 프로안토시아디딘 함량을 갖는 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 노화, 비만, 또는 외상에 의하여 발생한 골관절염(osteoarthritis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 (a) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 1 : 1 내지 2인 아세톤과 물의 혼합용매로 실온에서 추출하고, 여과하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 여액을 증류하여 아세톤을 제거한 다음, 염화나트륨을 포화시키고, 여과하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축시키는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 농축물에 클로로포름을 가하고, 여과하여 침전물을 얻는 단계를 포함하는 제조방법으로 얻어진 추출물임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨 추출물이 (A) (i) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 아세톤 및 물의 부피비가 3 ∼ 5 : 1인 아세톤과 물의 혼합용매로 추출하고, 여과하는 단계; (ii) 단계(i)에서 얻어진 여액을 농축하여 아세톤을 제거하고, 여과하는 단계; (iii) 단계(ii)에서 얻어진 여액을 에틸 아세테이트로 추출하는 단계; (iv) 단계(iii)에서 얻어진 추출물을 건조하여 제1 추출물을 얻는 단계; (B) (p) 분쇄된 유럽종 포도(Vitis vinifera)의 씨를 물로 추출하고, 여과하는 단계; (q) 단계(p)에서 얻어진 여액을 에탄올로 추출하고, 여과하는 단계; (r) 단계(q)에서 얻어진 여액을 건조하여 제2 추출물을 얻는 단계; 및 (C) 상기 제1 추출물 및 제2 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는 제조방법으로 얻어진 추출물임을 특징으로 하는 약학 조성물.
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